BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP QUẢN LÝ ĐỀ TÀI: BỘ Y TẾ
CƠ QUAN CHỦ TRÌ : TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ỨNG ĐỤNG QUY TRÌNH TÁCH,
BAO QUAN DNA VA LYMPHOCYTE NGƯỜI MƯỜNG VIỆT NAM
Chủ nhiệm đề tài : PGS.TS Văn Đình Hoa
Trưởng Bộ môn Miễn dịch-Sinh lý bệnh Thư ký đề tài : TS Nguyễn Thị Vinh Hà
Những người thực hiện chính:
1.PGS.TS Văn Đình Hoa - Trường Đại học Y Hà nội
2 TS Nguyén Thị Vinh Hà - Trường Đại học Y Hà nội 3 BS Hồ Quang Huy - Trường Đại học Y Hà nội 4 BS Lê Ngọc Anh - Trường Đại học Y Hà nội
5 TS Ta Thi Tinh - Vién Sét rét-Ky sinh tring-Cén tring TW Với sự tham gia kỹ thuật:
1 KS Tạ Thị Mến
2 KTV Phan Mai Hoa
3 KTV Nguyễn Thị Minh Huyền
Thời gian thực hiện để tài: Từ tháng 08/2002 đến tháng 09/2003
Tổng kinh phí được cấp : 100.000.000 đồng
Trang 2MỤC LỤC MỤC LỤC
PHẦN A Tóm tắt các kết quả chính của đề tài
PHAN B Nội dung báo cáo chỉ tiết kết quả nghiên cứu 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 2 TONG QUAN 2.1 DNA 2.1.1 Cấu trúc khái quát của DNÑA 2.1.2 Một số dạng DNA
2.1.3 Một số tính chất quan trọng của DNA 2.1.4 DNA tham gia cấu tạo Chromosom
2.1.5 Tổng hợp acid deoxyribonucleic
2.2 Chiết tách, tỉnh khiết, bảo quản DNA 2.2.1 Nguyên liệu chiết tách DNA 2.2.2 Chiết tách DNA từ bạch cầu
2.2.3 Chiết tách DNA từ tế bào của các mô 2.2.4 Chiết tách DNA từ huyết thanh 2.3 Sử dụng DNA chiết tách
2.4 Lymphocyte
3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng chiết tách DNA
3.1.2 Đối tượng tách, bảo quản lymphocyte
3.2 Phương pháp nghiên cứu
Trang 34 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU
4.1 Hoàn chỉnh kỹ thuật
4.1.1 Hoàn chính kỹ thuật chiết tách DNA
4.1.2 Tach lymphocyte
4.2 Kết quả nghiên cứu
4.2.1 Két qua kiém tra lymphocyte sau khi bao quan
4.2.2 Két qua chiét tach DNA người Mường
4.2.3 Kết quả kiểm tra DNA sau 12 tháng bảo quản ở -70°C 4.3 Kết quả các xét nghiệm phụ trợ 4.3.1 Tỷ lệ mang HBsAg(+) 4.3.2 Đáp ứng với vacxin chống HBV (Engerix-B) 4.3.3 Tỷ lệ mang ký sinh trùng sốt rét 4.3.4 Ty lệ thiếu enzym G6PD 4.4 Sử dụng DNA chiết được của dân tộc Mường 5 BÀN LUẬN
5.1 Tách và bảo quản lymphocyte 5.2 Chiết tách, bảo quản DNA
6 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ
Trang 4(đáo cáo ngiưệm thu Dé tai
PHAN A:
TOM TAT CAC KET QUA CHINH CUA DE TAI
1) Kết quả chủ yếu đạt được của đề tài:
Xuất phát từ nhu cầu cân có DNA và lymphocyte để phục vụ cho
một số công trình nghiên cứu trước mất và lâu dài về “Đặc điểm sinh học và bệnh lý của các gen bình thường và bệnh lý ở một số dân tộc nước ta”, bảo quản DNA phục vụ cho quỹ gen (Gene Bank), chúng tôi tiến hành nghiên cứu dé tài “Nghiên cứu, xây dựng quy trình tách, bao quan DNA va
lymphocyte người Mường” với 2 mục tiêu:
- Hoan chỉnh kỹ thuật chiết tách DNA, tách và bảo quan lymphocyte
từ máu ngoại vi trong điều kiện trang thiết bị hiện có
-_ Chiết tách, bảo quản DNA của một số con em dân tộc Mường tỉnh
Hoà Bình
1.1 Đóng góp mới của đề tài:
DNA có trong hầu hết tế bào của các mô ở dạng tươi hoặc bảo quản
(máu, gan, lách, hạch, xương, tóc, móng tay chân .) trong các dịch sinh
học (huyết thanh, dịch não tuý, nước ối và các dịch tiết khác), tồn tại lâu trong các mẫu vật Tuỳ theo nguyên liệu, tuỳ theo yêu cầu và mục đích sử
dụng mà áp dụng các phương pháp chiết tách khác nhau
Ở người, DNA có nhiều trong nhân và ty lạp thể của các tế bào có nhân Bạch cầu máu ngoại vi: vừa phong phú DNA, vừa dé dàng lấy > là
nguyên liệu khá thuận lợi cho việc chiết tách để phục vụ để tài nghiên cứu
tính đa dạng gen học của con người và bảo quản lưu giữ
1.1.1 Chọn phương pháp kỹ thuật chiết tách DNA từ bạch cầu máu ngoại vi: Căn cứ vào trang thiết bị hiện có, các hoá chất sẵn có dễ nhập, dựa vào tài liệu của hội thảo quốc tế về hoà hợp mô lần thứ XIH năm 2002 tại
Seatile (Mỹ) chúng tôi chọn phương pháp Phenol/Chloroform, Salting out
Phương pháp dùng muối trimethylammonium bromide và dùng kit QIA
Trang 5Từ các kết quả thu được về mật độ quang (OD) và điện di trên thạch
agarose 0,7% thì phương pháp Salting out cải tiến đáp ứng yêu cầu về chất
lượng DNA (OD 260/OD 280 = 1,81; điện đi cho một vạch)
Phương pháp này được sử dụng chiết tách DNA bạch cầu máu ngoại
vi của 107 người Mường và cũng được áp dụng để chiết tách DNA của
người Thái tại Sơn La (Dự án của GS Vũ Triệu An)
Sau một năm bảo quản ở -70°C, chất lượng của DNA vẫn xấp xỉ như
khi mới chiết tách
1.1.2 Hoàn chỉnh phương pháp kỹ thuật tách, bảo quản lymphocyte:
- _ Tách lymphocyte bằng Ficoll
- Bao quản lymphocyte theo 2 quy trình: Bằng máy Nicool-10 và NÑitơ
lỏng
1.2 Kết quả cụ thể:
- Chọn được phương pháp chiết tách DNA phù hợp với điều kiện thực tế - Bằng điều tra, phỏng vấn trực tiếp đã chọn được 107 người Mường trong tổng số gần 420 học sinh trường phổ thông dân tộc tỉnh Hoà Bình
- Bảo quản được 107 mẫu DNA của người Mường có chất lượng tốt,
đáp ứng với kỹ thuật PCR: sau 1 năm bảo quản ở -70°C, chất lượng và số
lượng DNA vẫn xấp xi với khi mới chiết tách, hiện vẫn bảo quản - DNA tách được đã sử dụng:
+ Nghiên cứu đột biến gen G6PD, các kháng nguyên HLUA của các đối tượng thiếu GóPD (phục vụ dự án của GS Vũ Triệu An và PGS.TS Trần Thị Chính) để: Phát hiện các đột biến gen G6PD của các trường hợp thiếu enzym G6PD, tần suất của các kháng nguyên HLA chủ yếu của các đối tượng thiếu G6PD
+ Phân tích alen của các locus DaS;¡s¡, D„S;;o, D,;S:¡; bằng kỹ thuật PCR-STR phát hiện các đoạn Nucleotid lặp lại ngắn
+ DNA bảo quản: Nguyên liệu nghiên cứu tính đa dạng gen học của
một số sắc tộc nước ta, tần suất các gen hay gặp Bảo quản lưu giữ DNA phục vụ cho dự án “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và bệnh lý của các gen
bình thường và gen bệnh của một số dân tộc nước ta”
- Bảo quản lymphocyte trong NHơ lỏng: Sau 1 tháng, tỷ lệ
Trang 6đáo cáo nghiệm tua (ĐÈ tài
1.3 Hiệu quả về đào tạo:
~_ Một luận văn tốt nghiệp bác sĩ y khoa
-_ Cung cấp thêm một số huyết thanh người Mường cho học viên cao học nghiên cứu
1.4 Hiệu quả kinh tế:
Nghiên cứu thuộc lĩnh vực cơ bản, do vậy không tính được hiệu quả
Kinh tế cụ thể
1.5 Hiệu quả về xã hội:
- Làm được một số xét nghiệm: Phát hiện ký sinh trùng sốt rét, phát
hiện các trường hợp thiếu enzym GóPD, phát hiện những người mang
kháng nguyên viêm gan B để có những lời khuyên về phòng bệnh cho họ - Tiêm phòng viêm gan B cho 107 học sinh có HBsAg (-), anti
HBsAg (-) bằng vacxin Engerix B, đủ liều và đúng quy trình tiêm chủng Kết quả: sau 3 lần tiêm vacxin, 87% có đáp ứng tạo kháng thể chống viêm
gan ở mức tốt (> 10mU/m)): có khả năng phòng bệnh viêm gan B
1.6 Các hiệu quả khác:
- _ Cung cấp DNA cho 3 đề tài nghiên cứu
-_ Giữ DNA người Mường phục vụ cho đự án “Nghiên cứu về đặc điểm
sinh học và bệnh lý của các gen bình thường và gen bệnh của một số
dân tộc”
2) Áp dụng cho thực tiễn:
Quy trình phương pháp Salting out chiết tách DNA đã được ứng dụng để chiết tách DNA của người Thái tại Sơn La và sẽ ứng dụng chiết tách
DNA người Tày, Nùng tại Cao Bằng vào tháng 2 năm 2004
Bảo quần DNA ở -70PC trong điều kiện nước ta là phù hợp
Trang 7(đáo cáo ngiuệm thu Dé tai
+ Tháng 7 năm 2002 được phân bổ kinh phí nghiên cứu
+ Tháng 8 nam 2002 đến tháng 9 năm 2003 triển khai nghiên cứu:
Hoàn chỉnh lựa chọn kỹ thuật và triển khai tại thực địa (tỉnh Hoà Bình)
