Ứng dụng kỹ thuật digital pcr đánh giá tồn lưu tế bào ác tính trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy tại bệnh viện truyền máu huyết học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - CHÂU THÚY HÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DIGITAL PCR ĐÁNH GIÁ TỒN LƢU TẾ BÀO ÁC TÍNH TRONG BỆNH BẠCH CẦU MẠN DÒNG TỦY TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC LUẬN VĂN BÁC SĨ CHUYÊN KHOA CẤP II THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - CHÂU THÚY HÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DIGITAL PCR ĐÁNH GIÁ TỒN LƢU TẾ BÀO ÁC TÍNH TRONG BỆNH BẠCH CẦU MẠN DỊNG TỦY TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC CHUYÊN NGÀNH: HUYẾT HỌC MÃ SỐ: CK 62 72 25 01 LUẬN VĂN BÁC SĨ CHUYÊN KHOA CẤP II NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS PHAN THỊ XINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nêu luận văn hoàn toàn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Ngƣời làm nghiên cứu Châu Thúy Hà i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC SƠ ĐỒ vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu tổng quát 2 Mục tiêu cụ thể CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Định nghĩa 1.2 Dịch tễ 1.3 Bệnh sinh 1.4 Lâm sàng 1.5 Sinh học 10 1.6 Điều trị 11 1.7 Đánh giá đáp ứng điều trị 15 1.8 Vấn đề ngƣng thuốc TKI 18 1.9 Các kỹ thuật theo dõi tồn lƣu bệnh tối thiểu BCMDT 20 1.10 Tình hình nghiên cứu Việt Nam giới 28 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 i 2.1 Dân số nghiên cứu 29 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.3 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu 38 2.4 Vấn đề y đức 39 CHƢƠNG III KẾT QUẢ 41 3.1 Chuẩn hóa quy trình dPCR 41 3.2 Đặc tính kỹ thuật RQ PCR dPCR 43 3.3 Tỉ lệ đáp ứng SHPT 57 3.4 Mối tƣơng quan kết dPCR với kết RQ PCR 73 CHƢƠNG IV BÀN LUẬN 77 4.1 Chuẩn hóa quy trình dPCR 77 4.2 Đặc tính kỹ thuật RQ PCR dPCR 77 4.3 Tỉ lệ đáp ứng SHPT 84 4.4 Mối tƣơng quan kết dPCR với kết RQ PCR 91 KẾT LUẬN 94 KIẾN NGHỊ 95 LỜI CẢM ƠN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC BẢNG THU THẬP SỐ LIỆU PHỤ LỤC QUI TRÌNH THỰC HIỆN RQ PCR VÀ dPCR v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí điểm gãy ABL BCR Hình 1.2 Con đƣờng dẫn truyền tín hiệu nội bào BCR/ABL Hình 1.3 Sơ đồ đƣờng dẫn truyền hoạt hóa BCR/ABL Hình 1.4 Con đƣờng RAS/PI3K AKT dƣới BCR/ABL Hình 1.5 Multiplex PCR phát BCR/ABL 21 Hình 1.6 Nested PCR phát BCR/ABL 22 Hình 1.7 Phƣơng pháp dPCR tạo giọt 24 Hình 1.8 Kết đọc huỳnh quang dPCR 25 Hình 2.1 Hệ thống máy Realtime PCR 35 Hình 2.2 Máy tạo giọt 35 Hình 2.3 Máy dPCR 36 Hình 2.4 Máy đọc giọt 36 Hình 3.1 Các dạng NST đồ phức tạp NB nghiên cứu 61 Hình 3.2 Các dạng hình ảnh FISH có bất thƣờng kèm theo NB 62 Hình 3.3 Các kiểu tổ hợp BCR/ABL NB nghiên cứu 63 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tiêu chuẩn đáp ứng với điều trị TKI 15 Bảng 1.2 Phân loại đáp ứng phân tử theo tiêu chuẩn IS 17 Bảng 1.3 Tiêu chuẩn ngƣng TKI hƣớng dẫn điều trị 19 Bảng Các biến số nghiên cứu 31 Bảng 3.1 So sánh hiệu số lần trộn pipet 42 Bảng 3.2 Độ lệch chuẩn độ biến thiên cho phép 43 Bảng 3.3 Độ lặp lại kỹ thuật RQ PCR 44 Bảng 3.4 Độ tái lập kỹ thuật RQ PCR 45 Bảng 3.5 Độ lặp lại kỹ thuật dPCR 45 Bảng 3.6 Độ tái lập kỹ thuật dPCR 46 Bảng 3.7 Bảng kết mẫu ngoại kiểm 47 Bảng 3.8 Bảng kết định lƣợng BCR/ABL