Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất từ cây trinh nữ hoàng cung ( crinum latufolium l amryllidaceace ) để sản xuất viên nang điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt

Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid từ dược liệu lá Trinh nữ hoàng cung tươi và khô dùng làm nguyên liệu sản xuất viên nang Trinh nữ hoàng cung Crila ở quy mô cơng nghiệp.

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2

BÁO CÁO TỔNG KẾT

DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CẤP NHÀ NƯỚC

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT HOẠT

CHẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L

Amaryllidaceace) ĐỂ SẢN XUẤT VIÊN NANG ĐIỀU TRỊ BỆNH

PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT

MÃ SỐ: KC.10.DA17

Chủ nhiệm dự án: TS NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM

6613

26/10/2007

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2

BÁO CÁO TỔNG KẾT

DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CẤP NHÀ NƯỚC

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT HOẠT

CHẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L

Amaryllidaceace) ĐỂ SẢN XUẤT VIÊN NANG ĐIỀU TRỊ BỆNH

PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT

MÃ SỐ: KC.10.DA17

CHỦ NHIỆM DỰ ÁN: TS NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: CÔNG TY CỔ PHẦN DƯỢC LIỆU TW2

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

THỜI GIAN: 1.2006 - 6.2007 TỔNG KINH PHÍ DỰ ÁN: 4.934,3 triệu đồng KINH PHÍ TỪ NGÂN SÁCH: 1.300 triệu đồng KINH PHÍ THU HỒI: 835 triệu đồng

TP.HCM, tháng 09 năm 2007

MỤC LỤC

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 7

PHẦN II: TỔNG QUAN 13

1 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về cây Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.)… 13

2 Tính cấp thiết và khả thi của dự án 17

3 Mục tiêu dự án 17

4 Nội dung dự án 18

PHẦN III: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

1 Nguyên liệu… 19

2 Phương pháp nghiên cứu… 19

PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU… 22

1 Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid từ dược liệu lá Trinh nữ hoàng cung (tươi và khô) dùng làm nguyên liệu sản xuất viên nang Trinh nữ hoàng cung (Crila) ở quy mô cơng nghiệp 22

1.1 Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất alcaloid trong lá cây Trinh nữ hồng cung 23

1.1.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết alcaloid tồn phần từ dược liệu khơ TNHC 23

1.1.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết alcaloid tồn phần từ dược liệu tươi TNHC 25

1.2 Máy mĩc thiết bị và quy trình cơng nghệ chiết xuất 27

1.3 Vệ sinh vơ trùng và an tồn lao động 30

1.4 Nội dung kiểm tra trong quá trình sản xuất 30

1.5 Xử lý dư phẩm của quá trình chiết xuất 30

1.6 Hồ sơ làm việc cần thiết 30

2 Hoàn thiện quy trình sản xuất viên nang từ bán thành phẩm của Trinh nữ hoàng cung 31

2.1 Cơng thức viên nang Crila 31

2.2 Một số kết quả nghiên cứu về bào chế viên nang… 32

2.2.1 Độ ẩm tới hạn và độ ẩm cân bằng của hạt 32

2.2.2 Dải phân bố cỡ hạt 34

2.2.3 Tính chảy của hạt 34

2.2.4 Tính phân tán trong nước 35

2.4 Nghiên cứu theo dõi độ ổn định của sản phẩm 37

2.5 Quy trình sản xuất viên nang CRILA 39

2.5.1 Cách tiến hành 39

2.5.2 Máy móc thiết bị chủ yếu 39

2.5.3 Quy trình công nghệ sản xuất viên nang Crila 40

2.5.4 Vệ sinh vô trùng và an toàn lao động 41

2.5.5 Nội dung kiểm tra trong quá trình sản xuất 41

2.5.6 Dư phẩm phế phẩm 42

2.6 Hồ sơ làm việc cần thiết 42

3 Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm 43

3.1 Nghiên cứu định tính và định lượng alcaloid crinamidin trong nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm bằng phương pháp HPLC… 43

3.2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở lá TNHC, cao khô TNHC và viên nang Crila 52

PHẦN V: KẾT QUẢ VÀ ỨNG DỤNG CỦA DỰ ÁN 69

PHẦN VI: BÀN LUẬN 72

PHẦN VII: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73

PHẦN VIII: TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHẦN IX: CÁC PHỤ LỤC 79

KÝ HIỆU VÀ Ý NGHĨA CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TNHC Trinh Nữ Hoàng Cung Crinum latifolium L

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng

cao High Performance Liquid Chromatography SKLM: Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

S: Độ lệch chuẩn Standard Deviation

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối Relative Standard Deviation

LOD: Giới hạn phát hiện Detection Limit

LOQ: Giới hạn định lượng Quantitation Limit

UV-VIS Tử ngoại – khả kiến Ultra Violet (Spectroscopy)

IR: Hồng ngoại Infrared Spectroscopy

NMR: Cộng hưởng từ hạt nhân Proton nuclear Magnetic Resonance MS: Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ

VỀ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN VÀ NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI

CỦA DỰ ÁN KH&CN CẤP NHÀ NƯỚC

1 Tên đề tài:

Hồn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất hoạt chất từ cây TNHC (Crinum

latifolium L.) để sản xuất viên nang điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt

Mã số: KC.10.DA17

2 Thuộc chương trình Khoa Học Cơng Nghệ trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn

2001-2005 “Khoa học và cơng nghệ phục vụ chăm sĩc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng”

3 Chủ nhiệm dự án: TS NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM

4 Cơ quan chủ trì dự án: CƠNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2

5 Thời gian thực hiện: 18 tháng (từ tháng 1 năm 2006 đến tháng 6 năm 2007)

6 Tổng kinh phí thực hiện dự án: 4.934,3 triệu đồng

Trong đĩ: kinh phí từ NSNN: 1.300 triệu đồng (bằng chữ: một ngàn ba trăm triệu

đồng)

Kinh phí thu hồi: 835 triệu đồng

7 Tình hình thực hiện dự án so với hợp đồng

7.1 Về mức độ hồn thành khối lượng cơng việc

Hồn thành 3 mục tiêu của dự án:

- Hồn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất hoạt chất alcaloid từ dược liệu TNHC ở quy mơ cơng nghiệp

- Hồn thiện quy trình sản xuất viên nang từ bán thành phẩm của TNHC

- Nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm định lượng Crinamidin bằng phương pháp HPLC

Hồn thành 5 nội dung của dự án:

- Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid từ dược liệu lá TNHC (lá TNHC tươi và lá TNHC khô) dùng làm nguyên liệu sản xuất viên nang Trinh nữ hoàng cung (CRILA) ở quy mô cơng nghiệp

- Hoàn thiện quy trình sản xuất viên nang từ bán thành phẩm của TNHC Nghiên cứu ổn định thuốc từ 24 tháng lên 36 tháng

- Nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm Tạo chất chuẩn tinh khiết crinamidin – định lượng bằng phương pháp HPLC

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của lá TNHC, cao khô TNHC, thuốc thành phẩm và thẩm định lại thuốc đã xây dựng

- Sản xuất 10.098.000 viên thuốc Crila

7.2 Về yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN

- Sản phẩm của dự án là Viên nang Trinh nữ hoàng cung (CRILA) là một viên thuốc mới, đạt tiêu chuẩn cơ sở có tác dụng điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt, giá thành hợp lý, hiệu quả điều trị cao

- Sản phẩm được chế tạo từ hai quy trình công nghệ về chiết xuất và bào chế

đã được hoàn thiện và nâng cấp

- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên thuốc mới bằng phương pháp HPLC Tạo chất chuẩn tinh khiết crinamidin

7.3 Về tiến độ thực hiện

- Đảm bảo đúng tiến độ của đề cương và hợp đồng khoa học công nghệ số 11/2006/HĐ-DA, ngày 28/12/2006

- Nghiệm thu cấp cơ sở đúng quy định của Bộ Khoa học Công nghệ

8 Về những đóng góp mới của đề tài:

Dự án đã hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất các hoạt chất có hoạt tính sinh học có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u Sản phẩm của dự án là viên nang CRILA được bào chế từ nguyên liệu chiết xuất từ dược thảo cây TNHC