+ Tháng 10 đến tháng 12 năm 2003 viết báo cáo nghiệm thu
Đảm bảo đúng tiến độ
3.2 Thực hiện mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện đầy đủ 2 mục tiêu đề ra
3.3 Sản phẩm tạo ra so với dự kiến của đề cương:
Đủ số lượng, chất lượng cũng như việc bảo quản DNA như bản đề cương dự kiến
Giữ được lIymphocyte trong Nitơ lỏng với tỷ lệ sống 50% đúng với yêu cầu khoa học dự kiến của đề cương
4) Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
+ Tổng kinh phí được duyệt cấp: 100.000.000đ
+ Kinh phí sự nghiệp khoa học cấp 100%
+ Toàn bộ kinh phí đã, đang được thanh toán và sẽ quyết toán kết thúc cùng với nghiệm thu vào cuối tháng 12 năm 2003
5) Các ý kiến để xuất:
- Với kinh phí như được cấp thì chỉ thực hiện được các đề tài khoa học ở các cơ sở đã có sẵn trang thiết bị
- Vì sự phát triển và hiệu quả to lớn của công nghệ sinh học, đề nghị
các cơ quan quản lý khoa học công nghệ cho nhập các máy móc phục vụ các để tài nghiên cứu ở mức phân tử như máy PCR, phân tích trình tự
Trang 82đáo cáo aghiim thu Dé tai
PHAN B:
NOI DUNG BAO CAO CHI TIET KET QUA NGHIEN CUU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát triển ngày càng chuyên sâu của công nghệ sinh học, trong đó
có sinh học phân tử ở những thập kỷ cuối của thế ký XX là một trong những
động lực to lớn thúc đẩy sự phát triển nhanh chóng của nhiều lĩnh vực kinh
tế và xã hội
Sinh học phân tử (Molecular Biology) nghiên cứu cấu trúc và chức
năng sinh học các phân tử, mối liên quan giữa các gen và chức năng đặc
trưng của các sản phẩm đặc thù mà chúng mã hoá tạo ra Để nghiên cứu đặc
điểm sinh học của các loài sinh vật nói chung và con người nói riêng thì vấn để quan trọng hàng đầu là nghiên cứu DNA (acid deoxyribonucleic)
DNA là cơ sở thông tin di truyền của mọi sinh vật trừ thực khuẩn thể
(Bactcriophage) và các virus loại RNA Các thông tin này được bảo tồn qua
quá trình phân chia tế bào vì DNA được tổng hợp theo cách tái bản bán bảo tồn DNA chứa đựng hệ thống các gen quy định các tính trạng của cơ thể sống và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Mô hình đầu tiên về phân tử DNA được R.Franklin và M.Wilkins mô tả vào năm 1950 qua phương pháp
nghiên cứu nhiễu xạ tia X, sau đó Chargaff khám phá ra quy luật về đôi
base bổ sung và một số đặc tính của DNA, tiếp đến Watson và Crick công bố về cấu trúc không gian của phân tử DNA (gồm 2 chuỗi polynucleotid
xoắn quanh một trục theo chiều ngược nhau) [27],[301,[31] Từ đó, hàng
loạt các công trình nghiên cứu về cấu trúc, chức năng của DNA được công bố:
DNA có trong hầu hết các tế bào của các mô (máu, gan, lách, hạch,
xương, tóc .), trong các dịch sinh học (huyết thanh, dịch não tuỷ, dịch tiết
) DNA tồn tại lâu trong các mẫu vật bị chôn vùi trong môi trường thiên
Trang 9Béo edo nghiim thu Dé tai
đúc paraffin, trong các tiêu bản lưu trữ [5],[11) Chiết tách DNA cũng
như tỉnh khiết, bảo quản chúng đã được tiến hành ở nhiều labo với nhiều phương pháp khác nhau tuỳ theo nguyên liệu và mục đích sử dụng
DNA là nguyên liệu chủ yếu được sử dụng nghiên cứu ở các labo sinh học của nhiều lĩnh vực khoa học thuộc các ngành sinh học động, thực
vật, y được Với sản phẩm DNA, nhờ các kỹ thuật hiện đại như: phản
ứng khuếch đại chuỗi (PCR: polymerase chain reaction), phan tich trinh tr
chudi nucleotid (sequence): k¥ thuat lai DNA ., cdc công trình nghiên cứu
ở mức tế bào và phân tử đã và đang thu được nhiều thành quả có giá trị về
khoa học và thực tiễn cho các ngành nông lâm, ngư nghiệp, khoa học hình
sự, nhân chủng học Những tiến bộ đạt được về ghép mô, tính chính xác
của khoa học hình sự và pháp y, sự hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của một số
bệnh có tính chất di truyền hoặc do đột biến là nhờ phân tích các gen HLA
(Human leucocyte antigen), phân tích bộ gen của nhân các tế bào
1151.161, [1212
Nhiều nước trong khu vực và trên thế giới đã có các ngân hàng bảo quản mô, bảo quản tế bào, lưu giữ các nguồn gen, có chương trình quốc gia nghiên cứu tính đa dạng gen học (Human Diversity Programme), có ngân
hàng đữ liệu nguồn gen (Data Bank, Gene Bank)
Để có nguyên liệu phục vụ trước mất và lâu dài cho công tác nghiên cứu “Đặc điểm sinh học và bệnh lý của các gen bình thường và gen bệnh của các cộng đồng dân tộc nước ta”, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình chiết tách DNA bạch cầu, tách và bảo quản lymphocyte từ
máu ngoại vị, triển khai ứng dụng với hai mục tiêu: `,
1 Hoàn'chẳỉnh kỹ thuật chiết tách DNA, tách và bảo quản lymphocyte tw mdu ngoai vi trong điều kiện trang thiết bị hiện có
Trang 10Báo cáo agiuệm thu Dé tai
2 TONG QUAN
2.1 DNA:
DNA 1a polymer của các đeoxyribonucleotid, một trong hai acid của
acid nucleic DNA bao gồm nhiều đoạn gọi là các gen chứa các thông tin di
truyền, mã hoá tổng hợp các sản phẩm (protein) có đặc tính riêng về cấu
trúc và chức năng DNA cơ sở vật chất di truyền, quyết định cấu trúc và
chức năng đặc hiệu của protein được tổng hợp Đặc tính này được chứng
minh qua công trình nghiên cứu của O.T.Avery và cs Tác giả trộn DNA tách bằng nhiệt của một chủng phế cầu với một chủng phế cầu không độc
hại Sau khi nuôi cấy đã tạo phế cầu độc hại gây bệnh Tính độc gây bệnh
của chủng phế cầu này được truyền lại cho các thế hệ sau [13],[14],[28] 2.1.1 Cấu trúc khái quát của DNA-
Phân tử DNA gồm 2 chuỗi polynucleotd xoắn quanh một trục: mỗi nucleotid có ba thành phần cơ bản:
Base nito (Adenine: A; Guanine: G; Thymine: T; Cytosine: C) Dudng Pentose (Deoxyribose)
Acid Phosphoric
Base nitơ nối với dung deoxyribose bang liên kết glucoside tao nucleoside Acid phosphoric liên kết với nucleoside bằng liên kết este ở vị trí 5` của đường deoxyribose tạo ra nucleotid Các nucleotid nối với nhau qua cầu nối 3-5” phosphodieste giữa 5` bydroxyl của pentose này và 3”
hydroxyl của pentose bên cạnh để tạo thành polynucleoud: nhóm 5”
hydroxy] cha nucleotid nay lién két với nhóm 3` hydroxyl của nucleotid bên cạnh thông qua phân tử acid phosphoric Do vậy, người ta quy ước cách viết
cấu trúc chuỗi đơn của phân tử DNA từ đầu tận 5` ở bên trái kéo dài tới 3' (5 - 3) Các polynucleotdid ngắn (dưới 50 nucleotiđ) gợi là Oligonucleotid
[30]
Trang 11Bao cáo ngiưệm thu Dé tai
một mặt phẳng theo nguyên tắc đôi base bổ sung của chargaff: guanine liên
kết với cytosine bằng 3 cầu hydro (G = C), adenine liên kết với thymine
bằng 2 cầu hyđro (A = T) Theo cấu trúc này thì các base nằm sát trục xoắn,
tiếp đến là đường deoxyribose và ngoài cùng là acid phosphoric Trật tự các
base trong chuỗi thứ nhất khác với chuỗi thứ hai: base của chuỗi 1 là adenin
thì base đối xứng ở chuỗi 2 là thymin, guanin ở chuỗi 1 thì cytosin ở chuỗi 2
Hình 2.1: Cấu trúc ĐNA theo Watson - Crick
2.1.2 Một số dạng DNA:
Tuỳ theo cách xoắn trong không gian của hai sợi polynucleotid mà có một số dạng khác nhau của phân tử DNA
Hai sợi polynucleotid xoắn quanh trục theo chiều từ trái sang phải, mỗi chu kỳ xoắn từ 2,3 dén 3,6 nm, gồềm 10 - 11 cặp base: đó là dạng A và
B
Hai sợi polynucleotid xoắn quanh trục theo chiều từ phải sang trái, mỗi chu kỳ xoắn 3,7nm gồm 12 cặp base, thường có sự xen kế giữa purin và pyrimidin: đó là dạng Z Dạng Z thường có 12 - 24 nucleotid nằm ở vùng
gen điều hoà
DNA trong tế bào của một số loài có kích thước khác nhau
E.coli: 4,4.10?pg
Nấm: 1,7.10?