theo bậc thang nồng độ RQ PCR 50 Bảng 3.9 Bảng kết định lƣợng BCR/ABL theo bậc thang nồng độ dPCR 51 Bảng 3.10 Bảng kết khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu RQ PCR 55 Bảng 3.11 Bảng kết khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu dPCR 56 Bảng 3.12 Bảng kết đặc điểm sinh học lúc chẩn đoán NB 58 i Bảng 3.13 Tỉ lệ NB đạt mức đáp ứng SHPT RQ PCR 67 Bảng 3.14 Tỉ lệ NB đạt mức đáp ứng SHPT dPCR 68 Bảng 3.15 Đặc điểm NB MR3,0 69 Bảng 3.16 So sánh nhóm đạt đáp ứng MR4,0 chƣa đạt MR4,0 thời điểm 24 tháng sau điều trị 71 Bảng 3.16 So sánh nhóm đạt đáp ứng MR4,0 chƣa đạt MR4,0 thời điểm 48 tháng sau điều trị 72 Bảng 3.18 Kết đánh giá đáp ứng SHPT dPCR RQ PCR 74 Bảng 3.19 Khả đánh giá mức đáp ứng SHPT RQ PCR dPCR 76 Bảng 4.1 Độ nhạy dPCR nghiên cứu Maier 84 Bảng 4.2 So sánh đặc điểm sinh học NB nghiên cứu 85 Bảng 4.3 So sánh kiểu tổ hợp BCR/ABL NB nghiên cứu 87 Bảng 4.4 So sánh loại TKI NB nghiên cứu 88 Bảng 4.5 Các yếu tố ảnh hƣởng khả đạt MR4,5 NB nghiên cứu Breccia 90 i DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Sơ đồ so sánh kết ngoại kiểm 48 Sơ đồ 3.2 Tính tuyến tính kết RQ PCR với mức pha lỗng K562 53 Sơ đồ 3.3 Tính tuyến tính kết dPCR với mức pha lỗng K562 54 Sơ đồ 3.4 Phân bố tuổi NB nghiên cứu 57 Sơ đồ 3.5 Phân bố giới tính NB nghiên cứu 58 Sơ đồ 3.6 Khảo sát NST đồ NB lúc chẩn đoán 60 Sơ đồ 3.7 Khảo sát FISH NB lúc chẩn đoán 62 Sơ đồ 3.8 Khảo sát RT PCR NB lúc chẩn đoán 63 Sơ đồ 3.9 Phân bố thời gian điều trị imatinib NB nghiên cứu 64 Sơ đồ 3.10 Phân bố thời gian đạt đáp ứng CHR NB nghiên cứu 65 Sơ đồ 3.11 Phân bố thời gian đạt CCyR NB nghiên cứu 66 Sơ đồ 3.12 Phân bố thời gian đạt MR3,0 NB nghiên cứu 66 Sơ đồ 3.13 Phân bố thời gian đạt MR4,0 NB nghiên cứu 68 Sơ đồ 3.14 Phân bố thời gian đạt MR4,5 NB nghiên cứu 69 Sơ đồ 3.15 Mối tƣơng quan kết BCR-ABL/ABL % (IS) dPCR RQ PCR 73 Sơ đồ 3.16 Số gen ABL NB nghiên cứu 75 Sơ đồ 4.1 Tƣơng quan kết BCR-ABL/ABL % (IS) tỉ lệ K562:HL60 80 ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BCMDT Bạch cầu mạn dòng tủy (chronic myeloid leukemia) BV TMHH Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học CHR Đáp ứng huyết học hoàn toàn (complete hematologic response) CCyR Đáp ứng hoàn toàn di truyền tế bào (Complete Cytogenetic Response) DMR Đáp ứng sâu sinh học phân tử (Deep Molecular Response) dPCR PCR kỹ thuật số (digital PCR) DTTB Di truyền tế bào EFS Sống không kiện (Event free survival) EMR Đáp ứng sớm sinh học phân tử (Early Molecular Response) FISH Lai chỗ phát huỳnh quang (Fluorescence in situ hybridization) IS Thang đo quốc tế (International Score) MCyR Đáp ứng phần lớn di truyền tế bào (Major Cytogenetic Response) mCyR Đáp ứng phần nhỏ di truyền tế bào (minor Cytogenetic Response) MMR Đáp ứng phân tử phần lớn (Major Molecular Response) MR Đáp ứng phân tử (Molecular Response) NB Ngƣời bệnh NCCN Mạng lƣới ung thƣ quốc gia (National Comprehensive Cancer Network) NST Nhiễm sắc thể OS Sống toàn (Overall survival) PCR Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase Chain Reaction) PFS Sống không tiến triển (Progression free survival) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Goh, H.-G., et al (2010),"Monitoring of Dynamics of BCR-ABL Transcripts Over Time Using Digital PCR Assay In CP CML Patients After Achieving Complete Molecular Remission" Blood 116(21): p 1726-1726 Goh, H.