(Crinum latifolium L.) Hiện nay, đã có hai viên thuốc là viên nang mềm

Tadenan được bào chế từ vỏ cây Mận Gai Châu Phi có tên khoa học là Pygeum

africanum và Permixon từ quả cây Serenoa repens của Pháp sản xuất, và viên

Crila là viên thuốc thứ ba sau hai viên thuốc trên được xếp vào kho tàng thuốc điều trị tuyến tiền liệt Viên CRILA còn có khả năng chữa trị bệnh u xơ tử cung

và cũng là viên thuốc đầu tiên chữa u xơ tử cung được sản xuất từ dược thảo Cho đến nay chưa có một viên thuốc nào chữa u xơ tử cung được sản xuất từ nguồn gốc thiên nhiên Viên CRILA ra đời sẽ cung cấp đủ thuốc phục vụ sức khỏe người bệnh trong nước và xuất khẩu

.Về giải pháp khoa học – công nghệ

Đã hoàn thiện một quy trình công nghệ, tạo được nguyên liệu để sản xuất thuốc điều trị các bệnh khối u từ dược thảo Việt Nam bằng những thiết bị máy móc sản xuất trong nước và được thiết kế theo yêu cầu của quy trình công nghệ cần tạo ra sản phẩm là các alcaloid có hoạt tính sinh học

.Về phương pháp nghiên cứu

Sử dụng các phương pháp nghiên cứu cổ điển và kết hợp với các phương pháp

- Chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt

- Các phương pháp hóa lý: Phổ hồng ngoại, khối phổ, cộng hưởng từ hạt nhân

Chúng tôi đã giải quyết được vấn đề giá thành sản phẩm hợp lý do hoàn thiện quy trình chiết xuất nguyên liệu từ lá tươi, khâu xử lý nguyên liệu tươi đúng theo quy trình kỹ thuật đã phá vỡ màng nguyên sinh của tế bào rồi chiết với dung môi thích hợp

Tiết kiệm chi phí điều trị bệnh so với sử dụng thuốc ngoại nhập để điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt

Tạo công ăn việc làm cho người lao động Tạo sản phẩm thuốc đi từ nguồn dược liệu trong nước phục vụ sức khỏe cộng đồng

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt là một căn bệnh phổ biến trong và ngoài nước Thuốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt là gánh nặng đối với bệnh nhân và gia đình họ, do chi phí điều trị cao Theo kết quả nghiên cứu hơn 30% nam giới ở lứa tuổi 40 trở lên đều mắc phải căn bệnh này Tình trạng sức khỏe người bệnh giảm sút do phải đi tiểu nhiều lần trong đêm, ảnh hưởng đến sinh hoạt và làm việc Do đó nhu cầu về thuốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt ngày càng trở nên cấp thiết Để đáp ứng nhu cầu về thuốc chữa bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt, Cơng ty Cổ phần Dược Liệu TW2 đã được Bộ

Y Tế cho phép thực hiện nghiên cứu hai đề tài sau:

Đề tài 1: Nghiên cứu hồn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất alcaloid tồn phần từ lá cây Trinh Nữ Hồng Cung (Crinum latifolium L.) dùng làm nguyên

liệu sản xuất thuốc điều trị bệnh u xơ tuyến tiền liệt, u xơ tử cung Do

TS.Nguyễn Thị Ngọc Trâm làm chủ nhiệm đề tài Kết quả nghiệm thu đạt loại khá với các nội dung đã nghiên cứu sau:

1 Nghiên cứu trồng cây Trinh nữ hồng cung làm nguyên liệu cho nghiên cứu

và sản xuất

- Chọn được giống cây Trinh nữ hồng cung đúng về mặt hình thái thực vật và

cĩ hiệu suất trồng cao

- Xác định được kỹ thuật trồng

- Sơ bộ đánh giá được ảnh hưởng của các yếu tố khí hậu, thổ nhưỡng lên năng suất thu hoạch

- Xác định được thời điểm thu hoạch lá cho năng suất cao

2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu lá Trinh Nữ Hồng Cung

- Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở hồn chỉnh cho nguyên liệu Trinh Nữ Hồng Cung

- Kiểm nghiệm nguyên liệu thu hoạch theo tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng

3 Nghiên cứu sơ bộ thực vật, hĩa học và chiết xuất

- Đã nghiên cứu, khảo sát về mặt hình thái thực vật, vi phẫu và soi bột lá Trinh

Nữ Hồng Cung để xác định tính xác thực khi xây dựng tiêu chuẩn và kiểm nghiệm nguyên liệu

- Xây dựng các phương pháp định tính, định lượng alcaloid tồn phần tính theo lycorine để phục vụ nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn, nghiên cứu chiết xuất và làm cơ sở để đánh giá hiệu suất quy trình chiết suất

- Chiết thăm dị dược liệu bằng các dung mơi khác nhau: dung mơi cĩ tính phân cực yếu cloroform; dung mơi khơng phân cực ether dầu hỏa; dung mơi phân cực mạnh cồn/acid, nước acid, chiết xuất với các độ cồn 96o, 70o, 50o, thử tác dụng sinh học của dịch chiết từ đĩ chọn được phương pháp chiết xuất

và dung môi thích hợp cho nghiên cứu quy trình chiết: Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt, cồn 70o + 2% acid tartric, tỉ lệ dung môi dược liệu 9:1

- Xây dựng được quy trình chiết tối ưu cho hiệu suất xấp xỉ 100% tính theo alcaloid toàn phần

4 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chiết

- Đã tiến hành chiết thử ở quy mô pilot: 5kg/mẻ để hoàn thiện quy trình đã xây dựng Kết quả cho thấy quy trình khá ổn định, hiệu suất quy trình tính trên lượng alcaloid toàn phần có trong cao khô đạt trung bình: 73,12 ± 7,78%

- Tiêu chuẩn hóa được sản phẩm cao khô

5 Khảo sát thăm dò dạng chế phẩm viên nang cứng

- Đã khảo sát thử công thức và quy trình sản xuất viên nang TNHC (Crila) từ cao khô TNHC là sản phẩm của quy trình chiết xuất với liều lượng 1 viên nang tương đương 1g dược liệu khô

6 Dự kiến quy trình và thiết bị chiết xuất TNHC

- Trên cơ sở quy trình chiết xuất đã xây dựng được, chúng tôi đã dự kiến một quy trình và dây chuyền thiết bị thích hợp cho triển khai sản xuất ở quy mô lớn làm cơ sở cho việc chuẩn bị đầu tư sản xuất

Sơ đồ 1: Sơ đồ tĩm tắt quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid

từ lá khơ TNHC ở quy mơ pilot

Đề tài 2: “Nghiên cứu bào chế viên nang cứng từ cao khô alcaloid toàn phần của cây TNHC (Crinum latifolium L.) và thử tác dụng sinh dược học trong điều

trị u xơ tuyến tiền liệt” do TS Nguyễn Thị Ngọc Trâm làm chủ nhiệm đề tài Theo

quyết định số 2173/QD9-BYT, ngày 6/6/2002 của Bộ Y Tế Kết quả nghiệm thu đạt loại khá với các nội dung nghiên cứu đã hoàn thành:

1 Nghiên cứu tác dụng dược lý của chế phẩm và thử độc tính Công việc đầu tiên chúng tôi thực hiện được là thử độc tính cấp của cao khô (cao khô là nguyên liệu để sản xuất viên nang TNHC dùng cho thử nghiệm lâm sàng điều trị bệnh u xơ tuyến tiền liệt tại Bệnh Viện Y Học Cổ Truyền Việt Nam): Xác định LD50 theo phương pháp Karber – Behrens, kết quả đã xác định được liều gây chết 50% súc vật thử nghiệm LD50 = 49,7g cao khô Trinh Nữ Hoàng Cung /kg thể trọng chuột Để tăng thêm độ an toàn cho người bệnh, chúng tôi tiếp tục thử độc tính bất thường và kết quả tình trạng chuột sau khi uống thuốc và sau 48 giờ theo dõi khỏe mạnh, nhanh nhẹn, ăn bình thường Độc tính bán trường diễn: Kết quả thử nghiệm khi cho thỏ uống liều 125mg/kg/ngày thời gian là 8 tuần không có biểu hiện nhiễm độc về mặt sinh hóa, huyết học và giải phẫu Liều thứ hai là liều cao trên 1kg thể trọng là 1000mg/ngày

Với 2 liều thử nghiệm trên Khi xét nghiệm các chỉ tiêu huyết học, sinh hóa, điện di protein huyết thanh, chỉ tiêu thể trạng thấy kết quả không làm thay đổi lớn các chỉ tiêu trên, điều đó chứng tỏ có thể sử dụng viên nang Trinh Nữ Hoàng Cung để điều trị u xơ tuyến tiền liệt với liều thử lâm sàng là 8 viên x

250 mg cao khô TNHC/ngày/người Từ kết quả nghiên cứu độc tính và dược

lý Chúng tôi có thể nâng liều điều trị lên từ 10 – 12 viên/ngày/người

Nghiên cứu tác dụng dược lý của viên nang TNHC đối với u xơ tuyến tiền liệt bằng phương pháp dùng testosterone, kết quả viên nang Trinh nữ hoàng cung với liều 1,25g cao khô TNHC tương đương với 5 viên TNHC/kg, uống trong 7 ngày liên tục Có tác dụng làm giảm u xơ tuyến tiền liệt

2 Xây dựng công thức, quy trình sản xuất và tiêu chuẩn cơ sở của viên nang TNHC Chúng tôi đã tìm được một công thức tối ưu với lượng hoạt chất có tác dụng sinh học ức chế sự phát triển và làm giảm khối u dùng để điều trị u

xơ tuyến tiền liệt có kết quả

3 Đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho viên nang TNHC

4 Để có được những thông tin chính xác về điều kiện bảo quản thuốc và hạn dùng trong quá trình lưu hành trên thị trường Chúng tôi đã nghiên cứu độ ổn định thuốc theo 2 phương pháp: Lão hóa cấp tốc để dự đoán tuổi thọ của thuốc, theo dõi bảo quản thuốc ở điều kiện tự nhiên Kết quả nghiên cứu cho thấy viên nang TNHC có tuổi thọ là 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc và 24 tháng ở điều kiện tự nhiên nhiệt độ phòng 30o ± 5oC, độ ẩm tương đối 70 ± 5%

5 Đánh giá kết quả lâm sàng: ở giai đoạn 1 và 2

- Giai đoạn 1: Với nhĩm 10 người khỏe mạnh dùng thuốc, sau một đợt điều trị

10 ngày với liều 8 viên/ 1 ngày bệnh nhân ăn, ngủ tốt, mạch và huyết áp trong giới hạn bình thường Các xét nghiệm sinh hĩa máu và nước tiểu trước

và sau điều trị đều trong mức giới hạn bình thường và các chỉ số chức năng gan, thận trước và sau điều trị khơng cĩ sự sai khác Viên nang TNHC an tồn trong điều trị

- Giai đoạn 2: đã đánh giá được hiệu lực của thuốc trên lâm sàng, phạm vi dùng thuốc là 30 bệnh nhân với liều 8 viên / 1 ngày Viên nang TNHC cĩ tác dụng cải thiện mức độ rối loạn tiểu tiện trên bệnh nhân cĩ u phì đại lành tính tuyến tiền liệt, trung bình giảm từ 93,3% xuống cịn 33,3% Viên nang TNHC cĩ tác dụng làm giảm thể tích u phì đại lành tính tuyến tiền liệt, tỉ lệ bệnh nhân cĩ kích thước giảm đạt 90% trong đĩ cĩ 33,3% kích thước tuyến trở về bình thường sau 2 tháng điều trị Viên nang TNHC khơng làm biến đổi các xét nghiệm sinh hĩa máu (SGOT, SGPT, creatinin), huyết học (tổng phân tích máu và xét nghiệm nước tiểu) Viên nang TNHC khơng gây tác dụng phụ khơng mong muốn cho bệnh nhân trong nhĩm nghiên cứu sau 2 tháng điều trị

Với quan điểm kế thừa và phát huy y học cổ truyền, kết hợp với y học hiện đại công ty chúng tôi đã sản xuất viên nang TNHC, có tên thương mại CRILA, để điều trị căn bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt

Đây là thuốc được bào chế từ thảo dược ít tác dụng phụ, chưa từng được sản xuất trong nước và trên thế giới Viên nang được bào chế từ nguồn dược liệu sạch trong nước với đa số các thiết bị do Việt Nam sản xuất, nên giá thành hợp lý Trong khi các chi phí cho điều trị nội-ngoại khoa đòi hỏi quá cao và giá thuốc nhập ngoại lại quá đắt, không phù hợp với đa số người bệnh

Viên nang CRILA ra đời sẽ đáp ứng được nhu cầu của thị trường trong và ngoài nước Ngoài ra còn giải quyết công ăn việc làm cho người lao động

Viên nang TNHC (CRILA) đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III theo quy chế

371 – Bộ Y Tế tại 3 bệnh viện: Bệnh Viện Y Học Cổ Truyền Trung Ương, Viện Lão Khoa TW, Bệnh viện Y Học Cổ Truyền TP.HCM, kết quả điều trị đạt 89,18% bệnh nhân khỏi bệnh và đã được Hội đồng Khoa Học Bộ Y Tế xác nhận Ngày 21/7/2005 Cục Quản Lý Dược – Bộ Y Tế đã cĩ quyết định số 135/QĐ-QLD cho phép viên nang TNHC (CRILA) được lưu hành rộng rãi trên tồn quốc với số đăng

ký VNB – 3391- 05

Để tạo điều kiện cho sản phẩm viên nang TNHC (CRILA) được phát triển phục vụ tốt sức khỏe cộng đồng ngày 14/3/2005, Bộ Khoa Học và Cơng Nghệ đã ban hành

dự án sản xuất thử nghiệm KC.10.DA17: “Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết

xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) để sản xuất

viên nang điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt”

PHẦN II: TỔNG QUAN

1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC VỀ CÂY TNHC

(Crinum latifolium L.)

Từ năm 1984 cho đến nay các công trình nghiên cứu về thành phần hoá học và

tác dụng dược lý của Crinum latifolium cũng đã được công bố trên các tạp chí

trong và ngoài nước

1.1 Ngồi nước

* Thành phần hoá học

- Năm 1984, Ghosal (Ấn Độ) đã phân lập và xác định từ cán hoa Crinum

latifolium một glucoalcaloid có tên latisolin Thủy phân bằng enzym thu

được aglycon có tên latisodin [23]

- Ghosal và Shibnath còn phân lập được từ thân hành lúc cây đang ra hoa pratorimin và pratosin là 2 alcaloid pyrolophenanthrindon mới cùng với những chất đã được biết như pratorimin, ambelin và lycorin [24]

- Năm 1986, Ghosal còn công bố tách được từ Crinum latifolium L một số

dẫn xuất alcaloid có tác dụng chống ung thư: Crinafolin và Crinafolidin Các chất này đã được thử nghiệm với tế bào và cho kết quả dương tính [25]

- Năm 1989, Ghosal còn chiết từ dịch ép của cán hoa Trinh nữ hoàng cung 2 alcaloid mới có nhân pyrrolophennanthaidin là 2-epilycorin và 2-epipancrassidin [26]

- Một số nhà khoa học Nhật Bản cũng tìm thấy một số ít alcaloid khác từ cây

Crinum latifolium như: crinamin, hamayne (bulbisperine,demethỷlcinamine)

[33]

* Tác dụng sinh học

Song song với các nghiên cứu về mặt hóa học, có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý từ cây Trinh nữ hoàng cung đã được công bố Các tác giả đã chứng minh được rằng tác dụng dược lý của các alcaloid trong họ Amaryllidaceae rất rộng, bao gồm các đặc tính chống ung bướu, chống vi khuẩn và kích thích miễn dịch

- Tác giả Yui và cộng sự đã chứng minh alcaloid lycorine là họat chất chính

từ Crinum latifolium L có tác dụng gây kích thích cho tế bào T trong ống

nghiệm và trên sinh vật hoạt động và phát triển [34]

- Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, E.ZVETKOVA, E.NIKOLOVA, E.KATZAROVA và G.KOSTOV cũng đã chứng minh được rằng dịch chiết

nước nóng từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) Việt Nam

có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào lympho T và đặc biệt có

tác dụng kích thích trực tiếp các tế bào CD3 +T và CD4 + T trong ống nghiệm [29]

- Nguyễn Thị Ngọc Trâm, I.Yanchev, E.Zvetkova Đã tiến hành thử nghiệm gây ung thư trên chuột đực giống Wistar từ 50 đến 55 ngày tuổi bằng cách cấy dưới da chất hóa học gây ung thư 20-methylcholanthrene, và tiến hành

thí nghiệm cho uống những chất chiết bằng nước nóng của cây Crinum

latifolium L (cây Trinh Nữ Hoàng Cung –Việt Nam) Kết quả đã làm chậm

sự tăng trưởng khối u của chuột thí nghiệm [30]