Trang 12đáo cáo nghiim thu Dé tai
DNA cé thé & dang soi don hoc dang xoan kép Tuy theo s6 luong
và cách sắp xếp các base nitơ trong nội bộ mà một số đoạn trong phân tử
DNA có các cấu trúc hình cong, hình kẹp tóc, hình chữ thập [27],{30]
2.1.3 Một số tính chất quan trọng của DNA:
- Biến tính thuận nghịch: Các liên kết hydro giữa các base nitơ rất dễ bị phá huỷ khi đột ngột tăng nhiệt độ lên tới 90 - 95°C hoặc khi pH quá kiểm hoặc quá acid làm cho hai sợi xoắn kép của phân tử DNA tách thành 2 chuỗi đơn
XOXE™OK TOIT
|
=a
Hình 2.2: Tháo xoắn và tái xoắn cia DNA
Hai soi don polynucleotid này có thể liên kết với nhau trở lại để tạo
thành đạng xoắn kép như cũ khi đưa nhiệt độ hoặc pH về mức bình thường
Trong quá trình nghiên cứu, từ một đoạn DNA chiết tách được thì ta
có thể tiến hành tháo xoắn nó để tách thành 2 sợi đơn và nhân nó lên nhiều lần sau khi gắn với một đoạn mồi thích hợp (primer) Chu trình nhân lên
Trang 13áo cáo agiuiệm thu Dé tai
khuôn mẫu ban đầu rất bé nhỏ đã được nhân lên đến tỷ lần giúp cho việc phát hiện sự có mặt, nguồn gốc của các DNA khi chúng chỉ có một lượng rất ít hoặc chỉ còn dấu vết trong mẫu vật Tính chất biến tính thuận nghịch
của DNA đã được ứng dụng và đem lại nhiều thành quả quan trọng trong
việc nghiên cứu sinh học phân tử (kỹ thuật PCR) {61,[8],191.{111.115],116], [1711201.1241
- Tính chất lai: Hai DNA của hai loài khác nhau, nếu có trật tự các nucleotid sắp xếp tương ứng với nhau thì có thể tạo được một phân tử DNA
lai Tạo phân tử DNA lai được tiến hành theo trình tự: tháo xoắn các phân tử
DNA gốc để có được các sợi đơn Trộn lẫn các sợi đơn ở nhiệt độ và pH
thích hợp để chúng liên kết với nhau tạo nên các phân tử DNA lai
- Thương tổn DNA: Trong quá trình sao chép tái bản, DNA có thể bị
thương tổn do các tác nhân bên ngoài (nhiệt độ, bức xạ ion hoá, hoặc do các
biến đổi hoá học trong bản thân phân tử DNA) Đa số các thương tổn nhất là các thương tổn do biến đổi về mặt hoá học đều nhanh chóng được khắc
phục nhờ các enzym sửa chữa (DNA - Repair nuclease) Các biến đổi hoá
học của DNA thường gặp như: xuất hiện các mạch carbon dài (benzopyren) do liên kết các dimer (T=T, C=C, T=C), gẫy liên kết N - glycosyl - deoxyribose, khử amin các base (adenine biến thành hypoxanthin, cy†osine
biến thành uracil ) tạo thành các liên kết đồng hoá trị (khi hai base thymine đứng gần nhau) [27],{31],132]
2.1.4 DNA tham gia cấu tạo chromosom (nhiễm sắc thô:
Thành phần chính của chromosom tế bào có nhân là chất nhiễm sắc
(chromatin) Chromatin chứa protein và DNA Trong chromatin DNA liên kết với 5 loại protein histon Hai sợi xoắn kép của DNA quấn quanh histon
tạo thành nucleosom Nucleosom là hạt cơ bản của chromatin Các hạt
nucleosom cuộn lại thành sợi 30 nm, sợi này chứa khoảng 100 khúc cuộn
DNA Soi 30 nm nay cuộn lại thành vòng xoắn, sáu vòng xoắn hình thành 1
rosetie Khoảng 30 rosette tạo thành một cuộn lớn và 10 cuộn lớn này là
một chromatid (nhiễm sắc tử) Hai chromatid liên kết lại thành chromosom
Trang 14Bae cáo nghiệm thu DE tai
2.1.5 Tổng hop acid deoxyribonucleic (DNA):
Các tế bào của cơ thể tự tổng hop acid nucleic cha ching (DNA,
RNA) DNA được tổng hợp trong giai đoạn tế bào đang phân chia phát
triển Thông tin di truyền của DNA được bảo tồn trong suốt quá trình phân
bào, có nghĩa là các DNA con cháu (hậu duệ) được tái bản một cách chính
xác về cấu trúc và mang nguyên vẹn các thông tin di truyền từ DNA mẹ Thông tin được đi truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác nhờ các quá trình:
Tái bản (replication) : DNA > DNA Sao chép (transcription) : DNA > RNA,
RNA,, > protein
Mỗi sợi của phân tử DNA là một khuôn để tổng hợp tạo ra một sợi bổ
sung Phương thức tái bản của DNA như thế gọi là tái bản bán bảo tổn
(semiconservative replication) Bằng kỹ thuật tự chụp hình phóng xạ, người
ta thấy quá trình tái bản DNA được bắt đầu ở một vùng và đi chuyển theo
chiều đài của sự tháo xoắn kép DNA mẹ Hai sợi DNA con được tổng hợp nhờ một hệ théng enzym (DNA polymerase DNA helicase, RNA primase, DNA ligase .) [30],{31]
DNA được tái bản, RNA„ được tổng hợp bằng cách sao chép trên khuôn DNA theo đúng quy luật đôi base bổ sung và ra ngồi nhân mang
theo thơng tin của DNA đến nơi tổng hợp protein Quá trình tổng hợp
protein xẩy ra ở bào tương và ở ty lap thé (Mitochondria) Nhu vay, Mitochondria cũng có nhà máy tổng hợp protein riêng (có RNA polymerase, aminoacyl RNA synthetase, RNAt va các ribosom) Tuy nhiên, người ta thấy ở Mitochondria có số lượng RNAI ít hơn, ribosom bé hon, RNA, ngắn hơn so với bào tương Có một số mã khác nhau giữa bào tương va Mitochondria: trong bao tương UAU mã cho 1soleucin, trong
Mitochondria lại mã cho methionin, trong bào tương CA mã cho Leucin, trong Mitochondria lại mã cho Threonm Do vậy, việc giải mã hệ thống
gen của Mitochondria cũng đã và đang được các labo sinh học phân tử quan
tâm nghiên cứu [23]
Trang 15(đáa cáa nghiệm thu Dé tai
2.2 Chiết tách, tỉnh khiết, bảo quản DNA:
DNA là nguyên liệu cơ bản sử đụng trong nhiều kỹ thuật hiện đại để
phát hiện, phân tích các hiện tượng cũng như các quy luật sinh học bình
thường hoặc bị biến đổi của động thực vật ở mức phân tử, phục vụ sự phát
triển kinh tế xã hội, nâng cao tăng năng suất vật nuôi, cây trồng DNA là
nguyên liệu để phân tích một cách chính xác nhất về nguồn gốc, sự phát triển của các loài, tính đi truyền và biến đị, dấu vết các cá thể [7],
{10]1,1221
2.2.1 Nguyên liệu chiết tách DNA:
DNA được chiết tách từ nhiều loại tế bào của các mô ở dạng tươi
hoặc ở dạng bao quan, từ các dịch sinh học Ở người, DNA được chiết
tách từ các tế bào ở các mô: máu, gan, hạch, tóc, xương, móng tay chân ., huyết thanh, địch não tuỷ
Tuy theo muc dich sử dụng mà lượng DNA cần có va d6 tinh khiết của DNA thu được có khác nhau Lượng DNA sử dụng trong kỹ thuật PCR phát hiện các genom của vi khuẩn, virus thì chỉ cần một lượng bé (ng, pg) là đủ và độ tinh khiết không đồi hỏi tuyệt đối lắm Lượng DNA phục vụ cho việc lưu giữ nguồn gen (Genebank), phân tích di truyền (Genetic Analyzer):