-G., et al (2011),"Sensitive quantitation of minimal residual disease in chronic myeloid leukemia using nanofluidic digital polymerase chain reaction assay" Leukemia & Lymphoma 52(5): p 896-904 Giles, F.J., et al (2007),"Nilotinib in Patients (pts) with Philadelphia Chromosome-Positive (Ph+) Chronic Myelogenous Leukemia in Blast Crisis (CML-BC) Who Are Resistant or Intolerant to Imatinib" Blood 110(11): p 1025 Hare, T., et al (2005),"In vitro Activity of Bcr-Abl Inhibitors AMN107 and BMS-354825 against Clinically Relevant Imatinib-Resistant Abl Kinase Domain Mutants" Cancer Research 65(11): p 4500 Hayden, R.T., et al (2013),"Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus" Journal of clinical microbiology 51(2): p 540-546 Hiwase, D., et al (2018),"Efficacy and safety of nilotinib 300 mg twice daily in patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase who are intolerant to prior tyrosine kinase inhibitors: Results from the Phase IIIb ENESTswift study" Leukemia Research 67: p 109-115 Hochhaus, A., et al (2017),"Chronic myeloid leukaemia: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up†" Annals of Oncology 28(suppl_4): p iv41-iv51 Huggett, J.F., S Cowen, and C.A Foy (2015),"Considerations for Digital PCR as an Accurate Molecular Diagnostic Tool" Clinical Chemistry 61(1): p 79 Hughes, A., et al (2017),"CML patients with deep molecular responses to TKI have restored immune effectors and decreased PD-1 and immune suppressors" Blood 129(9): p 1166 Hughes, T.P., et al (2016),"Moving treatment-free remission into mainstream clinical practice in CML" Blood Huntly, B.J.P., et al (2003),"Imatinib improves but may not fully reverse the poor prognosis of patients with CML with derivative chromosome deletions" Blood 102(6): p 2205 Huntly, B.J.P., A Bench, and A.R Green (2003),"Double jeopardy from a single translocation: deletions of the derivative chromosome in chronic myeloid leukemia" Blood 102(4): p 1160 Irino, T., et al (2004),"Establishment of real-time polymerase chain reaction method for quantitative analysis of asparagine synthetase expression" The Journal of molecular diagnostics : JMD 6(3): p 217-224 Jabbour, E., et al (2008),"Targeted therapy in chronic myeloid leukemia" Expert Review of Anticancer Therapy 8(1): p 99-110 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 Jain, P., et al (2012),"Fluorescence in situ hybridization patterns of BCR/ABL1 fusion in chronic myelogenous leukemia at diagnosis" Indian journal of pathology & microbiology 55: p 347-51 Jain, P., et al (2013),"Early responses predict better outcomes in patients with newly diagnosed chronic myeloid leukemia: results with four tyrosine kinase inhibitor modalities" Blood 121(24): p 4867-4874 Jennings, L.J., et al (2014),"Detection and Quantification of BCR-ABL1 Fusion Transcripts by Droplet Digital PCR" The Journal of Molecular Diagnostics 16(2): p 174-179 Johansson, B., T Fioretos, and F Mitelman (2002),"Cytogenetic and molecular genetic evolution of chronic myeloid leukemia" Acta Haematol 107(2): p 76-94 Jones, G.M., et al (2016),"Digital PCR dynamic range is approaching that of real-time quantitative PCR" Biomolecular detection and quantification 10: p 31-33 Kaeda, J., et al (2015),"Droplet Digital PCR Reliably Detects a Single Copy of BCR-ABL1" Blood 126(23): p 2784 Kalmanti, L., et