- Theo tác giả Ghosal , một số alcaloid từ Crinum latifolium như: Crinafolin,

crinafolidine đã được thử nghiệm với tế bào ung thư và cho kết quả dương tính [25]

- Theo tác giả E Zvetkova, N.T.Tram, D.Fuchs dịch chiết nước nóng của trà túi lọc Trinh nữ hoàng cung có khả năng kích thích tế bào lympho T hoạt động và phát triển tăng sức đề kháng của cơ thể mạnh hơn trà xanh [19]

- Dịch chiết nước của Crinum latifolium L có khả năng kích thích tế bào

lympho T của người hoạt động và phát triển [19]

- Dịch chiết nước nóng từ Crinum latifolium L Việt Nam tạo nên một số tác

dụng mạnh trực tiếp mà nguyên nhân do kích thích một số hỗn hợp những tế bào Lympho CD4+/CD8+, là sự sản xuất số lượng lớn những tác nhân diệt ung bướu như TNF - α trong các sinh vật và bệnh nhân ung thư.[29]

- Các alcaloid ngăn chặn sự phát triển của khối u và kích thích hệ miễn dịch

a Epoxyambellin [22] ở nồng độ 5 mg/ml kích họat vừa phải tế bào Lympho trong lách chuột

b Hỗn hợp Epoxyambellin và ambellin [22] theo tỉ lệ (1:1) gây hoạt hóa tế bào Lympho T giống như concanavalin A [22]

c Crinamin và 6 – Hydroxycrinamin [20]

Hoạt động chống lại tế bào u hắc tố chuột BL6

d Lycorin, crinamin và Augustin [27]

Lycorin ở nồng độ 0,1 – 0,5 mg/ml diệt tế bào MM46 và ức chế sự tổng hợp DNA (Deoxyribonucleic Acid)

- Lycorin ức chế sự tổng hợp protein và DNA của tế bào lách chuột và ức chế tế bào u báng cấy ở chuột

- Lycorin làm giảm khả năng sống của tế bào u

- Lycorine ức chế sự tổng hợp vitamin C trong cây cỏ, làm ngừng sự phát triển virus gây bệnh bại liệt

- Ức chế sự tổng hợp các tiền chất cần cho sự sinh trưởng của virus gây bệnh bại liệt và enzym polipeptidase và có tác dụng kháng virus

- Lycorin có độc tính cấp thấp

- Lycorin - O – Glycosid ở mức liều microgram gây kích thích các tế bào lympho lách chuột nhắt trắng, có tác dụng điều hòa miễn dịch

Pseudolycorin có tác dụng làm ngừng sự phát triển tế bào Hela, ngăn cản sự tổng hợp protein trong tế bào u báng và làm chậm lại quá trình tổng hợp DNA

- Kháng khuẩn Staphylococcus [27]

* Các nhà khoa học trên thế giới bằng con đường tổng hợp hĩa học hoặc chiết xuất

từ dược thảo đã tạo ra sản phẩm thuốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt

cĩ thể kể đến các thuốc sau:

— Các thuốc kháng androgen: Acetat cyproterone, Flutamide, Casodex

— Thuốc ức chế 5α reductase: Finasterid

— Thuốc kháng oestrogen: Tamoximen (TMA), Ketokonazone

— Thuốc phong bế alpha: Terazosin (Hytrin), Doxazosin (Cardura), Tamsulosin (Flomax), Prazosin, Alfurrosin

— Thuốc đi từ nguồn gốc thiên nhiên, dược liệu: Tadenan 50mg- viên nang

mềm được chế từ vỏ cây Pygeum a

— fricanum), Permixon – từ quả cây Serenoa repens

1.2 Trong nước

* Thành phần hóa học

- Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự đã tìm ra 16 alcaloid: Octadecenamideb , Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamin,

9-Augustamin, Oxoassoanin, Crinane-3α-ol, Buphanidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline, 6-hydroxybuphanidrine, 6-hydroxypowelline, Crinamidine, 6-hydroxyundulatine, 1β,2β - epoxyambelline,

- Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, và các cộng sự xác định được

4 alcaloid: Augustamin, ambelin, crinamidin, 6-hydroxycrinamidin [8]

- Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự đã nghiên cứu và công bố 32 chất bay hơi có trong lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung[28]

- Nguyễn Hải Nam và cộng sự phân lập xác định cấu trúc hai flavonoid: [11]

4’7 – dihydroxy -3- vinyloxyflavan; 4’7 – dihydroxyflavan

- Mai Đình Trị,Nguyễn Công Hào [15] đã chiết tách và phân lập từ lá tươi Trinh Nữ Hoàng Cung 4 hợp chất: p – hydroxycinnamat metyl, 3,4- dihidroxycinnamat etyl, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosit và kaempferol-3- 4’-di-O-β-D-glucopyranosit

* Tác dụng sinh học

- Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự chứng minh thêm được 4 phân đoạn alcaloid có tác dụng gây độc tế bào ung thư da, ung thư màng tử cung, ung thư cơ tim có kết quả dương tính mạnh [14]

- Để có thuốc hỗ trợ cho điều trị u xơ tuyến tiền liệt (phì đại lành tính tuyến tiền liệt), u xơ tử cung và tránh nhầm lẫn cây Trinh Nữ Hoàng Cung với các cây náng khác có ở Việt Nam, Công ty CP Dược Liệu TW2 đã sản xuất trà túi lọc Trinh Nữ Hoàng Cung từ 1998 cho đến nay, sản phẩm đã và đang có uy tín trên thị trường

- Nguyễn Xuân Hướng đã sử dụng nước sắc lá Trinh Nữ Hoàng Cung của Công ty Dược Liệu TW2 cung cấp để hỗ trợ điều trị u xơ tuyến tiền liệt cho các bệnh nhân của bệnh viện Hữu Nghị Hà Nội, kết quả việc tiểu tiện của đa số các bệnh nhân đã được cải thiện [7]

- Ngày 7/6/2004, theo quyết định số 2004/QĐ – BYT, Bộ Y Tế đã phê duyệt

đề tài nghiên cứu khoa học: “Đánh giá tác dụng điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt bằng viên nang Trinh Nữ Hồng Cung”, do GS.TS.Trần Đức Thọ làm chủ nhiệm đề tài Thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3 theo quy chế

371 – Bộ Y Tế tại 3 bệnh viện: Bệnh Viện Y Học Cổ Truyền Trung Ương, Viện Lão Khoa Trung Ương, Bệnh viện Y Học Cổ Truyền TP.HCM Qua kết quả nghiên cứu trên 157 bệnh nhân dùng thuốc viên TNHC (Crila) điều trị rối loạn tiểu tiện do phì đại lành tính tuyến tiền liệt, GS Trần Đức Thọ rút ra một số kết luận như sau:

™ Viên nang TNHC (Crila) cĩ hiệu quả trong điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt Cho kết quả điều trị khá và tốt đạt 89,18%

o Cải thiện đáng kể về triệu chứng lâm sàng và chất lượng sống của bệnh nhân Thang điểm trung bình IPSS từ 19,45 xuống cịn 7,81 điểm

o Thuốc làm giảm thể tích tuyến tiền liệt nhưng khơng nhiều Thể tích tuyến tiền liệt trung bình từ 39,87 cm3 xuống 35cm3

™ Thuốc an tồn, ít tác dụng phụ

o Cĩ một số tác dụng phụ nhưng khơng gây khĩ chịu nhiều cho bệnh nhân, và chỉ trên một số ít bệnh nhân như đầy bụng, chĩng mặt, mất ngủ

o Các xét nghiệm cận lâm sàng thay đổi khơng đáng kể: urê, creatinin, SGOT, SGPT, cơng thức máu, sinh hĩa nước tiểu

- Từ kết quả nghiên cứu lâm sàng giai đoạn 3 – đạt kết quả tốt, Cục Trưởng Cục Quản lý Dược Việt Nam đã ban hành quyết định số 135/QĐ-QLD, cho phép TRUNG TÂM NCPTSX DƯỢC PHẨM CRINA thuộc CƠNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2 được phép sản xuất viên nang CRILA từ cao khô TNHC

và lưu hành toàn quốc, dùng điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt)

2 TÍNH CẤP THIẾT VÀ KHẢ THI CỦA DỰ ÁN

- Bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt là một căn bệnh phổ biến trong xã hội hiện nay cả trong và ngồi nước, nhu cầu về thuốc điều trị bệnh của thị trường là rất lớn