trình tự gen (ADN sequencer) thì phải có được một lượng DNA nhiều hơn (mg) và phải có độ tỉnh khiết cao [18],[191,{25],{261.1291
Do sự khác nhau về tính chất, trạng thái các tế bào của các mô sử
dụng để chiết tách DNA nên quy trình chiết tách DNA có khác nhau ở một
số công đoạn Mặt khác, khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, trang thiết bị máy móc ngày càng được cải tiến và tự động hoá, do đó đã và đang có nhiều phương pháp kỹ thuật chiết tách tinh khiết DNA ngày càng được cải
tiến và hoàn thiện
Trong tế bào của cơ thể con người DNA có nhiều trong nhân và ty
Trang 16(đáo cáo ngiưệm tuc “Đề tài
2.2.2 Chiết tách DNA từ bạch cầu:[25]
Máu tồn phân chống đơng bang EDTA (Ethylen Diamine Tetraacetic) hoac ACD (Citrate) EDTA 14 chat chéng dong thích hợp nhất
vì EDTA còn tạo phức với một số lon kim loại hoá trị JI (Mg, Ca, Zn) có tác dụng ức chế tác nhân hoạt hoá Nuclease
* Loại bỏ hồng cầu: Lầm tan và loại bỏ hồng cầu bằng đệm ly giải hồng cầu (Red Cell Lysis Buffer: RCLB), chỉ giữ lại các tế bào có nhân
(bạch cầu)
* Phá màng tế bào và màng nhân của bạch cầu: Dùng đệm ly giải bạch cầu (White Cell Lysis Buffer: WCLB) DNA được giải phóng nhưng còn lẫn với một số thành phan khác: RNA, protein
* Loại protein: Loại protein còn lẫn trong dịch chiết DNA bằng
proteinase K hoặc phenol Proteinase K phân huỷ được hầu hết các protein lẫn trong dịch chiết Phenol có tác dụng làm biến tính protein, loại bỏ
proteinase K còn thừa trong dịch (nếu trước đó đã dùng proteinase K), đồng
-_ thời phenol còn cho DNA được chiết tách tinh khiết hơn Tuy nhiên, phenol
lại có tác dụng ức chế các enzym sẽ được sử dụng trong các kỹ thuật PCR
sau này Do vậy, ở giai đoạn cuối cùng phải loại phenol thừa bằng
chloroforme hoặc hỗn hop chloroforme/isoamyl alcohol
* Loại RNA: RNA„ và RNA, rất đễ bị phân huỷ, RNA, khá bền vững
và thường tồn tại trong dịch chiết DNA Để phá huỷ RNA, thường ding
Ribonuclease (R Nase) đã khử D Nase Cuối cùng, loại R.Nase thừa, RNA
biến tính bằng phenol
* Tủa, thu hồi DNA: Sau khi loại bỏ protein, RNA, dịch nổi chứa DNA được thu hồi vào các dụng cụ thích hợp Tủa DNA bằg Ethanol (tuyệt
đối) hoặc Isopropanol lạnh Rửa tuả 1 - 2 lần bằng Ethanol 70%, pH thích
hợp để DNA tủa: 4,8 - 5,2 Do vậy trước khi tủa nên điều chỉnh pH của dịch
chiết về khoảng pH trên đây bằng acetat Na hoặc acetat K 3M
* Hoà tan tủa DNA: Hoà tan DNA trong dung dịch TE (tris-
HCL+EDTA) hoặc nước cất 2 lần khử 1on
Trang 17Bao edo nghiém thu De tai
* Kiểm tra chất lượng DNA:
Đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 va 280 nm
trên máy quang phổ tử ngoại Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện để
kiểm tra chất lượng (độ tình khiết) và nồng độ DNA chiết tách duoc DNA được hấp phụ cực đại ở bước sóng 260nm, protein ở bước sóng 280nm Nếu OD260/OD280 = 1,7 - 2,0 thì dịch chiết tách DNA đạt độ tỉnh khiết, dưới
1,7 là còn lẫn protein Ở bước séng 260nm ma OD = 1 thi trong Iml dich
chiết tách có 50kg
Điện di DNA: Điện di DNA trên gel thạch agarose 0,7 - 0,8% Phương pháp này có ưu điểm: phát hiện được các đoạn DNA bị gẫy trong
quá trình chiết tách, có nghĩa là phát hiện được các đoạn DNA đài ngắn
khác nhau, phát hiện được RNA còn sót lại trong dịch chiết Tuy nhiên
phương pháp này đòi hỏi phải có: gel thạch agarose, dung dịch dẫn đường
(loading buffer), DNA size marker, thuốc nhuộm DNA (ethidium bromide),
đèn soi tử ngoại
PCR tìm gen đặc hiệu luôn có mặt trong phân tử DNA : hCYCLO, HLA-DQœ Đây là phương pháp hiện đại có độ chính xác cao, phát hiện được DNA dù chỉ có một lượng rất ít trong dịch chiết tách nhưng đòi hỏi
trang thiết bị và sinh phẩm chuyên dụng, đắt tiền * Bảo quản:
Bảo quản DNA là một công việc rất cần thiết và hết sức quan trọng phục vụ cho các nghiên cứu trước mắt và lâu dài khi có điều kiện trang thiết
bị hiện đại và trình độ kỹ thuật được phát triển , nâng cao Tuỳ theo mục
dich ma bao quan DNA 6 4°C, -20°C, -80°C, nito lỏng, lý tưởng nhất là đưới
hình thức plasmid
2.2.3 Chiét tach DNA từ tế bào của các mô:
Để tiến hành chiết tách DNA trong tế bào của các mô ở dạng tươi
hoặc ở đạng bảo quản trong đông lạnh, trong khối đúc paraffin ., trước hết
phải cắt nhỏ, nghiên tán các tổ chức đó trong các đệm chiết tách thích hợp
Trang 18Bao cáo ngiưệm thu Dé tai
sau đó tiến hành thu hồi dịch nổi chứa DNA Các công đoạn tiếp theo sau đó tương tự như chiết tách DNA từ bạch cầu
2.2.4 Chiết tách DNA từ huyết thanh:
Khâu đầu tiên là phân huỷ các protein khác của huyết thanh bằng các
dung dịch có hoạt tinh protease nhu proteinase K, DS (Triton X-100 + Proteinase K + Tris-HCl + EDTA), sau d6 loai cdc protein da bi bién tinh va proteinase K thừa bằng phenol hoặc các hoá chất khác có tác dụng tương tự Tiến hành tủa, rửa tủa DNA bằng Ethanol và các công đoạn hoà tan DNA
cũng tương tự như đối với kỹ thuật chiết tách DNA từ bạch cầu 2.3 Sử dụng DNA chiết tách:
DNA là nguyên liệu đã và đang được sử dụng trong nhiều kỹ thuật sinh học phân tử trong các labo của nhiều ngành sinh học Phản ứng khuếch
đại chuỗi (PCR) và phân tích trình tự DNA (Sequence) là hai kỹ thuật đã và
đang đem lại nhiều phát hiện mới cho khoa học và nhiều lợi ích to lớn trong thực tiễn
Troff“v-học, với các phương pháp SSO (Sequencer specific oligo- nueleotide), SSP (Sequencer specific primer), PCR léng (nested PCR) cla kỹ thuật PCR đã đem lại nhiều thành công có giá trị phục vụ thực tiễn Một trong những thành tựu có giá trị to lớn là phát hiện hệ thống gen hoà hợp
m6 (MHC: Major Histocompatibility Complex) Hệ thống hồ hợp mơ ở người là hệ thống kháng nguyên trên bạch cầu: HLA (Human Leucocyte
Antigen) Hệ thống này rất đa dạng về sinh học và có vai trò rất quan trọng trong bệnh lý học Thành công của ghép mơ đồng lồi đị gen phụ thuộc vào mức độ phù hợp giữa các kháng nguyên HLA của người cho và người nhận
Do tính đa dạng của hệ thống này nên cứ 2-3 năm lại có hội nghị, hội thảo