al (2015),"Safety and efficacy of imatinib in CML over a period of 10 years: data from the randomized CML-study IV" Leukemia 29: p 1123 Kantarjian, H., et al (2010),"Phase study of INNO-406, a dual Abl/Lyn kinase inhibitor, in Philadelphia chromosome-positive leukemias after imatinib resistance or intolerance" Cancer 116(11): p 2665-2672 Kantarjian, H.M., et al (2007),"A Phase I Study of INNO-406 in Patients with Advanced Philadelphia (Ph+) Chromosome-Positive Leukemias Who Are Resistant or Intolerant to Imatinib and Second Generation Tyrosine Kinase Inhibitors" Blood 110(11): p 469 Kantarjian, H.M., et al (2007),"Nilotinib (formerly AMN107), a highly selective BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor, is effective in patients with Philadelphia chromosome–positive chronic myelogenous leukemia in chronic phase following imatinib resistance and intolerance" Blood 110(10): p 3540 Kaushansky, K and W.J Williams (2016), Williams hematology Krishna Chandran, R., et al (2019),"Impact of Additional Chromosomal Aberrations on the Disease Progression of Chronic Myelogenous Leukemia" Frontiers in Oncology 9(88) Khoury, H.J., et al (2017),"The safety of Bosutinib for the treatment of chronic myeloid leukemia AU - Kong, Jee Hyun" Expert Opinion on Drug Safety 16(10): p 1203-1209 Laneuville, P (2018),"When to Stop Tyrosine Kinase Inhibitors for the Treatment of Chronic Myeloid Leukemia" Current Treatment Options in Oncology 19(3): p 15 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 Le Coutre, P., et al (2008),"Nilotinib (formerly AMN107), a highly selective BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor, is active in patients with imatinibresistant or -intolerant accelerated-phase chronic myelogenous leukemia" Blood 111(4): p 1834 Lombardo, L.J., et al (2004),"Discovery of N-(2-Chloro-6-methyl- phenyl)2-(6-(4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl)-2-methylpyrimidin-4ylamino)thiazole-5-carboxamide (BMS-354825), a Dual Src/Abl Kinase Inhibitor with Potent Antitumor Activity in Preclinical Assays" Journal of Medicinal Chemistry 47(27): p 6658-6661 Mahon, F.-X and G Etienne (2014),"Deep Molecular Response in Chronic Myeloid Leukemia: The New Goal of Therapy?" Clinical Cancer Research 20(2): p 310 Maier, J., et al (2014),"A Comparison of Droplet Digital PCR and Quantitative RT-PCR for Low Level BCR-ABL in CML Patients with Molecular Responses" Blood 124(21): p 1792-1792 Maier, J., et al (2019),"Optimized Digital Droplet PCR for BCR-ABL" The Journal of Molecular Diagnostics 21(1): p 27-37 Marzocchi, G., et al (2011),"Variant Philadelphia translocations: molecularcytogenetic characterization and prognostic influence on frontline imatinib therapy, a GIMEMA Working Party on CML analysis" Blood 117(25): p 6793-800 McDonald, N.A., et al (2015),"An Accurate and Sensitive RT-qPCR Method That Reliably Detects BCR-ABL1 Beyond MR4.5" Blood 126(23): p 5159-5159 Muller, M.C., et al (2009),"Harmonization of molecular monitoring of CML therapy in Europe" Leukemia 23(11): p 1957-63 Nam, S., et al (2005),"Action of the Src Family Kinase Inhibitor, Dasatinib (BMS-354825), on Human Prostate Cancer Cells" Cancer Research 65(20): p 9185 O'Brien, S.G (2003),"Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic myeloid leukemia" N Eng J Med 348: p 994-1004 