- Thuốc viên CRILA được bào chế từ thảo dược, hiệu quả điều trị cao, được thị trường ưa chuộng

- Giá thành hợp lý phù hợp với thu nhập của người dân Việt Nam

- Tạo viêc làm cho người lao động

Do đĩ cần phải đầu tư để hồn thiện cơng nghệ sản xuất thuốc viên TNHC (CRILA) để sớm đưa sản phẩm ra phục vụ sức khỏe cộng đồng và xuất khẩu

2- Hoàn thiện quy trình sản xuất viên nang từ bán thành phẩm của TNHC

3- Nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm

4- Xây dựng tiêu chuẩn của lá TNHC, cao khô TNHC, tiêu chuẩn của thuốc thành phẩm và thẩm định lại thuốc đã xây dựng

5- Sản xuất 10.000.000 viên thuốc đưa ra thị trường

CÂY TRINH NỮ HỒNG CUNG ĐANG NỞ HOA

(Ảnh chụp tại Trang trại Dược liệu – Cơng ty CP Dược Liệu TW2-Trung tâm CRINA)

PHẦN III.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Nguyên liệu

- Lá TNHC (Crinum latifolium L.) tươi và khơ

- Mùa thu hái:

+ Lá TNHC khơ: Tháng 1, 2, 3, 4, 5, 12 hàng năm (mùa khơ) + Lá TNHC tươi: Tháng 6, 7, 8, 9, 10, 11 hàng năm (mùa mưa)

- Tiêu chuẩn nguyên liệu: Theo tiêu chuẩn cơ sở

- Nguồn cung cấp: Trại Dược liệu Long Thành, tỉnh Đồng Nai

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Nghiên cứu chiết xuất alcaloid từ dược liệu lá TNHC (tươi và khơ)

- Phương pháp chiết xuất: Ngấm kiệt:

+ Lá khơ: Với cồn 70o trong mơi trường acid acetic + Lá tươi: Với cồn 96o, 70o trong mơi trường acid acetic

2.2 Nghiên cứu bào chế: Khảo sát các thơng số kỹ thuật

2.2.1 Cơng thức viên nang

Cao khô chiết xuất từ lá cây Trinh nữ hoàng cung được chuẩn hoá theo hàm lượng alcaloid toàn phần, nhưng thành phần các chất khác trong cao khô có sự khác nhau theo mùa thu hái Yếu tố ảnh hưởng nhiều đến vấn đề này ở điều kiện khí hậu và thời tiết miền Nam là dược liệu được thu hái vào mùa khô hay mùa mưa Khảo sát ảnh hưởng của cao khô trong thiết lập công thức để đánh giá và xác định công thức ổn định trong sản xuất viên nang Crila có hàm lượng alcaloid toàn phần theo tiêu chuẩn chất lượng đã đăng ký

2.2.2 Độ ẩm tới hạn và độ ẩm cân bằng của hạt

- Sấy hạt trong tủ sấy đối lưu tuần hoàn khí ở nhiệt độ 60oC

- Xác định độ ẩm tới hạn của hạt trong điều kiện thiết bị và nhiệt độ sấy đã xác định

- Xác định độ ẩm cân bằng và điều kiện môi trường sản xuất đảm bảo duy trì được độ ẩm của hạt ổn định trong điều kiện sản xuất thông qua việc khảo sát đường cân bằng ẩm của hạt khi phơi trong không khí phòng có nhiệt độ 25oC và độ ẩm tương đối của không khí trong phòng biến đổi từ 45 – 75%

- Chọn 2 mẫu, mẫu 1 là cao khô chiết xuất từ dược liệu thu hái vào mùa khô, mẫu 2 là cao khô chiết xuất từ dượcliệu thu hái vào mùa mưa

2.2.3 Dải phân bố cỡ hạt

Xác định dải phân bố cỡ hạt của khối hạt dùng cho quá trình đóng nang bằng phương pháp rây phân loại trên máy rây Fritsch qua các cỡ rây 1.4; 0.71; 0.355mm

2.2.4 Tính chảy của hạt

- Tính chảy của hạt được xác định gián tiếp thông qua việc đo góc nghỉ của khối hạt

- Như một hướng dẫn chung qua nghiên cứu thực nghiệm, nếu góc nghỉ của khối hạt lớn hơn 50o : Tính chất chảy của hạt không tốt Khi góc nghỉ của hạt ở khoảng 25o là phù hợp : Tính chảy của hạt rất tốt

2.2.5 Tính phân tán

- Khả năng hoà tan hoặc phân tán của thuốc khi được đưa vào cơ thể qua đường uống

2.2.6 Phương pháp đóng nang bán tự động

Kiểm tra các chỉ tiêu vật lý của sản phẩm sau quá trình đóng nang:

• Độ đồng đều khối lượng

• Mất khối lượng do làm khô

• Độ rã

• Định lượng hàm lượng alcaloid toàn phần

Xác định tính ổn định và phù hợp tiêu chuẩn của sản phẩm sau khi được đóng nang trên máy đóng nang bán tự động nhãn hiệu BOYI

2.2.7 Nghiên cứu theo dõi độ ổn định của thuốc

- Điều kiện đóng gói ; Sản phẩm được đóng gói trong chai nhựa PVC với số lượng 40 viên/chai, chèn bông không thấm nước lên trên và thêm vào chai 1 gói chất hút ẩm silicagel Miệng chai được làm kín bằng miếng keo dán trước khi vặn nắp kín

- Điều kiện bảo quản : Sản phẩm được bảo quản ở nhiệt độ phòng 30 +

2oC, độ ẩm 75 + 5%, tránh ánh sáng chiếu trực tiếp

- Chu kỳ thử nghiệm : Theo định kỳ thời gian của chương trình theo dõi độ ổn định: Mỗi 3 tháng 1 lần cho năm đầu và mỗi 6 tháng 1 lần cho các năm kế tiếp, mẫu được lấy ra kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng theo tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm đã đăng ký

- Phương pháp thử nghiệm: Theo tiêu chuẩn chất lượng đã đăng ký

2.3 Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm

2.3.1 Vi phẫu: Thử theo DĐVN III, phụ lục 9.8 (Định tính dược liệu và các chế

phẩm bằng kính hiển vi)

2.3.2 Soi bột: : Thử theo DĐVN III, phụ lục 9.8 (Định tính dược liệu và các chế

phẩm bằng kính hiển vi)

2.3.3 Xác định độ mất khối lượng do làm khơ: Theo phương pháp của Dược điển Việt Nam III, phụ lục 5.16., dùng khoảng 1g chế phẩm sấy ở áp suất thường

2.3.4 Xác định tro tồn phần: Thử theo DĐVN III, phụ lục 7.6 (Xác định tro tòan phần), phương pháp 1.

2.3.5 Xác định tạp chất: Thử theo DĐVN III, phụ lục 9.4 (Xác định tạp chất lẫn

trong dược liệïu)

2.3.6 Xác định độ đồng đều khối lượng: Theo phương pháp của Dược điển Việt Nam III, phụ lục 8.3

2.3.7 Xác định độ tan rã: Theo phương pháp của Dược điển Việt Nam III, phụ lục 8.6

2.3.8 Xác định độ nhiễm khuẩn: Theo phương pháp của Dược điển Việt Nam III, phụ lục 10.7

2.3.9 Định tính Alcaloid: bằng phương pháp HPLC với chất chuẩn là Crinamidin 2.3.10 Định lượng Crinamidin theo chương trình sắc ký:

- Cột: Cột phân tích pha đảo RP18 (250 x 4,6mm; 5µm)

- Detector: UV 285nm

- Pha động: Acetonitril - Đệm phosphat 100 mM, pH 3,0

- Tốc độ dịng : 1,0- 1,5 ml/ phút (điều chỉnh tốc độ dịng để thời gian lưu của crinamidin khoảng 30 phút)

- C: nồng độ crinamidin trong mẫu chuẩn (mg/ml)

- M: khối lượng chế phẩm cân để định lượng (g)

- b : Độ ẩm của chế phẩm (%)

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid từ dược liệu lá Trinh nữ hoàng cung (tươi và khô) dùng làm nguyên liệu sản xuất viên nang Trinh nữ hoàng cung (Crila) ở quy mô cơng nghiệp

