Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sự biến đổi đa hình gen gsto1 và cxcl1 ở trẻ sơ sinh bị phơi nhiễm asen trước sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Nghiên cứu biến đổi đa hình gen GSTO1 CXCL1 trẻ sơ sinh bị phơi nhiễm asen trước sinh Sinh viên thực : Nguyễn Thị Minh Thu Ngành Công nghệ Sinh học : Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Huy Hồng Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen TS Nguyễn Hữu Đức Phó trưởng Khoa Cơng nghệ Sinh học “Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội phần u cầu trình độ đại học ngành Cơng nghệ sinh học” HÀ NỘI – 2013 ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan tồn kết khóa luận tơi trực tiếp thực Các số liệu kết công bố khóa luận hồn tồn trung thực, xác chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả Nguyễn Thị Minh Thu LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Huy Hoàng, Trưởng phịng Hệ gen học chức năng, Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Hữu Đức – Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Động vật – Phó trưởng Khoa Cơng nghệ sinh học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Thầy, Cô trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Trần Phương Thảo – Cán nghiên cứu phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen, người ln tận tình bảo, động viên cho tơi lời khuyên quý báu công việc sống Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán nghiên cứu, kỹ thuật viên phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận cách thuận lợi Tiếp theo, tơi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tận tình bảo cho tơi suốt q trình học tập trường Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn đến người thân gia đình bạn bè ln hỗ trợ, động viên, khuyến khích tơi suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Minh Thu MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii iiiDANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix PHẦN I MỞ ĐẦU .1 1.1.Đặt vấn đề 1.2.Mục tiêu 1.3.Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tà i2 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tà .i2 1.4.Nội dung nghiên cứu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Asen 2.1.1.1 Khái niệm asen 2.1.1.2 Độc tính chế gây độc As 2.1.1.3 Phơi nhiễm As trước sinh .7 2.1.2 Gen GSTO1 .9 2.1.2.1 Vai trò gen GSTO1 2.1.2.2 Con đường chuyển hóa As 11 2.1.2.3 Đa hình gen GSTO1 .13 2.1.3 Gen CXCL1 .15 2.1.3.1 Cấu trúc chức Cytokine 15 2.1.3.2 Vai trò chức CXCL1 .16 2.2 Kỹ thuật RFLP kỹ thuật PCR – RFLP 18 2.2.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 18 2.2.2 Kỹ thuật PCR – RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism DNA )18 2.3 Phương pháp giải trình tự (sequencing) 19 2.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 20 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 20 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 21 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu 22 3.2.1 Nguyên Liệu .22 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 25 3.3.1 Tách chiết DNA tổng số 25 3.3.2 Điện di DNA gel agarose 26 3.3.3 Đo quang phổ DNA 28 3.3.4 Kỹ thuật PCR 28 3.3.4.1 Nguyên lí kỹ thuật PCR 28 3.3.4.2 Nhân đoạn gen GSTO1 kỹ thuật PCR 31 3.3.4.3 Nhân đoạn gen CXCL1 kỹ thuật PCR 32 3.3.5 Phản ứng PCR – RFLP 33 3.3.6 Điện di DNA gel polyacylamide .34 3.3.7 Tinh sản phẩm PCR 36 3.3.8 Phương pháp giải trình tự 36 PHẦN VI: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Thu thập mẫu máu 38 4.2 Tách chiết ADN tổng số 38 4.3 Xác định nồng độ độ tinh mẫu 39 4.4 Phản ứng nhân gen PCR 40 4.5 Xác định đa hình gen GSTO1 kỹ thuật PCR – RFLP .41 4.5.1 Phân tích đa hình gen GSTO1 Cac8I .41 4.5.2 Phân tích đa hình gen GSTO1 MseI .43 4.5.3 Phân tích đa hình gen GSTO1 StuI 45 4.6 Thôi gel tinh sản phẩm PCR 47 4.7 Xác định trình tự gen CXCL1 phương pháp giải trình tự .48 4.7.1 Kết phân tích đột biến mẫu bệnh HT 03 49 4.7.2 Kết phân tích đột biến mẫu bệnh HT 09 50 4.7.2 Kết phân tích đột biến mẫu bệnh HT 22 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 59 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Một số vị trí đa hình gen GSTO1 15 BẢNG 3.1 TRÌNH TỰ CẶP MỒI DÙNG CHO PCR THEO AGUSA VÀ CỘNG SỰ (2009) 22 BẢNG 3.2 TRÌNH TỰ CẶP MỒI THIẾT KẾ DỰA VÀO PHẦN MỀM PRIMER3 23 BẢNG 3.3 CÁC ENZYME GIỚI HẠN .24 BẢNG 3.4 THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG PCR 30 BẢNG 3.5 THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG CẮT VỚI CÁC ENZYME CAC8I, MSEI, STUI 34 Bảng 3.6 Bảng trình tự mồi dùng cho giải trình tự 37 BẢNG 4.1 CÁC MẪU MÁU CUỐNG RỐN ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 38 BẢNG 4.2 KẾT QUẢ ĐO QUANG PHỔ MẪU DNA TỔNG SỐ 40 BẢNG 4.3 ENZYME GIỚI HẠN VÀ KÍCH CỠ CÁC BĂNG CỦA SẢN PHẨM PCR-RFLP 41 Bảng 4.4 Các kiểu gene thu sau sử dụng enzyme cắt giới hạn 46 DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH 2.1 SỰ XÂM NHẬP CỦA AS VÀ CÁC HỢP CHẤT CỦA AS TRONG CƠ THỂ NGƯỜI HÌNH 2.2 QUÁ TRÌNH HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME KHỬ ĐỘC 11 HÌNH 2.3 Q TRÌNH METHYL HĨA OXI HĨA 12 Hình 2.4 Quá trình methyl hóa khử 13 HÌNH 3.1 KẾT QUẢ PRIMER- BLAST CẶP MỒI CXCL3 23 Hình 3.2 Kết Primer-BLAST cặp mồi CXCL4 25 HÌNH 3.3 SƠ ĐỒ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 Hình 3.4 Các bước tách chiết DNA 26 Hình 4.4 Phổ điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ cặp mồi GST4 44 Hình 4.5 Phổ điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ cặp mồi GST5 45 Hình 4.6 Điện di thơi gel sản phẩm PCR gel agarose % 47 Hình 4.7 Điện di DNA sau tinh gel agarose 0,8% 48 Hình 4.8 Kết phân tích đột biến mẫu bệnh HT 03 49 Hình 4.9 So sánh trình tự cDNA mã hóa axit amin exon 49 Hình 4.10 Kết phân tích đột biến mẫu bệnh HT 09 50 Hình 4.11 So sánh trình tự cDNA mã hóa axit amin exon 51 Hình 4.12 Kết phân tích đột biến mẫu bệnh HT 22 52 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AB: Arsenobetaine AC: Arsenocholine As: Arsenic AsIII: Arsenite AsV: Arsenate AS3MT Methylarsonite methyltransferase ATP: Ademosine triphoglyphate CD4: Cluster of differentiation CD8: Cluster of differentiation CXCL1: Chemokine (C-X-C motif) ligand DMA: Dimethyl arsenic DMAV: Acid dimethylarsinic DMAIII: Acid dimethylarsinous EtBr: Ethydium bromide GROα: Growth-regulated alpha protein GSH: Glutathione GST Glutathione S-transferase omega GSTO1: Glutathione S-transferase omega-1 GSTO2: Glutathione S-transferase omega-2 GSTM1: Glutathione S-transferase Mu GSTP1: Glutathione S-transferase pi GSTT1: Glutathione S-transferase theta IA: Inorganic arsenic MMA: Monomethyl arsenic MMAV: Monomethylarsonic acid MMAIII: Monomethylarsonous