O’Dwyer, M.E., et al (2014),"Nilotinib 300mg BID as frontline treatment of CML: Prospective analysis of the Xpert BCR-ABL Monitor system and significance of 3-month molecular response" Leukemia Research 38(3): p 310-315 Ottmann, O., et al (2018), Long-term efficacy and safety of dasatinib in patients with chronic myeloid leukemia in accelerated phase who are resistant to or intolerant of imatinib Vol Pagani, I.S., et al (2018),"BCR-ABL1 genomic DNA PCR response kinetics during first-line imatinib treatment of chronic myeloid leukemia" Haematologica 103(12): p 2026-2032 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 Pavlovsky, C., et al (2018),"Ponatinib in the treatment of chronic myeloid leukemia and philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia" Future Oncology 15(3): p 257-269 Pavšič, J., J Ţel, and M Milavec (2016),"Digital PCR for direct quantification of viruses without DNA extraction" Analytical and Bioanalytical Chemistry 408(1): p 67-75 Puttini, M., et al (2006),"In vitro and In vivo Activity of SKI-606, a Novel Src-Abl Inhibitor, against Imatinib-Resistant Bcr-Abl+ Neoplastic Cells" Cancer Research 66(23): p 11314 Radich, J.P., et al (2018),"Chronic Myeloid Leukemia, Version 1.2019, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology" Journal of the National Comprehensive Cancer Network 16(9): p 1108-1135 Sanders, R., et al (2013),"Evaluation of Digital PCR for Absolute RNA Quantification" PLOS ONE 8(9): p e75296 Sazawal, S., et al (2019),"Distribution of common BCR-ABL fusion transcripts and their impact on treatment response in Imatinib treated CML patients: A study from India" Indian Journal of Pathology and Microbiology 62(2): p 256-260 Scott, S., et al (2017),"Measurement of BCR-ABL1 by RT-qPCR in chronic myeloid leukaemia: findings from an International EQA Programme" Br J Haematol 177(3): p 414-422 Sedlak, R.H., et al (2014),"Identification of Chromosomally Integrated Human Herpesvirus by Droplet Digital PCR" Clinical Chemistry 60(5): p 765 Sedlak, R.H., et al (2017),"Superiority of Digital Reverse TranscriptionPCR (RT-PCR) over Real-Time RT-PCR for Quantitation of Highly Divergent Human Rhinoviruses" Journal of clinical microbiology 55(2): p 442-449 Sedlak, R.H., et al (2014),"Clinical utility of droplet digital PCR for human cytomegalovirus" Journal of clinical microbiology 52(8): p 2844-2848 Sokal, J.E., et al (1988),"Prognostic significance of additional cytogenetic abnormalities at diagnosis of Philadelphia chromosome-positive chronic granulocytic leukemia" Blood 72(1): p 294 Song, H.-Y., et al (2018),"BCR-ABL1 transcript levels at weeks have prognostic significance for time-specific responses and for predicting survival in chronic-phase chronic myeloid leukemia patients treated with various tyrosine kinase inhibitors" Cancer medicine 7(10): p 5107-5117 Švabek Ţ, T., et al (2018),"The incidence of atypical patterns of BCR-ABL1 rearrangement and molecular-cytogenetic response to tyrosine kinase inhibitor therapy in newly diagnosed cases with chronic myeloid leukemia (CML)" Blood Res 53(2): p 152-159 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 Syed, N.N., et al (2008),"Additional chromosomal abnormalities in Philadelphia-positive chronic myeloid leukemia" Hematology/Oncology and Stem Cell Therapy 1(3): p 166-170 Tang, L., et al (2016),"Quantitative Assessment of Commutability for Clinical Viral Load Testing Using a Digital PCR-Based Reference Standard" Journal of clinical microbiology 54(6): p 1616-1623 Tien, S.