Để sản xuất được viên nang CRILA cĩ chất lượng tốt: hàm lượng hoạt chất cao và ổn định, cĩ tác dụng dược lý mạnh và độc tính thấp, dạng bào chế dễ sử dụng, dễ bảo quản để phục vụ chăm sĩc sức khỏe cộng đồng địi hỏi phải cĩ nguồn nguyên liệu tốt và phải nghiên cứu phương pháp chiết xuất để lấy kiệt hoạt chất trong nguyên liệu và nghiên cứu bào chế viên nang CRILA từ cao khơ alcaloid tồn

phần chiết xuất từ lá cây Trinh Nữ Hồng Cung cĩ tên khoa học là (Crinum

latifolium L Amaryllidaceae)

Trong những năm qua, chúng tơi đã hồn thành hai đề tài cấp bộ:

- Đề tài 1: Nghiên cứu hồn thiện qui trình cơng nghệ chiết xuất alcaloid tồn

phần từ lá cây Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.) dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị bệnh u xơ tuyến tiền liệt, u xơ tử cung

- Đề tài 2: Nghiên cứu bào chế viên nang cứng từ cao khơ alcaloid tồn phần của cây Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.) và thử tác dụng sinh học trong điều trị u xơ tuyến tiền liệt

Trước khi thực hiện chiết xuất alcaloid tồn phần ở quy mơ cơng nghiệp, chúng tơi

đã nghiên cứu hồn thiện quy trình chiết xuất alcaloid tồn phần ở quy mơ pilot Nội dung như sau:

- Phương pháp chiết xuất: Ngâm nhỏ giọt

- Dung mơi: Cồn 70o + 2% acid tartric

- Tỉ lệ dung mơi dược liệu: 9:1

- Khối lượng dược liệu sử dụng trong một mẻ: 5kg

Dịch chiết rút ra được gộp lại và cơ cách thủy đến cao lỏng 1:1 Để cao lỏng nguội

ở nhiệt độ phịng, cân xác định khối lượng cao lỏng sau đĩ xác định các thơng số kỹ thuật:

- Xác định tỷ trọng cao lỏng

- Xác định tỷ lệ chất chiết được

- Định lượng alcaloid tồn phần theo phương pháp acid base

Kết quả thể hiện ở các bảng sau:

Tỉ trọng cao lỏng Thí nghiệm Tỉ trọng cao lỏng

1 1.035

2 1.050

3 1.069 Kết quả nghiên cứu các mẻ thí nghiệm ở quy mô pilot

Thí nghiệm Khối lượng

cao đặc (gam)

Tỷ lệ cắn khô (%)

Hàm lượng alcaloid toàn phần (%)

Khối lượng lactose thêm vào (gam)

Khối lượng cao khô thu được (gam)

Kết quả kiểm nghiệm cao khô

Thí nghiệm Khối lượng

cao khô (gam)

Độ ẩm (%)

Hàm lượng alcaloid toàn phần/ cao khô

1.1 Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất alcaloid trong lá cây TNHC với độ cồn 70 o

trong môi trường acid acetic

1.1.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết alcaloid toàn phần từ dược liệu lá khô TNHC

1.1.1.1 Nghiên cứu quy trình chiết xuất

- Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt

- Dung môi chiết xuất: cồn 70o + 2% acid acetic

- Khối lượng nguyên liệu sử dụng cho 1 mẻ là 200kg lá TNHC đạt TCCS

- Tỷ lệ dung môi dược liệu là 9:1

- Số lần thử nghiệm: 3 lần

- Số bình ngấm kiệt: 4 bình

- Nhiệt độ ngâm: ngâm lạnh (nhiệt độ phòng)

Bảng 1 Bố trí thí nghiệm với mẻ 200kg/mẻ

Số lần Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3

Khối lượng nguyên liệu 200 kg 200 kg 200 kg

Lượng dung môi 1.800 lít 1.800 lít 1.800 lít

Tốc độ rút dịch chiết 50 lít/giờ 50 lít/giờ 50 lít/giờ

- Nạp vào bình ngấm kiệt, mỗi bình 50kg bột lá TNHC

- Nạp dung môi cho ngập dược liệu khoảng 20cm

- Đậy nắp và ngâm trong 24 giờ

- Rút dịch chiết với tốc độ 50lít/giờ

- Lưu ý trong quá trình rút dịch chiết phải luôn giữ mức dung môi ngập cao hơn mức dược liệu 20cm bằng cách bổ sung dung môi liên tục bằng tốc độ dịch chiết rút ra

- Dịch chiết rút ra được lọc qua vải lọc, để lắng ở nhiệt độ phòng 24 giờ Sau

đó gộp dịch chiết 1, 2, 3, … khuấy đều, để lắng, lọc lấy dịch lọc thêm acid acetic 2%, điềuchỉnh pH=4 khuấy đều, để lắng rồi lọc lấy dịch trong đem cô cách thủy, bốc hơi acid acetic Dịch chiết thu được đem cô cách thủy, cô đến cao lỏng 1:1 Để cao lỏng nguội, cân xác định khối lượng và tiến hành xác định các thông số kỹ thuật sau:

b Sản xuất cao khô alcaloid toàn phần

- Cô tiếp cao lỏng đến cao đặc bằng phương pháp cô cách thủy Xác định tỷ lệ cắn sau khi bốc hơi theo phương pháp trong dược điển Việt Nam III, định lượng alcaloid toàn phần trong cao đặc

Thêm lượng lactose vừa đủ vào cao đặc, tạo hạt trên máy xát hạt và sấy khô trên máy tầng sôi

Bảng 3: Kết quả khảo sát sản xuất thử nghiệm ở quy mô ≥ 200kg mẻ lá TNHC khô

Hàm lượng alcaloid toàn phần/cao khô(%)

Mất khối lượng do sấy khô (%)

Qua kết quả ở bảng 3 cho thấy ở quy mô ≥200kg/mẻ cho kết quả hiệu suất chiết

hàm lượng alcaloid đạt tương đương với mẻ 5kg ở phòng thí nghiệm mà chúng tôi

đã thực hiện ở đề tài Điều đó đã chứng minh rằng quá trình nghiên cứu sản xuất thử

nghiệm chúng tôi đã giải quyết được khâu kỹ thuật và chọn đúng phương pháp chiết

và dung môi

1.1.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết alcaloid toàn phần từ dược liệu lá

tươi TNHC

1.1.2.1 Nghiên cứu quy trình chiết xuất

- Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt

- Dung môi chiết xuất: cồn 70o + 2% acid acetic

- Dung môi phá vỡ màng chất nguyên sinh: Cồn 96o

- Khối lượng nguyên liệu sử dụng cho 1 mẻ là 1.000kg lá TNHC đạt TCCS

- Tỷ lệ dung môi dược liệu là 9:1

Khối lượng nguyên liệu 1.000kg 1.000kg 1.000kg

Tốc độ rút dịch chiết 50lit/h 50lit/h 50lit/h

1.1.2.2 Cách tiến hành

Nhiệm vụ của dự án là hoàn thiện quy trình chiết xuất và nâng cấp nghiên cứu chiết

xuất với nguyên liệu lá tươi mẻ ≥ 200kg, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sản xuất

thử nghiệm với mẻ 1.000kg dược liệu tươi

Mùa mưa ở phía nam nước ta kéo dài trong vòng 6 tháng việc phơi khô và sấy

nguyên liệu gặp nhiều khó khăn Nếu là sấy bằng điện thì chi phí rất cao, do đó nhu

cầu chiết xuất lá tươi vào mùa mưa là cấp thiết Trong quá trình nghiên cứu và khảo

sát với mẻ ≥ 200kg, chúng tôi nhận thấy nguyên liệu chiết xuất lá tươi, cần phải

được xử lý phá hủy màng chất nguyên sinh bằng cồn hoặc nhiệt độ thì các chất hòa

tan trong tế bào mới thấm ra được, theo tài liệu tác giả đã viết “chất nguyên sinh

thể chiết xuất các chất hòa tan trong tế bào do không ngấm ra được”, do đó cần phá hủy màng chất nguyên sinh

a Sản xuất cao lỏng 1:1

Cách tiến hành như sau:

- Xử lý lá tươi thành nguyên liệu chiết xuất không qua nhiệt: chuẩn bị nguyên liệu: Cân 1000kg lá tươi TNHC đã được rửa sạch, chuyển vào máy cắt lá, cắt thành những đoạn ngắn 2-2.5cm, để trong phòng lạnh đến độ ẩm của lá còn 50% (khoảng 24-36h)

- Nạp dược liệu vào 4 bình chiết, mỗi bình 250kg Để phá hủy màng chất nguyên sinh trong tế bào, chúng tôi đã ngâm dược liệu bằng cồn 96o

