Thu nhận và tinh sạch papain trong đu đủ

Thu nhận và tinh sạch papain trong đu đủ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG CAO ĐẲNG KINH TẾ - CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Enzyme papain từ quả đu đủ

Giáo Viên Hướng dẫn: Th.S Lê Thanh Hải Lớp: C6SH1

Sinh viên thực hiện: Huỳnh Lượm

Phạm Thị Minh Quách Lê Minh Ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Chung Thuận Nguyên

TP HCM , Tháng 10 Năm 2012

LỜI CẢM ƠN

Chúng tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Cao Đẳng Kinh tế - Công nghệ TP.Hồ Chí Minh và các thầy cô đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt những kiến thức bổ ích để chúng tôi có được đầy đủ kiến thức để hoàn thành tốt bài tiểu luận này

Và cũng xin chân thành cảm ơn cô Lê Thanh Hải giáo viên giảng dạy bộ môn công nghệ protein- enzyme đã truyền đạt kiến thức và giúp chúng em hoàn thành bài tiểu luận này

Vô cùng biết ơn người thân và bạn bè đã hỗ trợ giúp chúng tôi hoàn thành tốt bài tiểu luận này

Trong quá trình thực hiện làm bài tiểu luận sẽ không tránh khỏi thiếu sót Kính xin quý thầy cô và bạn bè đóng góp ý kiến để bài tiểu luận được hoàn chỉnh hơn

MỤC LỤC

PHẦN I : LỜI MỞ ĐẦU 3

PHẦN II : GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 4

2.1 Giới thiệu về cây đu đủ 4

2.1.1 Giới thiệu 4

2.1.2 Phân bố sinh thái của cây đu đủ 5

2.1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 5

2.2 Giới thiệu về enzyme papain 5

2.2.1 Cysteine protease 5

2.2.2 Nguồn gốc 5

2.2.3 Tính chất của papain 5

2.2.3.1 Tính chất vật lý 6

2.2.3.2 Tính chất hóa học 7

2.2.3.2.1 Cấu tạo hóa học 7

2.2.3.2.2 Cấu trúc không gian 8

2.2.3.2.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain 9

2.2.3.2.4 Phản ứng của papain 11

2.2.3.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain 13

PHẦN III : PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN 14

3.1 Phương pháp thu nhận papain 14

3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ 14

3.1.2 Thu nhận papain 14

3.2 Phương pháp tinh sạch papain 15

3.2.1 Điện di 15

3.2.2 Lọc qua Sephadex G-75 15

PHẦN IV : ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 17

4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng 17

4.1.1 Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân 17

4.1.1.1 Nguyên lý chung: 17

4.1.1.2 Thuyết minh quy trình chung: 18

4.1.2 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân 18

4.1.3 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân 19

4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành 19

4.1.5 Phương pháp xác định hoạt tính 20

4.1.5.1 Cơ chất: 20

4.1.5.2 Điều kiện: 20

4.1.5.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme: 20

4.1.5.3.1 Khái quát 20

4.1.5.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính của papain 21

4.2 Một số ứng dụng của enzyme papain 25

4.2.1 Trong y học 25

4.2.2 Trong công nghiệp thực phẩm: 25

4.2.3 Trong các ngành công nghiệp khác: 26

PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28

5.1 Kết luận

5.2 Kiến nghị

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN I : LỜI MỞ ĐẦU

Trong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao gồm: papain, chymopapain và peptidase Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh Ngoài

ra, papain còn là một loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ Enzym papain rất tốt cho hệ tiêu hóa, giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn Nó có thể giúp phân giải và loại bỏ những lớp da chết trên bề mặt cơ thể Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổi các chất có albumin thành pepton, có tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môi trường hơi kiềm hay trung tính

Ở nhiệt độ thường khi cho tiếp xúc papain với lòng trắng trứng thì lòng trắng trứng bị mất tính sánh sền sệt Trung bình một trái đu đủ cho được 12g mủ, từ 4kg

mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ hiệu quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên Với những lợi ích và giá trị mà enzyme papain đem lại , nó được ứng dụng rộng rãi và thường được dùng trong lĩnh vực chế biến mỹ phẩm Ngoài ra, Papain rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dược phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm

Vì tầm quan trọng của enzyme papain trong nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tôi thực hiện đề tài: Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi

PHẦN II : GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 2.1 Giới thiệu về cây đu đủ

2.1.1 Giới thiệu

Hình: Các loại hoa và trái đu đủ

Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac

Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái) Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ

2.1.2 Phân bố sinh thái của cây đu đủ.

Chi Carica L có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài C peltata Hook & Ann Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á

Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi

2.1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ

1 Nhựa đu đủ có thể gây viêm da

2 Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵamip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe gan

3 Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng

4 Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung

Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không

hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó

5 Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu

6 Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm) Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibioticactivity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive

bacteria) Nó còn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa Trong công nghiệp, papain được dùng để tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain.

2.2 Giới thiệu về enzyme papain

2.2.1 Cysteine protease

- Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, esterthiol Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động

- Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp

- Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases ( bromelain, ficain, cathepsin…) Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide

2.2.2 Nguồn gốc

Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya) Đây cũng

là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis

et al., 1894) Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979) Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm

2.2.3 Tính chất của papain

2.2.3.1 Tính chất vật lý

Bảng 2.1: Tính chất vật lý của papain

Tính chất vật lý Giá trị

2.2.3.2.1 Cấu tạo hóa học:

Papain là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S Papain là 1 protease thiol, theo nghiên cứu của R L Hill và E L Smith, papain là 1 chuỗi polypeptide gồm

185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton

Bảng 2.2: Thành phần hóa học:

Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng

vị trí 25.

2.2.3.2.2 Cấu trúc không gian

Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử

Hình: Cấu trúc bậc 3 của Papain

Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159 Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất Khi

cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt

độ thích hợp là 50 – 570C

2.2.3.2.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain

- Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc

3 của histidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen

- Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là:

Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys

- Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau

Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys

Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser

 Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng:

- Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

- Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid:

(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH  (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N- CH(R)-CO-)k

i+k=n

- Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid

(H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH  (H2N-CH(R)-COOH)n` + CH(R)-CO-)k

(H2N-n`+k = n

- So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxy tự do Papain có thể nhận biết 1 chuỗi gồm 7 amino aicd trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên 1 chuỗi có phenylamine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papainsex cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y ( có Phe nằm ở vị trí thứ 2 trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain

- Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và trafnerase

 Hoạt hóa papain:

Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự

do Vì vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là chất hay dùng nhất hki có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ

 Bất hoạt:

- Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó

- Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp papain tác dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ ( độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-8m)

2.2.3.2.4 Phản ứng của papain

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

2.2.3.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain

Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng

nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 1000C Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.50C và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>1000C) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch

Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 1000C thì cấu trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain

Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt

độ thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 370C Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 1150C trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%.

pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng

lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12 Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất

mà pH tối ưu sẽ khác nhau Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5 Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được

ổn định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút

Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là

methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50% Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch

về độ quay quang học và hoạt tính của papain

PHẦN III : PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN

3.1 Phương pháp thu nhận papain

Sơ đồ quy trình công nghệ:

200-300m dd cysteine 0.04M