-L., et al (2005),"High incidence of derivative chromosome arm 9q deletions in Asian chronic myelogenous leukemia" Genes, Chromosomes and Cancer 42(4): p 433-434 Vynck, M., et al (2016),"The Future of Digital Polymerase Chain Reaction in Virology" Molecular Diagnosis & Therapy 20(5): p 437-447 Wang, R., et al (2019),"Predictive value of early molecular response for deep molecular response in chronic phase of chronic myeloid leukemia" Medicine 98(15): p e15222-e15222 Wang, W.-J., et al (2018),"Droplet digital PCR for BCR/ABL(P210) detection of chronic myeloid leukemia: A high sensitive method of the minimal residual disease and disease progression" European Journal of Haematology 101(3): p 291-296 Weisberg, E., et al (2005),"Characterization of AMN107, a selective inhibitor of native and mutant Bcr-Abl" Cancer Cell 7(2): p 129-141 Whale, A.S., et al (2016),"An International Inter-Laboratory Digital PCR Study Demonstrates High Reproducibility for the Measurement of a Rare Sequence Variant" bioRxiv: p 077917 Xinh, P.T., et al (2006),"Coexistence of Philadelphia chromosome positive cells with and without der(9) deletion in a patient with chronic myelogenous leukemia" Cancer Genet Cytogenet 164(2): p 122-7 Yan, Z., Sun, Q., Zhang, H., Han, Y., Qiao, J., Niu, M Xu, K (2019),"Advantages of digital PCR in the detection of low abundance BCRABL1 gene in patients with chronic myeloid leukemia." Oncology Letters 18 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU Số thứ tự: Họ tên NB: Năm sinh: Bệnh nội khoa khác: Ngày bắt đầu điều trị: Ngày CHR: Tác dụng phụ dùng thuốc: a Tăng men gan i Có ,ALT/AST U/L ii Khơng b Giảm tiểu cầu i Có ,TC thấp dùng thuốc ii Không c Khác: Tuân thủ điều trị a Điều trị liên tục, liều 400 mg/ ngày: b Không liên tục giảm liều: , liều , ngày bắt đầu: c Chuyển sang TKI khác: Huyết đồ lúc chẩn đoán: a Hb: g/dL b TC: K c BC: K d Basophil: %/ K e Eosinophil: %/ K 10.Tỉ lệ blast/ tủy đồ lúc chẩn đốn: Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn % Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 11 Kích thƣớc lách/siêu âm lúc chẩn đốn: 12.Thời điểm đạt MMR (tháng sau bắt đầu điều trị TKI): 13 Kết RQ PCR lần so sánh với dPCR: - BCR-ABL/ABL % (IS): - Số chu kỳ ngƣỡng ABL: 14 Kết dPCR: - BCR-ABL/ABL % (IS): - Số ABL: - Số giọt: - MR power: Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC QUI TRÌNH THỰC HIỆN RQ PCR VÀ dPCR Xử lí mẫu  Thêm Red blood cell (RBC: tế bào hồng cầu) lysis buffer vào ống nghiệm Falcon 50 mL chứa mẫu máu cho đủ 50 mL (khoảng 30 mL RBC), trộn Ủ nhiệt độ phòng 10 phút  Ly tâm 1.500 rpm phút nhiệt độ phòng máy ly tâm ống nghiệm 50 ml Hút bỏ dịch máy hút dịch pipette pasteur, thu cặn  Thêm mL RBC lysis buffer vào ống nghiệm chứa cặn tế bào vừa thu đƣợc, trộn hút chuyển toàn sang ống nghiệm 1,5 mL  Ly tâm 10.000 rpm khoảng 15 giây nhiệt độ phòng máy ly tâm ống nghiệm 1,5 mL Hút bỏ dịch dịch nổi, thu cặn tế bào  Thêm mL Phosphate-Buffered Saline (PBS) (pH=7,4) vào ống nghiệm chứa tế bào, trộn  Hút 10 µL huyền phù tế bào cho vào đĩa 96 giếng, tùy lƣợng tế bào thu đƣợc để định pha loãng 1/10, 1/100,… trƣớc trộn với trypan blue theo tỷ lệ 1:1, sau