- Đổ dung môi cho ngập dược liệu và cao hơn mức dược liệu là 20cm

- Đậy nắp và ngâm trong 24 giờ

- Rút dịch chiết với tốc độ 50lít/giờ

- Lưu ý trong quá trình rút dịch chiết phải luôn giữ mức dung môi ngập cao hơn mức dược liệu 20cm bằng cách bổ sung dung môi mới vào bằng tốc độ dịch chiết rút ra

- Dịch chiết rút ra được lọc qua vải lọc, để lắng ở nhiệt độ phòng 24 giờ Sau đó gộp dịch chiết 1, 2, 3, … khuấy đều, để lắng, lọc lấy dịch lọc thêm acid acetic 2%, điều chỉnh pH=4, khuấy đều, để lắng rồi lọc lấy dịch trong đem cô cách thủy, bốc hơi acid acetic Dịch chiết thu được đem cô cách thủy, cô đến cao lỏng 1:1 Để cao lỏng nguội, cân xác định khối lượng và tiến hành xác định các thông số kỹ thuật sau:

b Sản xuất cao khô alcaloid toàn phần

Cao lỏng 1:1 cô cách thủy đến d=1,2, thêm lactose vào cao lỏng trộn đều và sấy khô đến độ ẩm ≤ 6%

Bảng 6: Kết quả khảo sát sản xuất thử nghiệm ở quy mô ≥ 200kg mẻ lá TNHC tươi

Hàm lượng alcaloid/cao khô (%)

Từ kết quả ở bảng 6 cho thấy hiệu quả chiết xuất lá tươi đạt hàm lượng alcaloid toàn phần cao hơn dược liệu khô

Cao khô sản xuất từ dược liệu lá tươi TNHC đã được kiểm nghiệm và thử độc tính , kết quả an toàn với người bệnh Về hiệu quả điều trị so với lá khô là tương đương

1.2 Máy móc thiết bị và quy trình công nghệ chiết xuất

1.2.1 Máy móc thiết bị chiết xuất

- Hệ thống thiết bị chiết xuất được thiết kế, chế tạo, lắp đặt dựa trên yêu cầu

kỹ thuật chiết xuất ngấm kiệt và bào chế viên nang cứng

- Máy móc thiết bị được thiết kế chế tạo trong nước

- Hệ thống thiết bị có thể chiết xuất tạo cao khô alcaloid toàn phần để sản xuất viên nang cứng CRILA

- Hệ thống thiết bị có công suất phù hợp với yêu cầu tăng số lượng sản phẩm theo yêu cầu của thị trường

Bảng 7: Máy móc thiết bị chiết xuất chủ yếu

Stt Tên thiết bị Số lượng Công suất Nước SX

thống

250lít /giờ Việt Nam

3 Hệ thống bình ngấm kiệt 12 bình 220-250kg/bình Việt Nam

4 Hệ thống cô chân không và

thu hồi dung môi

01 hệ thống

Tốc độ thu hồi cồn và tách nước 50lít/giờ

Việt Nam

7 Bồn Inox chứa dịch, cồn 5 cái 1200 lít Việt nam

8 Bồn Inox chứa dịch, cồn 5 cái 500 lít Việt Nam

11 Máy xay dược liệu 1 cái 50kg/giờ Việt Nam

13 Máy trộn ướt 1 cái Dung tích 35 lít, dung

tích sử dụng 25 lít, Tốc độ cách trộn 20-

30 vòng/phút

Việt Nam

1.2.2 Quy trình cơng nghệ chiết xuất alcaloid tồn phần từ lá cây TNHC

Sơ đồ 2: Sơ đồ tĩm tắt quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid

từ lá khơ Trinh nữ hồng cung

Bột lá TNHC

Làm ẩm, ủ

chiết

Dung môi + 2% acid acetic

Dịch chiết Bã

Loại tạp chất hữu

cơ, chất màu,

Dịch chiết đã loại

tạp

Lọc

Dịch lọc

Cô cách thủy

alcaloid toàn phần

Sơ đồ 3: Sơ đồ tĩm tắt quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid

từ lá tươi Trinh Nữ Hồng Cung

Lá tươi TNHC

Xử lý nguyên liệu tươi bằng cồn 96 o

Dung môi + 2% acid acetic

Dịch chiết Bã

Loại tạp chất hữu

cơ, chất màu,

Dịch chiết đã loại

tạp

Lọc

Dịch lọc

Cô cách thủy

alcaloid toàn phần

Sấy

Cao khô TNHC (có chứa 0,4-0,5%

alcaloid toàn phần Kiểm nghiệm

Tạp chất

Cắt thành đoạn nhỏ

1.3 Vệ sinh vô trùng và an toàn lao động

- Từng máy móc thiết bị có nội quy, hướng dẫn sử dụng, có thiết bị an toàn cho máy và cho người

- Từng chặng sản xuất công nhân đứng máy phải được học cách sử dụng thiết bị một cách an toàn và nắm vững quy trình sản xuất theo đúng yêu cầu kỹ thuật

- Người trực tiếp sản xuất và cán bộ kỹ thuật phải ghi chép tỷ mỷ các diễn biến trong toàn chặng sản xuất vào hồ sơ một cách đây đủ, chính xác, kịp thời từng lô mẻ sản xuất

- Thường xuyên kiểm tra việc thực hiện các quy trình sản xuất của công nhân

- Công nhân sản xuất phải được trang bị đầy đủ bảo hộ lao động theo quy định: quần áo, mũ, giầy dép, găng tay

- Máy móc phải được vệ sinh thường xuyên

- Cơ sở sản xuất phải được vệ sinh thường xuyên

- Cơ sở sản xuất phải được vệ sinh gọn gàng, sạch, riêng biệt, tránh ô nhiễm chéo

1.4 Nội dung kiểm tra trong quá trình sản xuất

1.4.1 Phương pháp kiểm soát: Từng chặng sản xuất, KSV của tổ cần theo dõi

chặt chẽ:

- Vệ sinh máy móc và phòng pha chế

- Phiếu kiểm nghiệm nguyên, phụ liệu

- Kiểm soát trong pha chế: độ cồn, thời gian chiết, tỷ trọng cao, hàm lượng cắn khô, hàm lượng Alcaloid toàn phần

1.4.2 Phương pháp kiểm nghiệm: Xem tiêu chuẩn cao khô TNHC

1.5 Xử lý dư phẩm của quá trình chiết xuất

1.5.1 Dư phẩm: Cao thuốc không đúng tiêu chuẩn được nghiền ra, bảo quản

trong 2 lần túi PE để riêng, sẽ nhập vào lô sản xuất sau

1.5.2 Phế phẩm: Dược liệu không đạt tiêu chuẩn được loại ra

Để không làm ô nhiễm không khí và môi trường việc xử lý dư phẩm sau quá trình chiết xuất là cần thiết Toàn bộ dư phẩm trong quá trình chiết xuất được đưa về Trại dược Liệu, Long Thành – Đồng Nai Chúng tôi đã trộn với phân bò ủ hoai, sau 2 tuần sử dụng làm phân bón lại cho cây TNHC Khi bón cho cây TNHC thì trộn phân đã ủ hoai với trấu theo tỉ lệ 4:1 Nhờ phương pháp này chúng tôi đã giải quyết được dư phẩm của quá trình chiết xuất, tạo phân bón cho cây và không gây ô nhiễm môi trường

1.6 Hồ sơ làm việc cần thiết

+ Dược điển Việt Nam III

+ Quy trình vận hành các thiết bị

+ Nội quy an toàn và vệ sinh công nghiệp nơi sản xuất dược phẩm

+ Các chế độ làm việc của các tổ chức: sơ chế, pha chế, đóng gói

+ Chế độ vệ sinh, vơ trùng cho từng khu vực

+ Chế độ bảo hộ lao động

+ Tiêu chuẩn cao khơ TNHC

+ Quy cách đĩng gĩi

2 Hồn thiện quy trình sản xuất viên nang từ bán thành phẩm của TNHC

Việc triển khai một quy trình sản xuất dược phẩm từ quy mô nghiên cứu và

phát triển (R & D) sang sản xuất ở quy mô công nghiệp đòi hỏi phải trải qua giai

đoạn sản xuất thử nghiệm để thẩm định đánh giá các thông số công nghệ thông

qua việc kiểm tra và đo lường các thông số kỹ thuật đã được xác lập trong giai

đoạn nghiên cứu R & D, đảm bảo sản phẩm sản xuất ra có chất lượng đúng và ổn

định như sản phẩm đã đăng ký Dự án này được thực hiện không ngoài mục đích

nêu trên trong việc triển khai quy trình sản xuất viên nang CRILA vừa được cấp

số đăng ký lưu hành toàn quốc Để tạo được sản phẩm thuốc mới viên nang

CRILA có chất lượng tốt, hiệu quả điều trị cao, tuổi thọ thuốc là 36 tháng, chúng

tôi đã nghiên cứu và cĩ kết quả như sau:

2.1 Công thức viên nang :

* Mẫu 1 : Cao khô được sản xuất từ dược liệu thu hái vào mùa khô (chiết xuất từ

lá khơ)

* Mẫu 2 : Cao khô được sản xuất từ dược liệu thu hái vào mùa mưa (chiết xuất từ

lá tươi)

* Kết quả khảo sát qua các lô sản xuất có nguồn nguyên liệu từ 2 mẫu cao khô

nêu trên, qua đánh giá bằng phương pháp thống kê, cho kết quả như sau :

Bảng 8: Kết quả khảo sát các lô sản xuất từ dược liệu thu hái vào mùa khô và mùa mưa

Đơn vị Mẫu 1 Mẫu 2 Khối lượng cao khô TNHC gam 58.000 57.780

Hàm lượng alcaloid toàn phần trong cao khô % 0,45 0,45

Tỉ lệ các thành phần trong công thức

• Kết quả khảo sát cho thấy quy trình sản xuất ổn định khi được triển

khai ở quy mô cơng nghiệp

2.2 Một số kết quả nghiên cứu về bào chế viên nang

2.2.1 Độ ẩm tới hạn và độ ẩm cân bằng của hạt

Bảng 9: Kết quả thẩm định độ ẩm tới hạn của hạt

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Giá trị trung bình

* Kết quả thẩm định độ ẩm cân bằng

- Mẫu 1 : Hạt được sản xuất từ cao khô chiết xuất từ dược liệu thu hái vào mùa khô

Bảng 10: Kết quả thẩm định độ ẩm cân bằng của mẫu 1

Độ ẩm tương

đối của phòng

Bảng 11: Kết quả thẩm định độ ẩm cân bằng của mẫu 2

Độ ẩm tương

đối của phòng

Đồ thị cân bằng ẩm

Đồ thị cân bằng ẩm

10.00 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 9.00

Nhận xét :

- Độ ẩm tới hạn của hạt nằm ở khoảng 2,2%

- Độ ẩm cân bằng của 2 mẫu trong cùng điều kiện môi trường trung bình lệch nhau khoảng 1,18%

- Sự sai lệch này có xu hướng giảm dần theo hướng tăng độ ẩm của không khí trong phòng

- Đồ thị thực nghiệm cho thấy, khi độ ẩm tương đối của không khí trong phòng

ở khoảng từ 44%-56%, tốc độ hút ẩm và nhả ẩm của hạt để đạt đến độ ẩm cân bằng thể hiện qua độ dốc của đường biểu diễn là tối ưu nhất Chia khoảng biến thiên độ ẩm phòng làm 2 phần: Độ ẩm 45-50% và Độ ẩm 50-55%, việc duy trì độ ẩm tương đối của phòng sản xuất ở độ ẩm 45-50% sẽ

ẩm giới hạn của hạt theo tiêu chuẩn chất lượng không được vượt quá 9,0%,

độ ẩm cân bằng của hạt ở độ ẩm tương đối của phòng 56% biến đổi theo mẫu

từ 5,19-6,32% là an toàn cho quá trình sản xuất Như vậy, điều kiện độ ẩm

tương đối cho môi trường sản xuất tối ưu là 50-55%

2.2.2 Dải phân bố cỡ hạt

Bảng 12

Mẫu 1 Cỡ rây (mm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

Nhận xét : Kết quả phân tích thực nghiệm cho thấy :

- Dải phân bố cỡ hạt của các mẫu sản xuất khác nhau, biến động không

lớn, cho thấy sự ổn định của quá trình sản xuất

- Tỉ lệ phân bố cỡ hạt này sẽ đảm bảo cho khối lượng viên đạt được độ

đồng đều cao do tỉ lệ hạt thô thấp, thích hợp cho đóng nang

2.2.3 Tính chảy của hạt

ƒ Kết quả đo góc nghỉ của khối hạt (Góc α) không có sự khác nhau đáng

kể giữa các lần đo trong 1 mẫu

ƒ Kết quả đo giữa 2 mẫu có sự khác nhau

ƒ Góc nghỉ của cả 2 mẫu đều dao động xung quanh 250, cho thấy khả

năng chảy của hạt tốt

2.2.4 Tính phân tán trong nước

ƒ Thêm 20 phần nước nóng 370C vào một phần hạt thuốc, khuấy nhẹ

trong 5 phút, hạt thuốc phải tan hết thành dung dịch có dạng đục mờ (do

các hạt tá dược trơn và tá dược không tan phân tán trong dung dịch),

không có những tạp chất lạ (DĐVN III-PL 1.7)

ƒ Hạt tiêu chuẩn về chỉ tiêu phân tán cho phép các thành phần hoạt chất

trong hạt được nhanh chóng chuyển vào trạng thái hoà tan cho phép

hoạt chất được hấp phụ tốt

ƒ Kết quả thử các mẫu đều đạt tiêu chuẩn quy định

2.3 Khảo sát viên nang Crila

ƒ Độ đồng đều khối lượng

Bảng 15: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sản phẩm

Lô 1 Lô 2 Lô 3

Giới hạn dưới (-7,7%) 0.3959 0.3854 0.3841

Giới hạn trên (+7,5%) 0.4601 0.4479 0.4464

ƒ Độ rã

Bảng 16:

Độ rã không quá 30 phút

Đạt Đạt Đạt

ƒ Mất khối lượng do làm khô

Bảng 17:

Mất khối lượng do làm khô không quá 9%

5.95 6.56 6.255 5.89 6.96 6.425 5.88 6.76 6.32

ƒ Hàm lượng alcaloid toàn phần

Bảng 18:

Giới hạn hàm lượng alcaloid : 1.125-1.375mg

1.232 1.336 1.250

Nhận xét :

Kết quả khảo sát các thông số của sản phẩm được đóng nang trên máy đóng nang

bán tự động cho thấy các thông số ổn định và nằm trong giới hạn cho phép của

tiêu chuẩn sản phẩm đã đăng ký

2.4 Nghiên cứu theo dõi độ ổn định của sản phẩm

Chúng tơi đã nghiên cứu theo dõi độ ổn định của viên nang Crila từ năm 2002 đến

2005 Và trong dự án này chúng tơi tiếp tục nghiên cứu với thời gian theo dõi là 36

Mất khối lượng do làm khô (%)

Độ rã (phút)

Định tính

Định lượng (mg)

Độ nhiễm khuẩn

0 Viên nang PTB =

370mg

Bảng 20: Kết quả khảo sát : Lô 021102

Mất khối lượng do làm khô (%)

Độ rã (phút)

Định tính

Định lượng (mg)

Độ nhiễm khuẩn

0 Viên nang PTB =

380mg

12 Đạt Đạt 4,9 16 Đạt 1,30 Đạt

18 Đạt Đạt 5,0 12 Đạt 1,34 Đạt

24 Đạt Đạt 5,2 15 Đạt 1,36 Đạt

30 Đạt Đạt 5,8 12 Đạt 1,32 Đạt

36 Đạt Đạt 5,5 14 Đạt 1,34 Đạt

Bảng 21: Kết quả khảo sát : Lô 031102

Mất khối lượng do làm khô (%)

Độ rã (phút)

Định tính

Định lượng (mg)

Độ nhiễm khuẩn

0 Viên

nang

PTB = 385mg

4,8 14 Đạt 1,27 Theo

TC

3 Đạt Đạt 5,2 12 Đạt 1,28 Đạt

6 Đạt Đạt 5,3 15 Đạt 1,26 Đạt

9 Đạt Đạt 5,1 13 Đạt 1,30 Đạt

12 Đạt Đạt 5,4 12 Đạt 1,25 Đạt

18 Đạt Đạt 5,6 16 Đạt 1,27 Đạt

24 Đạt Đạt 5,8 12 Đạt 1,31 Đạt

30 Đạt Đạt 5,6 14 Đạt 1,29 Đạt

36 Đạt Đạt 5,5 15 Đạt 1,26 Đạt