quéc té (IHWC: International Histocompatibility Workshop and Conference)
để báo cáo những phát hiện mới, thảo luận những vấn đề về tính đa dạng
gen học của bộ gen người [2],[4].[71.112].1211
Phát hiện sự liên quan giữa hệ thống HLA và bệnh tật cũng là một
thành công lớn của y học Người ta đã xác định được một số bệnh do các
gen thuộc vùng HLA (bệnh nhiễm sắc tố sắt mô: Hemochromatosis, bệnh
quá sản tuyến thượng thận bẩm sinh .) Các công trình nghiên cứu cũng
Trang 19đã phát hiện được hàng trăm các bệnh có liên quan đến sự thay đổi tần suất
của một số phenotyp HLA giữa người bệnh và người bình thường Tần suất kháng nguyên B27 ở bệnh nhân viêm khớp đốt sống xơ cứng cao hơn 10 lần so với người bình thường, DR5Š ở bệnh nhân viêm đa khớp dang thấp có tần suất gấp 3 lần người bình thường, tần suất DR3 ở bệnh nhân Lupus ban đỏ gấp 2,5 lần ở người khoẻ mạnh, tần suất DR3 và DR4 ở bệnh nhân đái đường phụ thuộc Insulin gấp đôi người bình thường [6],[25]
Cũng nhờ kỹ thuật PCR mà đã phát hiện được sự có mặt của nhiều vi
sinh vật gây bệnh trong cơ thể con người ngay ở thời kỳ không triệu chứng
hoặc người lành mang mầm bệnh: phát hiện genom HBV, HCV, HIV,
BK
Phân tích trình tự gen (DNA Sequencer) còn mang lại nhiều thành
tựu 1o lớn hơn nhiều: Phát hiện nguồn gốc, dấu vết cá thể, các đột biến Tính ưu việt của kỹ thuật này đang được ứng dụng có hiệu quả trong nhiều
ngành khoa học: nghiên cứu động thực vật, y học, nhân chủng học, khoa
học hình sự, quy luật di truyén, bién di 2.4 Lymphocyte:
Lymphocyte chiém khoảng 22 - 30% tổng số bạch cầu máu ngoại vi Chức năng của lymphocyte đã được nghiên cứu từ lâu Trước đây, trong
điều kiện chưa phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử, nhiều nước như nước ta đã sử dụng kỹ thuật độc tế bào lympho để xác định các kháng nguyên hoà hợp mô phục vụ cho các nhu cầu thực tiễn như ghép tạng, nhưng để thực hiện được kỹ thuật này thì phải có các serotypes Nếu nuôi
dưỡng, bảo quản được lymphocyte lâu dài thì sẽ có nguồn dự trữ DNA còn
nguyên vẹn trong tế bào để phục vụ cho nhiều nghiên cứu phân tử chuyên sâu trong tương lai Tuy nhiên công tấc lưu giữ được các lymphocyte sống
lâu dài rất tốn kém và đòi hỏi nhiều điều kiện và trang thiết bị
Trang 20(Báo cáo ngitệm thu Dé tai
3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu:
3.1.1 Đối tượng chiết tách DNA:
3.1.1.1 Đối tượng hoàn chỉnh kỹ thuật để ứng dụng chiết tách DNA:
15 người bình thường khoẻ mạnh tuổi từ 20 - 45 là cán bộ của Bộ
môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh và người cho mấu tại Viện Huyết học -
Truyền máu, bệnh viện Bạch Mai
3.1.1.2 Đối tượng lấy máu tách, bảo quản DNA:
107 hoc sinh dân tộc Mường sinh từ năm 1983 - 1987 tại các huyện Đà Bắc, Yên Thuỷ, Lạc Sơn, Tân Lạc, Cao Phong, Kỳ Sơn, Kim Bôi, Lương
Sơn và Lạc Thuỷ hiện đang theo học lớp 10, 11, 12 tại Trường phổ thông Dân tộc nội trú tỉnh Hoà Bình Các đối tượng này đều được tuyển chọn để “thu thập DNA fñeb tiêu chuẩn: `
+ Đều là dân tộc Mường, có nguồn gốc ít nhất là 2 thế hệ trước đó:
ông bà nội ngoại, bố mẹ của đối tượng là người Mường căn cứ vào phiếu điều tra và phỏng vấn trực tiếp các đối tượng (có phụ lục kèm theo)
+ Các đối tượng khoẻ mạnh không mắc các dị tật bẩm sinh (được xác
định qua khám sức khoẻ)
+ Tìm ký sinh trùng sốt rét
+ Kiểm tra xác định kháng nguyên bề mặt viêm gan B + Tiêm vacxin viêm gan B
+ Xác định enzym G6PD
3.1.2 Đối tượng tách, bảo quản lymphocyte:
15 người cho máu khoẻ mạnh tại Viện Huyết học và truyền máu
Trang 213.2 Phương pháp nghiên cứu:
3.2.1 Quy trình kỹ thuật chiết tách DNA từ bạch cầu:
* Kỹ thuật chiết tách DNA từ bạch cầu mán ngoại vi bao gồm các bước
chính sau:
- Nguồn nguyên liệu: Máu toàn phần chống đông bằng EDTA - Phá vỡ hồng cầu giữ lại các tế bào có nhân (bạch cầu)
- Phá vỡ màng tế bào và màng nhân bạch cầu
- Tủa và loại bỏ protein, giữ lại phần nước mặt có chứa DNA - Tủa thu hồi DNA
* Kiểm tra chat luong DNA:
- Kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA bằng cách đo mật độ quang trên
máy quang phổ tử ngoại Dung dịch DNA thường được pha loãng bằng đệm TE rồi đo ở bước sóng 260 và 280nm Dựa vào mật độ quang (OD: Optical Density) ở hai bước sóng trên sẽ xác định được độ tỉnh khiết và nồng độ:
+ Độ tỉnh khiết đạt yêu cầu khi OD 260/280 = 1,7 - 2,0
+ Nồng độ DNA được tính dựa vào mật độ quang ở bước sóng 260nm, khi OD = 1 tương ứng với nồng độ DNA = 50pg/ml
- Kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di: Thường dùng thạch agarose 0,7%
+ 8HI dung dịch DNA được trộn với 2ml dung địch dẫn đường
(oading buffer), rồi cho vào các lỗ đã đục sẵn trên thạch
+ Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V/30 - 45 phút
+ Nhuộm bản thạch bang ethidium bromide, DNA gan ethidium bromide sẽ phát sáng dưới ánh sáng tử ngoại
* Dụng cụ, hoá chất chung cho cả 3 kỹ thuật: - Máy ly tâm
Trang 22Béo eis nghiéim thu Dé tai
- May lac (Vortex)
- Máy điện di
- Tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu (-70°C) - Thiết bị soi tử ngoại
- Hod chat: EDTA (Ethylen Diamin Tetra Acetic), cén tuyét d6i, proteinase K, agarose, ethidium bromide, dung dich TE 3.2.1.1 K¥ thuat Phenol/Chloroform: * Hoá chất: - Dung dịch phá hồng cầu (RCLB): + Tris-HCl (pH 7,6): 10 mM + MgC: 5 mM + NaCl: 10 mM - Dung dịch phá bạch cầu (WCLB): + Tris-HCl: 10mM + EDTA (pH 8,0): 10 mM + NaCl: 10 mM
- PCI (Phenol - Chloroform - isoamylalcohol) với tỷ lệ: 3V Phenol: 1V Chloroform - isoamylalcohol (24:1)
- SDS 10%
* Các bước tiến hành:
- 5ml máu chống đông bởi EDTA, ly tâm 1500 v/phút x 5 phút > chat bd
phần huyết tương
- Phá hồng cầu: Cho thêm vào 5ml dung dịch RCLB, trộn đều - Ly tâm 1500v/ phút x 10 phút -> loại bỏ nước mật
- Cho 1,5ml dung dịch WCLB vào cặn thu được để phá bạch cầu - Thêm 25H1 SDS 10% và 25H] proteinase K 10mg/mI
Trang 23Bao cio nghiém thu Dé tai - Lắc nhẹ theo chiều thẳng đứng, để qua đêm ở nhiệt độ 42 - 50°C - Chiết tách DNA: + Thêm 1,5 ml dung dich PCI, lac 10 phiit bằng máy hoặc tay + Ly tâm 1500v/phút x 5 phút
+ Chuyển sang falcon 15ml
~ Tủa bang isopropanol:
+ Thêm 30u1 NaCl 5M
+ Thêm 0,6V isopropanol, lắc nhẹ để tạo tủa + Chuyển tủa DNA sang falcon 5ml
+ Rửa tủa bằng 3ml cồn 70° x 3 lần
+ Làm khô DNA, sau đó hoà tan DNA bằng TE
Trang 242Öáo cáo ngiưệm thu Dé tai
- Ly tâm 10000 - 12000v/ phút x 5 phút Loại nước mặt
- Thêm 10ml dung dịch RCLB lắc trong 30 giây, ly tầm 10000 - 12000v/
phút x 5 phút, loại bỏ nước mặt > Trong ống còn lại cặn màu trắng (có thể lặp lại bước này nếu cặn thu được vẫn còn màu hồng)
- Thêm vào ống chứa cặn 0,2 ml dung dich Nuclei lysis va 50u1 SDS 10%, đánh tan cặn bằng Vortex đến khi tạo thành bọt trắng như bọt xà phòng
- Thêm tiếp 1501 dung dich Nuclei lysis, lac bang Vortex
- Thêm 250M1 proteinase K (2mg/m]) trộn đều (không lắc)
- Ủ cách thủy 65°C x 2 giờ
- Thêm 4351 NaCl 5,3M Ly tâm 10000-12000v/phút x 15 phút
- Chuyển nước mặt sang ống nghiệm khác, sau đó thêm 5ml cồn lạnh 100%
để tạo tủa DNA
- Chuyển tủa sang eppendorff, rita tha DNA bang cén 75°
- Để khô DNA bằng cách mở nắp, sau đó thêm 306 - 400ul nước vô trùng,
để cách thuỷ 65°C/ 15 phút (hoà tan DNA)
Trang 25Bao cáo ughiém thu Dé tai
+ Sodium azide: 0,05% * Các bước tiến hành:
- Máu chống đông (5ml máu) bang EDTA 0,4M 1251
- Cho vào ống 10ml] dung dịch phá hồng cầu (RCLB) trộn đều nhiều lần
- Ly tâm 2500 v/phút x 10 phút
- Loại bỏ nước mặt (có màu hồng của hemoglobin), giữ lại cặn (tủa tế bào mầu trắng)
- Lặp lại 3 bước trên thu được cặn trắng tế bào bạch cầu - Lầm tan cặn tế bào bằng cách đùng máy lắc Vortex
- Cho tiếp vào ống chứa cặn tế bào 1800H1 dung dịch phá bạch cầu (WCLB)
phá vỡ tế bào bằng cách đánh tan cặn (Có thể tách ngay DNA hoặc bảo
quản ở 4°C trong một vài tuần)
- Cho tiếp vào ống 125 pl dung dich proteinase K 2mg/ml lac déu trong 5 phút , - Ủ ở 50°C trong 2 giờ, 15 phút lắc một lần - Cho thêm 7501 NaCl bão hoà (6M) lắc đều bằng máy lắc trong 5 - 10 phút - Ly tâm 2500 vòng/ phút x 10 phút
- Chuyển dịch nổi chứa DNA sang ống khác
- Tủa DNA bằng cồn tuyệt đối: 1V dịch nổi + 2V cồn
- Lắc nhẹ nhàng bằng cách nghiêng ống cho tới khi xuất hiện tủa DNA
- Chuyển tủa DNA sang eppendorf chứa sẵn 500M1 TE
- Kiểm tra chất lượng DNA: Để sảnphẩm ở 37°C cho DNA tan hoàn toàn
Đo OD hoặc chạy điện di
Trang 26Bao edo nghiém thu Dé tài
3.2.2 K¥ thudt tach, bdo quản lymphocyte: Được tiến hành theo các bước sau:
3.2.2.1 Tach lymphocyte tt máu ngoại vi:
- Lấy 15 ml máu chống đông bang Heparin theo ty lé 30UI/ml
- Pha loãng máu bằng dung dịch RPMI theo tỷ lệ 1V máu + 1V RPMI - Chuẩn bị trước vào ống nghiệm 1V ficoll (tỷ trọng 1,077), sau đó cho nhẹ nhàng 2V máu đã pha loãng ở trên ly tâm ở 2000 vòng/phút x 20 phút - Dùng pipette Parteur hút lấy vòng ]ymphocyte (màu trắng đục) cho sang một ống nghiệm khác
- Rửa sạch khối tế bào trên 2 lần bằng môi trường RPMI > ly tam 1200v/phút x 10 phút
- Khối tế bào trên được điều chỉnh về nồng độ 107 tế bào/mm” và xác định ty lệ sống chết của hỗn dịch lymphocyte bằng xanh Trypan 0,2%
3.2.2.2 Chuan bi hén dich lymphocyte dé bao quan:
- Dat 6ng nghiém chita hén dich lymphocyte vào khay nước đá Chuẩn bị
một ống khác có thể tích tương đương gồm: RPMI + 40% FCS (Fetal - Cap) + 15% DMSO và đặt vào trong nước đá
- Nhỏ từng giọt dung dịch DMSO trên vào hỗn dich lymphocyte (vita nhỏ vừa lắc)
- Hút hỗn địch trên vào các ống mao quản, dùng chất bịt kín các mao quản, 3.2.2.3 Quy trinh bao quan lymphocyte:
* Quy trình 1: Bằng máy Nicool - 10
- Cho máy Nicool -10 hoạt động theo chương trình sau: + Chế độ 3 trong 15 phút
+ Clế độ 10 trong 10 phút
Trang 27Bao cio nghiéim thu Dé tai - Với quy trình trên tốc độ làm lạnh các lymphocyte theo thang nhiệt độ sau: Khoảng nhiệt độ Tốc độ giảm nhiệt độ 0 > -18°C - — 1/22C/1 phút -18°C > - 60°C 4,3°C/ 1 phút - 60°C > - 196°C 100°C/ 1phút
- Sau đó cho mẫu vào nitơ lỏng cất g1ữ
* Quy trình 2: Làm lạnh từ từ bằng hơi nitơ lỏng
- Cho các mao quản (chứa lymphocyte) vào ống cất giữ - Do khoảng cách từ mặt nitơ lỏng đến miệng bình nitơ
- Đặt các ống cất giữ trên vào bình nitơ sao cho các mao quản cách mặt nitơ lỏng 20cm
- Thả từ từ các mao quản xuống khoảng 3 cm/5 phút
- Khi mao quản đã chìm vào trong nitơ lỏng thì thả hẳn xuống 3.2.2.4 Quy trình giải đông các Iymphocyte từ nitơ lỏng: - Lấy các mao quản từ nitơ lỏng ra cho ngay vào nước 370C - Rửa tế bào 3 lần bằng RPMI (1y tâm 2000 v/phút x 10 phút) - Loại bỏ phần nước nổi chứa DMSO thu lại cặn tế bào
- Kiểm tra tỷ lệ sống chết các Iymphocyte bằng xanh Trypan 0,2%
3.2.3 Các xét nghiệm phụ trợ khác:
- Tìm ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật giọt đặc
Trang 28Bao cio nghiim thu De tai
4.1 Hoan chinh kf thuat:
4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1.1 Lựa chọn, hoàn chỉnh kỹ thuật chiết tách DNA:
Bảng 4.1: Kết quả tách DNA bằng 3 phương pháp khác nhau Độ tỉnh khiết (OD260/280) | Hàm luong (ug/ml) Phương pháp n x‡G n x‡+G Phương pháp I 14 1,64+ 0,12 14 890,6 + 629,4 Phương pháp H 14 1,83 + 0,33 14 601,1 + 512,9 Phương pháp II 14 1,81+0,14 14 | 1046,5 + 473,6 ¬ Paya) < 9,05 Paya > 0,05 Pp Paya) < 9,05 _ Payay> 0,05 Peyay> 0,05 Poya) < 9,05
Ghi cht: + Phương pháp I: Phenol/chloroform
+ Phương pháp H: Salting out
+ Phương pháp II: Salting out cải tiến
1.85 f T[m op2eor2ao 18 1200 EINONG DO} 4946.5 1.8 100077 3 1.75 s00+1TÝ : 1.7 601.1 = 600 1.65 46 400 4.55 20071 Ê 1.5 0am PPI PP II PP III PP I PPH = PP Ii
Do tinh khiét DNA Hàm lượng DNA (ug/ml)
Biểu đồ 4.1: Độ tinh khiết và hàm lượng DNA của 3 phương pháp
Trang 29Bao cio nghiéim thu Dé tai
Nhận xét:
- Chiết tách DNA bằng phương pháp Salting out cải tiến cho lượng
DNA nhiéu hon và tỉnh khiết
Lấy ngẫu nhiên 5 mẫu của 3 phương pháp trên kiểm tra DNA bằng
điện di trên Agarose 0,7% ở hiệu điện thế 100V/30 phút
DNA
Ảnh 4.1: Điện đi kiểm tra DNA sau khi chiết tách
Trong đó: Mẫu số 1: Phương pháp Phenol/Chloroform
Mẫu số 2, 3: Phương pháp Salting out
Mẫu số 4, 5: Phương pháp Saltng out cải tiến
Trang 30đáo cio nghiém thu Dé tai 4.1.2 Tach lymphocyte: Bảng 4.2: Tỷ lệ sống chết của Iymphocyte trước lúc bảo quản Số mẫu Số lượng tế bào (x10’té bao/ml) % chet 01 1,2 2,0 02 1,5 1,2 03 1,4 1,8 04 1,5 0,5 05 1,2 1,0 06 1,3 1,1 07 1,1 0,8 08 1,2 1,5 09 1,0 0,7 10 1,2 2,0 11 1,3 1,7 12 1,4 1,6 13 1,2 2,5 14 1,4 2,2 15 1,1 1,0 Trung binh 1,27 + 0,15 1,44 + 0,59 Nhận xét:
Tỷ lệ chết trung bình của lymphocyte sau khi tách ra khỏi máu toàn
phần: 1,44 + 0,59 Tỷ lệ chết của lymphocyte ở tất cả các mẫu < 5%: đủ
điều kiện để tiến hành bảo quản
Trang 31Béo edo aghiém thu Dé tai
4.2 Kết quả nghiên cứu:
4.2.1 Két qua kiém tra lymphocyte sau khi bdo qudn:
* Kết quả kiểm tra lymphocyte sau 1 tháng ở nitơ lỏng:
Bảng 4.3: Tỷ lệ chết của tế bào sau 01 tháng có Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ chết (%) Số mâu Quy trình I Quy trình H 01 52,2 57,8 02 45,7 51,7 03 48,1 59,8 04 48,3 52,9 05 42,8 55,8 06 49,5 51,2 07 50,8 55,1 08 53,7 49,6 09 51,8 53,4 10 42,7 51,8 11 41,5 41,2 12 38,2 49,5 13 36,7 48,7 14 43,8 51,0 15 41,2 46,2 Trung binh 45,80 + 5,29 51,71 + 4,43 P <0,05 Nhận xét:
Sau 1 thang bao quan có 45,80 + 5,29 (%) Iymphocyte bị chết ở quy trinh I, 51,71 + 4,43 (%) lymphocyte chết ở quy trình II
Trang 324.2.2 Kết quả chiết tách DNA người Mường:
Bảng 4.4: Kết quả chiết tách DNA của 107 mẫu người dân tộc Mường
n xio
Dé tinh khiét (OD260/280) | 107 1,70 + 0,16 Ham luong (ug/ml) 107 197,40 + 145,59
Chú thích:
Hàm lượng DNA ở trên là của dung dịch đã được pha loãng 5 lần Nhận xét: Chất lượng DNA chiết tách tốt, đáp ứng yêu cầu của kỹ thuật PCR và lưu giữ
4.2.3 Kết quả kiểm tra DNA sau 12 tháng bảo quản ở -70°C:
Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra 20 mẫu sau thời gian bảo quản 12 tháng n xto Độ tỉnh khiết (OD260/280) 20 1,75+0,19 Hàm lượng (tig/m]) 20 203,1 + 169,34 Chú thích: Hàm lượng DNA ở trên là của dung dịch đã được pha loãng 5 lần Nhận xét:
Sau 12 tháng bảo quản ở -70°C, chất lượng và số lượng của DNA vẫn xấp xi khi mới chiết tách
Trong số 107 mẫu DNA bảo quản, kiểm tra ngẫu nhiên 4 mẫu 3, 35, 57, 86 bằng điện di trên Agarose 0,7%,
Trang 33Béo eho nghiém thu Dé tai 86 57 35 DNA Ảnh 4.2: Điện đi kiểm tra DNA sau khi bảo quản 12 tháng ở -70°C 4.3 Kết quả các xét nghiệm phụ trợ:
Đối tượng nghiên cứu là người dân tộc Mường ở vùng sâu và xa thị xã đã được điều tra phỏng vấn chọn lựa Để góp phần nhỏ phục vụ con em
dân tộc, đồng thời tranh thủ thời gian và vật liệu để đóng góp thêm cho các
Trang 34Béo cio nghiém tha Dé tai % 25 20 15 40 [m HBsAg(+)
Lop 10 Lop 11 Lop 12 Tong
Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ mang HBsAg ở học sinh dân tộc Mường
Nhận xét:
Tỷ lệ có HBsAg (+) của 115 học sinh phổ thơng dân tộc tỉnh Hồ Bình: 17,4 %, xấp xi với các kết quả nghiên cứu của một số tác g1ả trong nước 4.3.2 Đáp ứng với vacxin chống HEV (Engerix-B):
Bảng 4.7: Kết quả đáp ứng với vacxin viêm gan B ở học sinh dân tộc Mường Đáp ứng không tốt Đáp ứng tốt Lớp n Đáp ứng kém | Không đáp ứng n % n % n % 10 26 22 84,6 2 7,7 2 7,7 11 28 25 89,3 2 7,1 1 3,6 12 15 13 86,7 0 0 2 13,3 , 4 5,8% 5 7,2% Tong 69 60 87% 9 (13%) Quy dinh:
- Đáp ứng tốt khi nồng d6 anti HBsAg 2 1OmUI/ml
- Đáp ứng không tốt khi nồng d6 anti HBsAg < 1O0mUI/ml, trong dé: + Dap tmgkém_ : 1 < [anti HBsAg] < 10 mUI/ml
+ Không đáp ứng : [anti HBsAg] < ImUI/ml
Trang 35(đáa cáo nghiệm thu Dé tai Nhận xét: Sau 3 mũi tiêm vacxin Engerix B, đáp ứng tốt (> 10 mUl/ mI):87%, còn 13% đáp ứng kém hoặc không đáp ứng 4.3.3 Tỷ lệ mang KST sốt rét: Bang 4.8: Tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng sốt rét n Âm tính Kiểm tra KST SR 376 376 (100%) Nhận xét:
Không phát hiện được trường hợp nào mang ký sinh trùng sốt rét
Trang 36Béo cio nghiétm thu Dé tài
Nhận xét:
- Trong số 376 học sinh dân tộc tỉnh Hoà Bình được xét nghiệm: Có
9,3% thiếu GóPD
4.4 Sử dụng DNA chiết tách được của dân tộc Mường:
- Xác định các kháng nguyên HLA, xác định các alen của 3 locus: D5S8181, D7S820, D13S317 bằng PCR-STR (Short Tandem Repeat)
Kết quả sẽ được báo cáo trong Dự án Quỹ gen của GS.Vũ Triệu An -_ Xác định đột biến gen G6PD: Sẽ được tổng hợp báo cáo trong kết quả
của Đề tài nghiên cứu cấp Bộ về GóPD của PGS.TS Trần Thị Chính
- DNA của các đối tượng thiếu G6PD cũng đang được nghiên cứu về HUA tìm tần suất các alen có tỷ lệ cao của bệnh sẽ được báo cáo trong Dự án
của GS.Vũ Triệu An
Trang 37Béo cáo nghiệm tÍuu Đề tài
5 BÀN LUẬN
Chiết tách, tinh khiết DNA từ các nguồn nguyên liệu khác nhau là một bước quan trọng đầu tiên của hầu hết các phòng thí nghiệm ứng dụng các
kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu DNA đã được chiết tách từ các dịch sinh học, từ các mô của động vật có vú, các mô thực vật và từ các vị sinh vật (vi khuẩn, kí sinh trùng, virus) Chính vì vậy, đã có nhiều phương
pháp chiết tách DNA được công bố Tuỳ theo mục đích sử dụng mà yêu cầu về số lượng, chất lượng DNA chiết tách ra cũng như thời gian cần bảo quản
và hưu giữ khác nhau Ngay cả khi có cùng một nguồn nguyên liệu nhưng
tuỳ theo khả năng trang thiết bị hoá chất, tuỳ theo khả năng thực tế mà lựa chọn các phương pháp thích hợp để thực hiện có hiệu quả, phục vụ tốt nhất cho mục dich dé ra
Ở nước ta, DNA da va dang được chiết tách từ một số nguồn nguyên liệu khác nhau, đã cung cấp nguyên liệu cho các công trình nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử ở nhiều lĩnh vực
Một mặt, từ các kết quả nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài
nước về những lợi ích của việc lưu giữ lymphocyte, những hiểu biết về vai
trò của bạch cầu - vừa là nguồn cung cấp DNA phong phú, vừa thuận lợi cho nghiên cứu hệ thống gen con người Mặt khác, để phục vụ cho đề tài
nghiên cứu đặc điểm sinh học, tính đa dạng gen học của một số đồng bào
dân tộc nước ta, nghiên cứu tần suất gen một số bệnh thường gặp, căn cứ
vào trang thiết bị hiện có, chúng tôi tiến hành tách và giữ lymphocyte, chiết
tách bảo quản DNA từ bạch cầu máu ngoại vi 5.1 Tach va bao quan lymphocyte:
Giữ được lymphocyte lâu đài sẽ có một nguồn gen trong tế bào còn
nguyên vẹn giúp cho việc so sánh hệ thống gen giữa các thời kỳ Trước đây, do điều kiện khoa học kỹ thuật chưa phát triển, khi tiến hành các ca ghép thận đầu tiên, một số phòng thí nghiệm nước ta phải dùng kỹ thuật độc tế
Trang 38Bao cao nghiéim thu Dé tai
độc tế bào để xác định kháng nguyên hồ hợp mơ nữa, nghĩa là không cần
phải có các serum mẫu và các lymphocyte da xác định hệ thống kháng nguyên trước Với kỹ thuật sinh học phân tử như PCR cùng với các primer
đặc hiệu sẵn có, người ta xác định một cách nhanh chóng và chính xác các
kháng nguyên hoà hợp mô của các đối tượng cho và nhận
Tách lymphocyte từ máu ngoại vi thường không có gì khó khăn đối
với hầu hết các labo, nhưng công việc giữ lymphocyte trong một thời gian
dai để dự trữ nguồn gen trong tế bào nguyên vẹn thì lại là một công việc rất
tốn kém, đòi hỏi nhiều điều kiện và trang thiết bị kỹ thuật, trong đó thiết bị giữ lạnh phải thường xuyên hoạt động và ổn định Nếu không đảm bảo đủ các điều kiện và trang bị lưu giữ thì tỷ lệ lymphocyte sẽ chết nhiều và chết nhanh Dựa vào tài liệu của Hội thảo quốc tế về Hồ hợp mơ lần thứ XI, XI, chúng tôi dùng máy Nicool 10 va Nito long dé gift lymphocyte
Từ những suy nghĩ và thực tế về nhu cầu lưu giữ lymphocyte không còn như trước đây, mặt khác điều kiện thiết bị và kinh phí không cho phép, chúng tôi chỉ tiến hành tách và giữ lymphocyte trong thời gian 01 tháng nhằm chuẩn bi cho viéc bao quan lymphocyte thdi gian dài khi có tương đối đủ các điều kiện cần thiết
Kết quả thu được: Sau khi tách lymphocyte ra khỏi máu chống đông
bằng ficoll, điều chỉnh để có khoảng 10” tế bào/mmỶ, xác định tỷ lệ sống
chết của lympho Két qua (bang 4.2): tỷ lệ tế bào chết từ 0,5 đến 2,5%,
trung bình 1,44%+0.59, nghĩa là các mẫu đạt yêu cầu lưu giữ (tỷ lệ chết
<5%)
Sau một tháng bảo quản theo 2 quy trình: trên máy Nicool-10 với chương trình định sẵn và bằng nitơ lông, kiểm tra lại tỷ lệ sống chết của Iymphocyte Kết quả (bảng 4.3): quy trình 1: tý lệ chết 45,8%+5,29; quy trình 2: tỷ lệ chết 51,7%+4,43 Như vậy sau 1 tháng lưu giữ với điều kiện trên thì còn khoảng 50% các lIymphocyte còn sống Như các nước tiên tiến, để lưu giữ được lymphocyte lâu dài, nên xây dựng các ngân hàng bảo quản mô, bảo quản tế bào tại các trung tâm nghiên cứu
Trong nitơ lỏng (-196°C) các hoạt động chuyển hoá nội bào bị ngừng
Trang 39Bao cáo ngiưệm thu Dé tai
độ thường chuyển vào nitơ lỏng hoặc ngược lại (giải đông) do bị sốc nhiệt,
không lệ thuộc nhiều vào thời gian bảo quản Bên cạnh đó, đo khó khăn về kinh phí, cung cấp nitơ lỏng cũng như kinh phí cho người quản lý theo dõi, vì vậy chúng tôi tiến hành bảo quan lymphocyte trong một tháng
5.2 Chiết tách, bảo quản DNA:
5.2.1 Chọn phương pháp chiết tách DNA-
Phương pháp chiết tách DNA từ các tế bào nói chung và từ bạch cầu
nói riêng đã được nhiều tác giả công bố trên các tạp chí, chuyên đề, trong đó đáng chú ý là các phương pháp Phenol/chloroform, salúng out, muối Trimethylammonium Bromide, kit QLAamp
Một mặt đo trở ngại và lệ thuộc về việc nhập hóa chất, kit, một mặt do chi phí tốn kém, chúng tôi không triển khai được phương pháp muối
Trimethylammonium Bromide và kit QlAamp Theo Gustincich va cộng sự
(Bio.Technique 1991), (Olerup cải tiến và báo cáo ở hội thảo quốc tế lần
thứ 12 về hòa hợp mô) thì phương pháp sử dụng Trimethylammonium
Bromide cho DNA tốt phù hợp với kỹ thuật PCR Phương pháp ding kit QIAamp chiết tách DNA nhanh nhưng phức tạp vì phải sử dụng nhiều hóa chất và sử dụng cột chứa các chất có ái tính giữ DNA, sau đó phải dùng
dung dịch phản hấp phụ để thu DNA
Vì vậy, chúng tôi tiến hành chiết tách DNA từ bạch cầu theo 3 phương phap: phenol/chloroform, salting out, salting out cải tiến (theo tài liệu của hội thảo quốc tế về hòa hợp mô lần thứ 13 tại Seattle (Mỹ) để chọn ra 1 phương pháp đảm bảo chất lượng DNA, hiệu quả chiết tách và triển khai
được ở thực địa - nơi không có máy ly tâm tốc độ cao
Theo kinh nghiệm của các labo khác và theo tài liệu của Hội thảo quốc tế về Hoà hợp mô lần thứ XIH (2002) thì phương pháp phenol/chloroform cho DNA tĩnh khiết hơn cả nhưng phenol độc đối với sức khoẻ Kết quả (bảng 4.1) mà chúng tôi thu được thì mật độ quang (OĐ) của phương pháp
này thấp hơn phương pháp Salting out, có lẽ do Iy tâm không đạt tốc độ như
Trang 40Bao edo nghiétm thu Dé tai
Fam lượng DNA chiết tách được của phương pháp salting out cải tiến
nhiều bơn một cách đáng kể (trong 1ml dịch chiết tách chưa pha loãng của
phương pháp Salting out cải tiến có 1046,5+473,6ùg so với §90,6+629,4 và
601+513 của 2 phương pháp kia) Và điều quan trọng hơn là độ tỉnh khiết
của DNA đạt 1,81 (OD260/280nm) đảm bảo yêu cầu đối với kỹ thuật PCR
Dĩ nhiên, để sử dụng cho các kỹ thuật sinh học phân tử đòi hỏi độ tình khiết cao của DNA thì cần phải tiếp tục tỉnh khiết chứng
Kiểm tra DNA của một số mẫu chiết tách của 3 phương pháp bằng
điện đi trên thạch agarose đều cho 1 vạch (ảnh 4.1) Từ kết quả trên, chúng
tôi chọn phương pháp salting out cải tiến để triển khai công tác chiết tách
DNA người Mường tại Hòa Bình Phương pháp chiết tách này cũng đã được
sử dụng để chiết tách DNA người Thái tại Sơn La và hiện nay đang triển
khai cho người Tày va Nùng tại Cao Bằng (để tài quỹ gen của GS Vũ Triệu
An)
5.2.2.Kết quả nghiên cứu ở người Mường tỉnh Hòa Bình:
5.2.2.1 Chọn đối tượng:
Mục đích chính của đề tài là chiết tách bảo quản DNA của người Mường để có nguồn gen sử dụng cho các công trình nghiên cứu về sau Vì vậy, việc đầu tiên chúng tôi tiến hành điều tra phỏng vấn trực tiếp từng người theo mẫu (xin xem phụ lục) với sự hợp tác của Phòng quản lý học
sinh và Phòng y tế trường Phổ thông Dân tộc tỉnh Hòa Bình để chọn ra được
các đối tượng là người Mường (ít nhất là có các ông bà nội ngoại và bố mẹ
là dân tộc Mường) Các đối tượng mà chúng tôi chọn được hầu hết ở những