hút 10 µL huyền phù tế bào cho vào buồng đếm Neubauer đậy lamelle, đếm tế bào dƣới kính hiển vi Leica DMIL tính lƣợng tế bào mL  Hút lƣợng thể tích tƣơng đƣơng 5x106 tế bào cho vào ống nghiệm 1,5 mL (khoảng ống nghiệm) phần tế bào lại cho vào ống nghiệm 1,5mL  Ly tâm với tốc độ nhanh khoảng 20 giây để lớp tế bào lắng máy ly tâm lạnh ống nghiệm 1,5 ml Hút bỏ dịch nổi, lấy lớp tế bào lắng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh  Dự trữ Trizol ống nghiệm: Cho 125 µL (0,125 mL) dung dịch PBS vào ống nghiệm chứa tế bào cần dự trữ trizol, trộn micropipet Thêm 375 µL dung dịch Trizol reagent  Dùng ống kim 1cc gắn kim 20G trộn 5-10 lần  Ống nghiệm chứa mẫu đƣợc lƣu trữ Trizol đƣợc lƣu trữ từ 800C  ống nghiệm chứa 5x106 ống nghiệm chứa tất cặn tế bào dƣ lại đƣợc lƣu trữ năm từ -800C ± 200C Li trích RNA  Lấy Trizol stock từ tủ đơng -80oC đặt hộp đựng ống nghiệm 1,5 mL, để nhiệt độ phịng rã đơng 10 phút, trộn mẫu Thêm 100 µL chloroform, trộn máy vortex lắc mạnh tay khoảng 15 giây Để mẫu nhiệt độ phòng phút  Ly tâm 12000 rpm/ phút 15 phút 40C máy ly tâm lạnh tốc độ cao Hút lớp dịch cho vào ống nghiệm 1,5 mL (khoảng 250 µL)  Thêm 250 µL Isopropanol (tỷ lệ 1:1), trộn mẫu Để mẫu nhiệt độ phòng 10 phút  Ly tâm 12000 rpm/ phút 10 phút 40C, hút bỏ dịch  Cho 900 µL ethanol 75% vào ống nghiệm chứa cặn, đảo nhẹ tube, không trộn  Ly tâm 12000 vòng/ phút phút 40C, hút bỏ dịch  Để mẫu khô tự nhiên phút nhiệt độ phòng (mở nắp ống nghiệm)  Thêm 20 – 50 µL nƣớc khử Rnase Diethyl Pyrocarbinate, trộn  Thực tiếp quy trình tổng hợp cDNA, phần RNA cịn lại đƣợc lƣu trữ -780C đến -820C năm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Thực phản ứng Real time-PCR  Pha hỗn hợp phản ứng bao gồm: (5X enzyme mix µL, managanses acetate 0,8 µL, primer mix µL, RNA (mẫu bệnh nhân) µL, Water (RNase/DNase Free) 7,2 µL) x (tƣơng đƣơng test kit) Tƣơng tự, đặt test cho chứng dƣơng test cho chứng âm (tính cho dãy phản ứng, trung bình gồm mẫu)  Phản ứng real time sử dụng dãy ống nghiệm 8-Well Real-Time PCR Strip Tubes 0,2 mL màu trắng để chạy mẫu  Đặt mẫu vào máy bắt đầu chạy chƣơng trình RQ PCR  Sau chạy máy xong, kết đƣợc phân tích file Excel đƣợc cài đặt cơng thức để tính tốn BCR-ABL/ABL % (IS) hãng cung cấp o Qui trình kỹ thuật Digital PCR Tổng hợp cDNA QXDX Kit  Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng RT Master Mix ống nghiệm 0,5 mL đặt khay lạnh với thành phần cho phản ứng nhƣ sau: 2,5 L QXDx 5X iScript Select Reaction Mix + 2,5 L QXDx RT Primers + 1,875 QXDx Rnase Free water + 0,625 L Advanced Reverse Transcriptase  Dùng pipet chia 7,5 L cho phản ứng vào giếng đĩa PCR 96 giếng  Thêm L RNA (mẫu, chứng dƣơng, chứng âm, Calibrator) vào giếng thích hợp Trộn kỹ pipet (10 lần), tránh tạo bọt  Cài đặt PX1 TM PCR Plate Sealer 180o 5s Đặt đĩa PCR khay nhơm nhiệt độ phịng Bọc đĩa PCR Foil Seal suốt Ấn nút Seal để làm nóng đĩa Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh  Lấy đĩa khay khỏi PX1 TM PCR Plate Sealer Spin đĩa 1000 rcf phút để đuổi bọt khí  Mở máy PCR, cho đĩa đƣợc làm nóng đuổi bọt vào máy PCR chạy với chƣơng trình: 250C 10 phút, 420C 45 phút, 850C phút, trì 4oC  Máy chạy xong, lấy đĩa ra, spin đĩa 1000 rcf phút để thu sản phẩm đáy giếng  Đặt cDNA khay lạnh dùng bảo quản 40C 24 Định lƣợng BCR/ABL QXDX KIT  Lấy QXDx QXDx 2X Supermix, QXDx BCR/ABL Primers Probes tủ đông ra, làm tan cách để nhiệt độ phịng 15 phút Trộn hóa chất cần dùng máy vortex ly tâm 1000 rcf 30 giây, đặt khay lạnh  Điền thông tin mẫu cần PCR kỹ thuật số vào phiếu PCR  Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng dPCR Master Mix ống nghiệm 1,5 mL với thành phần cho phản ứng nhƣ sau: 12,5 L QXDx 2X Supermix, 1,25 L QXDx BCR/ABL Primers /Probes + 3,25 L QXDx Rnase Free water Trộn máy vortex, ly tâm nhẹ máy spindown  Chia 17 L cho phản ứng vào giếng đĩa ddPCR  Dùng pipet kênh chọc qua Foil Seal đĩa cDNA, hút L cDNA (mẫu, chứng, calibrator hay buffer) cho vào giếng tƣơng ứng đĩa dPCR Sau hút cDNA hồn tất, trộn giếng pipet 15 lần, tránh tạo bọt  Các giếng lại dãy cần đƣợc bổ 25 L dPCR control buffer Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh  Cài đặt PX1 TM PCR Plate Sealer 180o 5s Đặt đĩa PCR khay nhôm nhiệt độ phòng Bọc đĩa PCR Foil Seal suốt Ấn nút Seal để làm nóng đĩa  Lấy đĩa khay khỏi PX1 TM PCR Plate Sealer Spin đĩa 1000 rcf 30 giây để đuổi bọt khí TẠO GIỌT BẰNG TAY  Đặt DG8 Cartridges vào Cartridge holder với dấu khắc chữ V DG8 Cartridges bên trái Cartridge holder  Mở Cartridge holder cách nhấn vào nút  Trƣợt DG8 Cartridge sang bên phải Cartridge holder  Ấn xuống có tiếng tách  Dùng pipet kênh chuyển 20 µL mẫu chuẩn bị sang giếng mẫu DG8 Cartridges (Hàng giữa, ý khơng tạo bọt khí)  Đổ dầu tạo giọt vào khay hóa chất với thể tích tƣơng ứng với số giếng mẫu nhƣ Bảng Bảng Thể tích dầu tương ứng với số giếng mẫu Số giếng mẫu Thể tích dầu 700 µL 24 1820 µL 48 3500 µL 96 6860 µL  Dùng pipet kênh hút 70 µL dầu vào giếng dầu DG8 Cartridge (Hàng dƣới) nhƣ Hình Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình DG8 Cartridge  Dùng miếng đệm phủ lấy Cartridge Holder (Móc cẩn thận miếng đệm vào khóa bên) nhƣ Hình Hình Cartridge Holder  Mở máy QX 200 Droplet Generator, nhấn nút nắp xanh đặt Cartridge Holder vào, đặt đèn thị chuyển xanh (Hình 3) Hình Máy QX 200 Droplet Generator Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh  Nhấn nút để đóng nắp Đèn thị nhấp nháy xanh sau 10 giây, trình tạo giọt hoạt động  Khi trình tạo giọt hoàn tất, tất đèn thị nút xanh đậm Ấn nút mở cửa, lấy Cartridge Holder Bỏ miếng đệm, giếng hàng chứa giọt dầu CHUẨN BỊ PHẢN ỨNG PCR  Dùng pipet chuyển giọt dầu sang đĩa 96 giếng  Bọc đĩa Foil Seal  Cài đặt PX1 TM PCR Plate Sealer 180o 5s Đặt đĩa PCR khay nhơm nhiệt độ phịng Bọc đĩa PCR Foil Seal suốt Ấn nút Seal để làm nóng đĩa  Lấy đĩa khay khỏi PX1 TM PCR Plate Sealer Spin đĩa 1000 rcf 30 giây để đuổi bọt khí  Mở máy PCR, cho đĩa đƣợc làm nóng đuổi bọt vào máy PCR chạy với chƣơng trình nhƣ Bảng Bảng Chương trình chạy PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian Hoạt hóa Enzym 95 10 phút Biến tính 94 30 giây 60 phút 94 30 giây 64 phút Bắt cặp/Kéo dài Biến tính 35 Bắt cặp/Kéo dài Bất hoạt Enzym 95 10 phút Ổn định giọt 30 phút Giữ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh  Mở phần mềm QuantaSoft máy tính kết nối máy đọc giọt (Droplet Reading), nhập thông tin mẫu, đặt đĩa sản phẩm sau PCR vào, ấn nút Run  Khi q trình đọc giọt hồn tất, tiến hành phân tích số liệu  Vệ sinh máy Ethanol 70o Biện luận diễn giải kết  Kết thu đƣợc tỉ số BCR-ABL/ABL copies (Ratio) % IS MR đƣợc tính theo cơng thức:  % IS = Ratio x 100 x CF (CF đƣợc in kit)  MR = log10(100%IS) – log10 (%IS) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn