NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG QUY TRÌNH bảo QUẢN LẠNH VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN MẦU VĂN CẢNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SỸ HÀ NỘI – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN MẦU VĂN CẢNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Mã số: LUẬN VĂN THẠC SỸ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Ngơ Duy Thìn PGS.TS Nguyễn Lai Thành HÀ NỘI – 2017 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Bảo quản lạnh sâu van tim, mạch máu 1.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến mơ, tế bào q trình bảo quản lạnh 1.1.2 Phương pháp bảo quản lạnh van tim, mạch máu 1.2 Quy trình bảo quản lạnh sâu mô van tim thực nghiệm Labo công nghệ mô ghép - Đại học Y Hà Nội .8 1.2.1 Mổ lấy tim lợn .8 1.2.2 Phẫu tích lấy van tim .8 1.2.3 Quy trình xử lý bảo quản lạnh sâu van tim .9 1.3 Giải phẫu, mô học van tim khả thải ghép .10 1.3.1 Cấu trúc đại thể 10 1.3.2 Cấu trúc hiển vi 14 1.3.3 Khả thải ghép mô van tim .20 1.4 Khả sống tế bào mô van tim .21 1.4.1 Khả sống nguyên bào sợi .21 1.4.2 Khả sống tế bào nội mơ .23 1.5 Tình hình nghiên cứu bảo quản van tim giới Việt Nam .26 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu .28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Phân nhóm nghiên cứu 28 2.2.2 Mô hình nghiên cứu 29 2.2.3 Cách thức tiến hành .29 2.2.4 Đánh giá kết 32 2.2.5 Đạo đức nghiên cứu 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ .36 3.1 Kết nghiên cứu ứng dụng qui trình bảo quản van tim thực nghiệm .36 3.1.1 Kết lấy mẫu nghiên cứu 36 3.1.2 Kết thực qui trình kiểm tra vi khuẩn van tim sau lấy 38 3.1.3 Kết thực qui trình xử lý trước bảo quản lạnh 38 3.1.4 Kết thực qui trình bảo quản lạnh 39 3.2 Kết đánh giá chất lượng van tim sau bảo quản 40 3.2.1 Kết quản xét nghiệm vi sinh 40 3.2.2 Hình thái đại thể 41 3.2.3 Hình thái vi thể mơ van tim nhóm bảo quản 42 3.2.4 Hình thái siêu vi thể 45 3.2.5 Chất lượng sống tế bào mô van tim .47 Chương 4: BÀN LUẬN .48 4.1 Bàn luận kết thực quy trình xử lý bảo quản mô van tim 48 4.1.1 Lấy xử lý van tim trước bảo quản 48 4.1.2 Phương pháp bảo quản 53 4.2 Chất lượng van tim sau bảo quản .54 4.2.1 Chất lượng mô van tim sau bảo quản .54 4.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng mô van tim sau bảo quản 60 KẾT LUẬN 64 KHUYẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CPA : Cryoprotectant agents /Chất bảo vệ lạnh DMEM : Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMSO : Dimethylsulphoxide FBS : Fetal bovine serum / Huyết bào thai bò H.E : Hematoxyline Eosin M199 : Medium 199/ Mơi trường 199 RPMI-1640 : Roswell Park Memorial Institute medium 1640 TEM : Transmission electron microscopy/ Hiển vi điện tử xuyên DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết thực qui trình lấy mơ van tim lợn 37 Bảng 3.2 Kết thực qui trình kiểm tra vi khuẩn .38 Bảng 3.3 Kết thực qui trình xử lý trước bảo quản 39 Bảng 3.4 Kết thực qui trình xử lý trước bảo quản 39 Bảng 3.5 Kết thực qui trình rã đông sau bảo quản 39 Bảng 3.6 Kết cấy khuẩn mẫu van tim bảo quản bước lấy tim, xử lý van tim bảo quản 40 Bảng 3.7 Kết cấy nấm mẫu van tim bảo quản công đoạn lấy tim, xử lý van tim bảo quản 40 Bảng 3.8 Tổng hợp kết quan sát cấu trúc đại thể van tim nhóm nghiên cứu 41 Bảng 3.9: Tổng hợp kết quan sát cấu trúc vi thể van tim nhóm nghiên cứu tiêu nhuộm H.E nhuộm Masson 44 Bảng 3.10: Kết tỷ lệ sống ngun bào sợi mơ van tim nhóm bảo quản lạnh sâu 47 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ biểu thị nguyên nhân gây chết tế bào trình bảo quản lạnh Hình 1.2 Cơ chế vật lí biến đổi tế bào mức nhiệt độ khác bảo quản lạnh Hình 1.3: Các loại chất bảo vệ lạnh tỷ lệ sống tế bào sau rã đông 72 Hình 1.4: Hệ thống van tim .10 Hình 1.5: Hình vẽ van tim cắt dọc 14 Hình 1.6: (a) Cắt dọc gốc động mạch chủ từ van đến tâm nhĩ (b) Hình ảnh phóng to lớp F: lớp sợi; S: lớp xốp lamina; R: lớp gốc 14 Hình 1.7: Hình ảnh sợi collagen sợi chun van động mạch chủ kính hiển vi quang học (A) hiển vi điện tử quét (B) 15 Hình 1.8 Hình ảnh tiêu nhuộm H-E lớp van tim 16 Hình 1.9: Hình ảnh nhuộm hóa mơ miễn dịch mô van động mạch chủ với kháng thể tế bào trơn alpha-actin Các mũi tên sợi 20 Hình 2.1 Sơ đồ mơ hình nghiên cứu .29 Hình 2.2: Lấy ba van làm mẫu nghiên cứu 30 Hình 2.3: Sơ đồ lấy mẫu van tim nghiên cứu 30 Hình 3.1: Hình ảnh đại thể mô van tim trước bảo quản sau bảo quản lạnh 41 Hình 3.2: Hình ảnh vi thể mô van tim sau bảo quản tháng mơi trường có FBS .42 Hình 3.3: Hình ảnh vi thể mô van tim sau bảo quản tháng 43 Hình 3.4: Hình ảnh hiển vi điện tử xuyên mô van tim sau bảo quản tháng 45 Hình 3.5: Hình ảnh hiển vi điện tử xuyên mô van tim sau bảo quản tháng 46 Hình 3.6 Sợi collagen mơ van tim bảo quản lạnh tháng 46 Hình 3.7: Hình ảnh nhuộm Trypan Blue nguyên bào sợi mô van tim trước sau bảo quản 47 ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh lý tim mạch, có bệnh van tim gia tăng giới Mỗi năm có gần 300.000 người cần thay van tim, dự báo lên tới 850.000 người trước năm 2050 [1] Có loại van tim sử dụng thay van bệnh lý là: van học van sinh học bao gồm: van nhân tạo sinh học từ động vật van đồng loài (homograft) Thực tế, van sinh học ưu tiên sử dụng trung tâm phẫu thuật tim mạch giới [2] Ví dụ Đức, năm 2008 tổng số 12000 bệnh nhân có tới 78% bệnh nhân ghép van sinh học, 21% ghép van học 1% van sửa[3] Van nhân tạo sinh học có nguồn gốc từ động vật lợn, bò , qua khâu xử lý, có ưu điểm phải sử dụng thuốc chống đơng, lại có thời gian sử dụng ngắn, khoảng 6-8 năm người trẻ tuổi Để giải tình trạng này, nhiều nhà khoa học sử dụng van tim từ người cho chết não, tế bào sống để ghép đồng lồi Trong giai đoạn đầu kỹ thuật ghép van tim tươi – tức lấy van + bảo quản tươi + sử dụng vòng tuần Tuy nhiên, việc lấy ghép van tim tươi từ người cho chết não thường bị động, mô van tim sống thời gian ngắn Vì việc chuẩn bị bệnh nhân để ghép phải khẩn trương Trong nhiều trường hợp kích thước van tim người cho người nhận không phù hợp Để khắc phục tượng này, nhằm chủ động nguồn cho nguồn nhận, nhiều nhà khoa học giới nghiên cứu quy trình bảo quản van tim phục vụ cấy ghép đồng loài Việc bảo quản van tim, mạch máu nhằm giúp cho bác sỹ lâm sàng có nguồn van tim dự trữ với để sử dụng cách chủ động phù hợp với kích cỡ, chủng loại bệnh nhân cần thay Van tim lấy từ đồng lồi vừa khơng cần dùng thuốc chống đơng, lại sử dụng tới 20 năm thối hóa, có ưu vượt trội van tim nhân tạo khác Trên giới có nhiều qui trình bảo quản van tim, mạch máu với nhiều mục đích khác Để sử dụng lâm sàng, van tim sau bảo quản lạnh cần phải đảm bảo yêu cầu khơng biến đổi cấu trúc hình thái khả sống tế bào Nhằm nghiên cứu, ứng dụng qui trình bảo quản lạnh van tim đánh giá hiệu thơng qua chất lượng van tim sau bảo quản, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo quản lạnh van tim thực nghiệm” với hai tiêu: Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo quản lạnh van tim thực nghiệm Bước đầu đánh giá chất lượng mô van tim lợn sau bảo quản lạnh sâu Đây phần đề tài cấp Bộ y tế phê duyệt : “Nghiên cứu xây dựng quy trình lấy, bảo quản ghép van tim đồng loại” Chương TỔNG QUAN 1.1 Bảo quản lạnh sâu van tim, mạch máu[50] Bảo quản lạnh sâu mô, tế bào đưa chúng vào trạng thái đông lạnh thời gian dài Nhiều nghiên cứu chuyển hóa ngừng lại mơ, tế bào điều kiện nhiệt độ thấp Tại điều kiện này, enzym phân hủy protein bất hoạt, mơ, tế bào khơng bị phá hủy Ở âm 196 độ C (nhiệt độ ni tơ lỏng), phản ứng xảy ra, hoạt động bên tế bào ngừng lại Có nhiều khái niệm bảo quản lạnh sâu, nhiên đa phần lấy mốc - 40 độ C 1.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến mô, tế bào trình bảo quản lạnh Trong trình bảo quản lạnh, hai yếu tố dẫn đến tổn thương gây chết tế bào: - Yếu tố vật lí: tinh thể đá với nhiều góc cạnh đâm trực tiếp bào màng tế bào Sự nước tế bào làm cho tế bào co nhỏ, lắng đọng chất hòa tan - Yếu tố sinh học: tế bào không nuôi dưỡng khỏi 57 hóa mơ miễn dịch (các kháng thể kháng lại collagen typ I, III, IV elastin) phân tích hình ảnh huỳnh quang đa phổ, tác giả nhận thấy có tổn thương đáng kể, suy giảm lên cấu trúc sợi collagen sợi chun Tác giả đưa khuyến nghị cần thêm nghiên cứu đánh giá chi tiết bất lợi mặt sinh học lâm sàng ảnh hưởng này, ngồi cần tối ưu hóa bước phương pháp bảo quản lạnh sâu thông thường hay thử nghiệm phương pháp bảo quản thủy tinh hóa [94] Năm 2007, Schenke-Layland, K tiếp tục nghiên cứu việc tối ưu hóa bảo quản van tim lên cấu trúc ngoại bào, tác giả thử nghiệm bảo quản phương pháp thủy tinh hóa Một lần tác giả khẳng định tác động phương pháp bảo quản lạnh sâu thơng thường khó tránh khỏi, phương pháp thủy tinh làm độ bền van cao suy van cần đánh giá chi tiết cụ thể [95] Kết Amiger (1985) nghiên cứu 16 van tim từ người cho chết não bảo quản lạnh sâu nitơ lỏng cho thấy hình thái siêu vi thể nguyên bào sợi thay đổi khác nhau, tổn thương gặp mức độ, đặc biệt sau thời gian bảo quản dài ngày Hình ảnh siêu vi thể nguyên bào sợi sau bảo quản năm cho thấy nhân teo, nhân đông tăng đậm độ điện tử, màng nhân bị tách, xuất khoảng sáng quanh nhân, bào tương không rõ, màng tế bào, bào quan tổn tương màng, dãn rộng Các ti thể mào, khơng cấu trúc bình thường[9] Tuy nhiên nhiều phương pháp đánh giá trực tiếp khả sống nguyên bào sợi ngày xác thuận tiện [96, 97] việc sử dụng hình thái siêu vi thể phân tích đánh giá khả sống, tổn thương nguyên bào sợi sau bảo quản tỏ ưu thể nhằm mục đích bổ sung vấn đề 58 Khả sống tế bào van tim sau bảo quản yếu tố liên quan trực tiếp đến tuổi thọ van tim sau ghép, nguyên bào sợi tế bào nội mô loại tế bào quan trọng Các nghiên cứu giới chủ yếu tập trung đánh giá khả sống nguyên bào sợi – loại tế bào đóng vai trò sản xuất collagen, trì cấu trúc ngoại bào có vai trò định đến tuổi thọ van sau ghép [40] Có nhiều phương pháp sử dụng để đánh giá khả sống nguyên bào sợi như: nuôi cấy nguyên bào sợi đánh giá mức độ tăng sinh; phân lập nguyên bào sợi nhuộm tiêu đánh giá sống chết tế bào; phương pháp đo dòng chảy tế bào; đánh giá gián tiếp qua khả sản xuất collagen [96, 97] Vì điều kiện có hạn phạm vi đề tài, sử dụng phương pháp đánh giá khả sống tế bào cách phân lập tế bào nhuộm Trypan Blue Quy trình tách tế bào chúng tơi thực bước, bước đầu loại bỏ tế bào nội mô Trypan blue tổng hợp lần nhà khoa học người Đức Paul Ehrlich năm 1904 Trypan blue thuốc nhuộm axit màu xanh có chứa hai nhóm chức azo loại bỏ hầu hết tế bào sống.Các tế bào sống, không cho thuốc nhuộm vào tế bào, ngược lại tế bào chết thấm bắt màu thuốc nhuộm có màu xanh Tuy nhiên phương pháp nhuộm phân biệt tế bào chết bảo quản hay chết chết theo chương trình (apotosis) Trong nghiên cứu chúng tôi, tỷ lệ sống nguyên bào sợi nhóm bảo quản sau tháng 40.5 ± 0.7% Tỷ lệ sống nguyên bào sợi nhóm bảo quản sau tháng giảm nhẹ 40 ± 0.5% Kết tương đồng với Niwaya K (1993) với tỷ lệ sống nguyên bào sợi sau bảo quản tháng 50.3 ± 3.7%, tác giả sử dụng tốc độ hạ nhiệt độ -1°C/phút đến -80°C sử dụng DMSO chất bảo vệ lạnh với tỷ lệ 10% [74] 59 I Kashima (1999) phương pháp đo dòng chảy tế bào đánh giá khả sống nguyên bào sợi sau bảo quản lạnh sâu (-80°C) cho tỷ lệ sống 12.8 ± 1.4% với thời gian bảo quản 12 tuần Kết thấp hẳn kết chúng tơi tác giả sử dụng tốc độ làm lạnh -1°C/phút từ 4°C đến - 40°C - 5°C/phút từ -40°C đến -80°C [96] Nhiều tác giả ngân hàng mô van tim giới thống tốc độ làm lạnh -1°C/phút phù hợp với việc bảo quản mô van tim tốc độ làm lạnh lớn -1°C/phút làm giảm khả sống nguyên bào sợi [42],[8],[19] Rendal Vázquez (2004) nghiên cứu khả sống tế bào mô van tim mà cụ thể nguyên bào sợi sau bảo quản lạnh sâu với phương pháp đo dòng chảy tế bào cho kết khoảng 56% nguyên bào sợi sống sau thời gian bảo quản tuần Sự khác biệt 40 mẫu van tim lợn tác giả lấy với khoảng thời gian thiếu máu nóng - tức nhanh sau tim ngừng đập, lúc tác động yếu tố vi khuẩn, thiếu oxy, độc tố sinh rối loạn chuyển hóa chưa ảnh hưởng nhiều Mặt khác thời gian đánh giá khả sống nguyên bào sợi tác giả tuần sau bảo quản, nhỏ nhiều so với mốc tháng tháng Thêm việc xác định sống/ chết nguyên bào sợi phương pháp đo dòng chảy tế bào nhạy hẳn so với phương pháp nhuộm Trypan Blue chúng tôi, với phương pháp nguyên bào sợi chết hoại tử ghi nhận, bỏ qua nguyên bào sợi chết trình chết theo chương trình, nhuộm Trypan Blue hồn tồn khơng làm được; ngồi đọc kết sống chết tế bào tiêu nhuộm Trypan Blue cần phải tiến hành nhanh vi thời gian lâu tê bào chết nhiều làm sai lệch kết nghiên cứu [76], [97] Nghiên cứu Suh H (1999) đánh giá khả sống nguyên bào sợi theo phương pháp nhuộm Trypan Blue cho kết 55.9±7.9% nguyên bào sợi sống sau thời gian bảo quản 36 [40] 60 Như vậy, việc đánh giá cấu trúc đại thể, vi thể, siêu vi thể tỷ lệ sống nguyên bào sợi mơ van tim, chúng tơi nhận thấy tình trạng mô van tim sau bảo quản Lab Bảo quản mô – Đại học Y Hà Nội với khoảng thời gian tháng tháng cho kết tốt so với mẫu chứng tươi phù hợp với kết bảo quản ngân hàng mô khác giới 4.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng mô van tim sau bảo quản Chất lượng mơ van tim sau bảo quản chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố, Wolfinbarger L (2005) tổng hợp nghiên cứu phương pháp bảo quản lạnh sâu van tim đưa yếu tố như: nguy từ mơ van tim (mầm bệnh), thời gian thiếu máu nóng, thời gian thiếu máu lạnh, xử lý van kháng sinh trước bảo quản, nồng độ chất bảo vệ lạnh, thành phần mơi trường bảo quản, quy trình hạ nhiệt độ, nhiệt độ bảo quản, tăng nhiệt độ đột ngột bảo quản, phương pháp rã đơng pha lỗng DMSO, thời gian bảo quản [98] Do việc tham khảo kỹ đặc điểm bước quy trình bảo quản lạnh sâu van tim nghiên cứu giới để phù hợp với khả điều kiện mình, chúng tơi xây dựng quy trình bảo quản trình bày mục 4.1.2, điều nhiều tác giả thống áp dụng Dưới chúng tơi phân tích kỹ số yếu tố Lựa chọn nhiệt độ bảo quản -80°C máy lạnh học, -135°C với pha nitơ -196°C nitơ lỏng đảm bảo chất lượng mô van tim, hay câu hỏi đặt liệu bảo quản mô van tim -80°C mà đảm bảo chất lượng bảo quản hay không Trong nghiên cứu trước đó, mơ van tim bảo quản lạnh sâu theo quy trình: lựa chọn mơi trường bảo quản chứa DMSO, FBS, lựa chọn chương trình làm lạnh với tốc độ -1°C/phút, bảo quản nhiệt độ -80°C Kết thu cho thấy điều kiện bảo quản làm giảm chất lượng mô van tim so với quy trình bảo quản 61 lạnh sâu nhiệt độ thấp (như pha nitơ lỏng, hay môi trường nitơ lỏng) [20] Theo Feng (1996), mô van tim bảo quản nhiệt độ -80°C sau tuần bảo quản có biểu suy giảm đáng kể tế bào nội mơ, trong điều kiện đó, mơ van tim bảo quản nitơ lỏng theo dõi đến sau tháng, bắt đầu có suy giảm nhẹ, năm sau chưa thấy biến đổi đáng kể thêm [16] Một nghiên cứu Armiger (1985), mô van tim bảo quản mơi trường bảo quản có DMSO, chương trình có tốc độ làm lạnh -1°C/phút, bảo quản nhiệt độ -196°C (nitơ lỏng) cho kết mô van tim bảo quản điều kiện này, thời gian dài năm chưa thấy thay đổi đáng kể hình thái vi thể mơ van tim [9] Tuy nhiên, năm 2015, Kelvin G.M cộng đưa kết luận việc bảo quản mô van tim nhiệt độ xung quanh -80°C bảo tồn thuộc tính học van tim, khơng có khác biệt đặc điểm mơ học sinh học so với mẫu mô van tim bảo quản nitơ lỏng Việc bảo quản van tim nhiệt độ -80°C làm giảm chi phí bảo quản đảm bảo tốt an toàn lao động dùng nitơ lỏng [99] Hơn lưu trữ tủ lạnh nhiệt độ -800C mang lại lợi ích thiết thực cho bác sĩ phẫu thuật Kiểu lưu trữ cho phép kiểm tra van dễ dàng xác định kích thước để lựa chọn van có kích thước phù hợp cho phẫu thuật Tốc độ làm lạnh yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả sống nguyên bào sợi sau bảo quản Nghiên cứu Van Der Kamp (1981) khẳng định tốc độ hạ nhiệt trung bình -1°C/phút tốt cho khả sống nguyên bào sợi [42] Ketheesan (1996) cho mô van tim bảo quản lạnh sâu sử dụng chương trình có tốc độ làm lạnh lớn -1°C/phút khả sống tế bào giảm rõ rệt [19] 62 Năm 2009, Quintana cộng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng việc tăng nhiệt độ trình bảo quản lạnh sâu đến hình thái vi thể mơ van tim Theo nghiên cứu này, nhóm mơ van tim bảo quản nhiệt độ -147°C bị tăng dần nhiệt độ bảo quản đến -47°C quay trở -147°C sau đó, có hình ảnh vi thể cho thấy số lượng nguyên bào sợi giảm rõ rệt chức hoạt động nghiêm trọng so với nhóm bảo quản tươi bảo quản lạnh sâu khơng bị tăng nhiệt độ Điều khiến mẫu mơ van tim nhóm khơng đủ điều kiện cho cấy ghép Đồng thời, hình ảnh vi thể nhóm tăng nhiệt độ bảo quản cho thấy xếp lộn xộn mạng lưới collagen với xuất nhiều vị trí phù nề mơ kẽ [77] Một nghiên cứu khác thay đổi nhiệt độ bảo quản ảnh hưởng đến cấu trúc chức mô van tim Bessone tiến hành năm 2011 cho kết tương tự Quintana (2009) Các nguyên bào sợi bị tổn thương nghiêm trọng hình thái (số lượng giảm nhiều, màng tế bào bị tổn hư hại) chức hoạt động (giảm khả tiêu thụ oxy), sợi collagen xếp vô tổ chức, đặc biệt ty thể nhiễm sắc thể bị thay đổi Những điều cho thấy tăng nhiệt độ q trình bảo quản lạnh sâu gây biến tính nghiêm trọng đến cấu trúc chức tế bào mô van tim [100] Vì vậy, phạm vi nghiên cứu khả mình, chúng tơi chia van tim thành phần tương ứng van bảo quản thười gian kahcs nhau, nhằm đánh gia tác động thời gian bảo quản lên chất lượng van tim Thời gian bảo quản dài, tất nhiên chất lượng mô van tim sau bảo quản dễ bị ảnh hưởng [96] Trên nghiên cứu chúng tơi, cấu trúc vi thể nhóm bảo quản tháng có mật độ nguyên bào sợi thấp so với nhóm chứng, nhóm bảo quản tháng gần khơng có khác biệt Các tiêu chí lại liên tục lớp tế bào nội mô, phù nề mô kẽ hay xếp sợi collagen cho thấy khơng có khác biệt nhóm bảo quản tháng 63 tháng Điều cho thấy tác động thời gian bảo quản lên cấu trúc vi thể mô van tim nghiên cứu không nhiều Khảo sát kỹ tỷ lệ sống nguyên bào sợi sau bảo quản cho thấy, nhóm bảo quản tháng có giảm nhẹ tỷ lệ sống (khoảng 40%) so với nhóm bảo quản tháng (khoảng 41%) Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Nếu trình bảo quản, nhiệt độ giữ nguyên ổn định ảnh hưởng lên chất lượng mơ van tim Vì theo nguyên lý, nhiệt độ âm sâu, chuyển hóa tế bào gần không xảy ra, tức tế bào trạng thái ngủ tiềm tàng, khơng có tác động từ bên ngồi chất lượng mơ van tim khơng bị ảnh hưởng, có ảnh hưởng chết tế bào theo chương trình định sẵn Nghiên cứu củaV.Mirabet (2008) cho thấy cấu trúc vi thể khả sống nguyên bào sợi mô van tim không bị ảnh hưởng với thời gian bảo quản trung bình 9.1±1.6 năm[101] KẾT LUẬN Sau ứng dụng qui trình bảo quản thành cơng van tim thực nghiệm, đánh giá chất lượng van tim sau bảo quản thời điểm tháng, rút kết luận sau: Quy trình bảo quản lạnh sâu mơ van tim thực nghiệm gồm bước: 64 - Lấy mô van tim thời gian thiếu máu nóng, tối đa 10 phút Kiểm tra vi khuẩn, nấm Rửa dung dịch NaCl 0,9% vơ khuẩn có bổ sung Heparin, Papaverin - Ngâm hỗn hợp kháng sinh: Penicillin, Streptomycin, Cefuroxim, Lincomycin, Amphotericin B 4°C 24 - Đưa vào môi trường bảo quản RPMI 1640, 10% DMSO, hạ nhiệt độ theo chương trình, tốc độ -1°C/phút - Bảo nhiệt độ ổn định -80°C - Rã đông nhanh điều kiện 37 độ C Chất lượng mô van tim sau bảo quản: - 100% mẫu mô sau bảo quản vô khuẩn - Cấu trúc đại thể vi thể mô van tim sau bảo quản tháng tháng khơng khác biệt khơng khác biệt so với nhóm chứng - Van tim bảo quản tháng có biến đổi nhân bào quan nguyên bào sợi, khơng có biến đổi thành phần sợi collagen sợi chun - Tỷ lệ sống nguyên bào sợi nhóm bảo quản tháng cao nhóm tháng KHUYẾN NGHỊ Trong thời gian tháng, mơ van tim bảo quản -80°C đảm bảo chất lượng cấu trúc, hình thái, khả sống tế bào Những tiêu tham khảo để ứng dụng lâm sàng TÀI LIỆU THAM KHẢO Yacoub, M.H., Takkenberg, J.J.M, Will heart valve tissue engineering change the world? Nat Clin Pract Cardiovasc Med, 2005 2: p 60-61 Thiene G, V.M., Anticalcification strategies to increase bioprosthetic valve durability J Heart Valve Dis, 2011 20: p 37-44 GummertJF, et al., Cardíac surgery in Germany during 2007: a report on behalf ofthe German Society for Thoracic and Cardiovascu lar Surgery Thorac Cardiovasc Surg 8, 2008 56: p 328-336 Parker.R, Banking of heart valves In: Galea G (ed) Essentials of tissue banking,, 2010 1st edn: p 69-80 G, M and Homologous aortic valve segment transplants as surgical treatment for aortic and mitral insufficiency Angiology, 1956 7: p 466-471 DN, R., Homograft replacement of the aortic valve Lancet 1962 2: p 487 BG, B.-B., Homograft aortic valve replacement in aortic incompetence and stenosis Thorax, 1964 19: p 131 Gall K, et al., Alllograft heart valve sterilization: a six-year in-depth analysis of twenty-five-year experience with low-dose antibiotics J Thorac Cardiovasc Surg, 1995: p 680-687 O'Brien MF, et al., The viable cryopreserved allograft aortic valve J Card Surg, 1987 2: p 153-67 10 Kelvin G.M Brockbank, Albert E Heacox, and K Schenke-Layland, Guidance for Removal of Fetal Bovine Serum from Cryopreserved Heart Valve Processing Cells Tissues Organs, 2011 Mar 193(4): p 264-273 11 Stradins, P., et al., Comparison of biomechanical and structural properties between human aortic and pulmonary valve Eur J Cardiothorac Surg, 2004 26: p 634-639 12 Ross, D.N., Replacement of aortic and mitral valves with a pulmonary autograft Lancet., 1967 2: p 956-958 13 Anderson, et al., Anatomy of the heart Stuttgart, NY: Thieme 1982 14 Hokken, R.B., et al., Morphology of the pulmonary and aortic roots with regard to the pulmonary autograft procedure J Thorac Cardiovasc Surg, 1997 113: p 453-461 15 Anderson, R.H., Clinical anatomy of the aortic root Heart, 2000 84: p 670-673 16 Yacoub, M.H., et al., The aortic outflow and root: a tale of dynamism and crosstalk Ann Thorac Surg, 1999 68: p S37-S43 17 McAlpine, W.A., Heart and coronary arteries 1975 18 Anderson, R.H., et al., The myth of the aortic annulus: the anatomy of the subaortic outflow tract Ann Thorac Surg., 1991 52: p 640-646 19 Anderson, et al., Anatomy of the aortic root with particular emphasis on options for its surgical enlargement J Heart Valve Dis, 1996 5: p S249-S257 20 Underwood, M.J., et al., The aortic root: structure, function, and surgical reconstruction Heart, 2000 83: p 376-380 21 Muriago, M., et al., Location of the coronary arterial orifices in the normal heart Clin Anat, 1997 10: p 297-302 22 Furukawa, et al., Does dilatation of the sinotubular junction cause aortic regurgitation? Ann.Thorac Surg, 1999 68: p 949-953 23 Clark, R.E., & Finke, and E H., Scanning and light microscopy of human aortic leaflets in stressed and relaxed states J Thorac Cardiovasc Surg, 1974 67: p 792-804 24 Clark, R.E and E.H & Finke, The morphology of stressed and relaxed human aortic leaflets Trans Am Soc Artif Intern Organs, 1974 20: p 437-448 25 Vollebergh, F E., and A.E & Becker, Minor congenital variations of cusp size in tricuspid aortic valves Possible link with isolated aortic stenosis Br Heart J, 1977 39: p 1006-1011 26 Silver, M.A and W.C & Roberts, Detailed anatomy of the normally functioning aortic valve in hearts of normal and increased weight Am J Cardiol, 1985 55: p 454-461 27 Kunzelman, K.S., et al., Aortic root and valve relationships Impact on surgical repair J Thorac.Cardiovasc Surg, 1994 107: p 162-170 28 Benninghoff, A., A Hartmann, and T & Hellmann, Handbuch der mikroskopischen Anatomie des Menschen 1930 29 Missirlis, Y.F and C.D & Armeniades, Ultrastructure of the human aortic valve Acta Anat, 1977 98: p 199-205 30 Peskin, C.S and D.M & McQueen, Mechanical equilibrium determines the fractal fiber architecture of aortic heart valve leaflets Am J Physiol, 1994 266: p H319-H328 31 Dreger, S.A., et al., Immunohistochemical characterization of the interleaflet triangle of the human aortic valve J Heart Valve Dis, 2003 28 32 Sauren, A.A., et al., Aortic valve histology and its relation with mechanics-preliminary report J Biomech, 1980 13: p 97-104 33 Deck, J.D., Endothelial cell orientation on aortic valve leaflets Cardiovasc Res, 1986 20: p 760-767 34 Gross, L and M & Kugel, Topographic anatomy and histology of the valves in the human heart Am J Pathol, 1931 7: p 445-473 35 Scott, M and I & Vesely, Aortic valve cusp microstructure: the role of elastin Ann Thorac.Surg, 1995 60: p S391-S394 36 Scott, M.J and I & Vesely, Morphology of porcine aortic valve cusp elastin J Heart Valve Dis., 1996 5: p 464-471 37 Vesely, I., The role of elastin in aortic valve mechanics J.Biomech, 1998 31: p 115-123 38 Adamczyk, et al., Biaxial strain properties of elastase-digested porcine aortic valves J.Heart Valve Dis., 2000 9: p 445-453 39 Broom, N.D., The observation of collagen and elastin structures in wet whole mounts of pulmonary and aortic leaflets J Thorac Cardiovasc Surg, 1978 75: p 121-130 40 Peskin, C.S and D.M & McQueen, Mechanical equilibrium determines the fractal fiber architecture of aortic heart valve leaflets Am J.Physiol, 1994 266: p H319-H328 41 Connolly, H.M., et al., Valvular heart disease associated with fenfluramine phentermine N Engl J Med, 1997 337: p 581-588 42 Bairati Jr, A., S DeBiasi, and F & Pilotto, Smooth muscle cells in the cusps of the aortic valve of pigs Experientia., 1978 34: p 1636-1638 43 Bairati, A and S & DeBiasi, Presence of a smooth muscle system in aortic valve leaflets Anat Embryol, 1981 161: p 329-340 44 Filip, D.A., A Radu, and M & Simionescu, Interstitial cells of the heart valves possess characteristics similar to smooth muscle cells Circ.Res, 1986 59: p 310-320 45 Messier Jr, R.H., et al., Dual structural and functional phenotypes of the porcine aortic valve interstitial population: characteristics of the leaflet myofibroblast J Surg Res, 1994 57: p 1-21 46 Brown, R.A., et al., Balanced mechanical forces and microtubule contribution to fibroblast contraction J Cell Physiol, 1996 169: p 439-447 47 Weind, K.L., C.G Ellis, and D.R & Boughner, The aortic valve blood supply J Heart Valve Dis, 2000 9: p 1-7 48 Weind, K.L., C.G Ellis, and D.R & Boughner, Aorticvalve cusp vessel density: relationship with tissue thickness J Thorac.Cardiovasc.Surg, 2002 123: p 333-340 49 Fastenrath, S., Fasertextur der Aorten- und Pulmo-nalklappe des Menschen Kiel: thesis, 1995 50 S, E.M., Cryopreservation of vascular tisues Organogenesis 5, 2009 3: p 97-104 51 Else M S et al, Cryopreservation of vascular tissues Organogenesis, 2009 5(3): p 97-104 52 Yankah A C., Miller D.C., and Ross D N., in Cardiac Valve Allografts 1987, Steinkopff Verlag Darmstadt Springer-Verlag New York 53 Armitage J et al, Heart valve cryopreservation: Protocol for addition of dimethyl sulphoxide and amelioration of putative amphotericin B toxicity Cryobiology, 2004 50(2005): p 139-143 54 Armiger L.C et al, Morphololy of heart valves preserved by liquid nitrogen freezing” Thorax, 1985 40: p 778-786 55 Robert T M., Kelvin G M., and Haney L.B Method for cryopreserving heart valves, United States Patent, , 1987 US4890457 56 Moreno-Cabral CE et al, A simple technique for aortic valve replacement using freehand allograft J Cardiovasc Surg, 1988 3: p 69-76 57 O’Brien MF et al, Allograft aortic valve replacement comparative clinical analysis of the viable cryopreserved and antibiotic 40 C store valve J Cardiovasc Surg, 1991 6: p 534-543 58 Richard N M et al, Pathology of explanted cryopreserved allograft heart valves: Comparison with aortic valves from orthotopic heart transplants J Thorac Cardiovasc Surg, 1998 115: p 118-127 59 Nakayama S., Ban T., and Okamoto Y., Fetal bovine serum is not necessary for the cryopreservation of aortic valve tissues J Thorac Cardiovasc Surg, 1994 10(3): p 583-586 60 Kelvin G.M and Albert E H et al, Guidance for Removal of Fetal Bovine Serum from Cryopreserved Heart Valve Processing Cell Tissues Organs, 2011 193(3): p 264-273 61 Feng XJ., Van Hove CE., and Walter PJ., Effects of storage temperature and fetal calf serum on the endothelium of porcine aortic valves J thorac Cardiovasc Surg, 1996 111(1): p 218-30 62 Kelvin G.M et al Tissue Preservation, in Advances in Biopreservation 2006 p 157-186 63 Stacy A and David G., Optimizing tissue cryopreservation techniques for cryopreservation solution modifications Cryobiology, 2013 Vol 66(3): p 349 64 Ketheesan N., Kearney JN., and Ingham E., The effect of cryopreservation on the immunogenicity of allogeneic cardiac valves Cryobiology, 1996 33(1): p 41-53 65 Kelvin G.M et al, Effects of storage temperature on viable bioprosthetic heart valves Cryobiology, 1992 29(5): p 537-42 66 Kelvin G.M et al., Allogeneic Heart Valve Storage Above the Glass Transition at −80°C The Society of Thoracic Surgeons, 2011 91(6): p 1829-1835 67 Gatto C., Guarino A., and Buzzi M et al, Removal of DMSO from cardiovascular allografts Cell Tissue Bank, 2010 68 O’Brien MF et al A comparison of aortic valve replacement with viable cryopreserved and fresh allograft valves, with a note on chromosomal studies The Joural of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 1987 94(6): p 812-823 69 Gatto C and Dainese L., Establishing a procedure for dimethyl sulfoxide removal from cardiovascular allografts: a quantitative study Cell Tissue Bank, 2013 14(2): p 205-212 70 Armitage J W, Wayne D., and Emily A., Protocols for thawing and cryoprotectant dilution of heart valves Cryobiology, 2004 50(1): p 17-22 71 Heng, W.L., et al., International heart valve bank survey: a review of processing practices and activity outcomes J Transplant, 2013 2013: p 163150 73 Rendal Vázquez ME., Román TD., and Cuesta MG., Viability and Histologic Structure of Porcine Valves After Cryopreservation Ann Thorac Surg, 2004 77: p 186-90 74 Quintana AB., Coda Zabetta CD., and Baumgartner NO., Morphological and biochemical analysis of human cardiac valve allografts after an increment of the cryostorage temperature Cryobiology, 2009 59(1): p 96-101 ... chất lượng van tim sau bảo quản, tiến hành đề tài: Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo quản lạnh van tim thực nghiệm với hai tiêu: Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo quản lạnh van tim thực nghiệm. .. 1.1 Bảo quản lạnh sâu van tim, mạch máu 1.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến mơ, tế bào q trình bảo quản lạnh 1.1.2 Phương pháp bảo quản lạnh van tim, mạch máu 1.2 Quy trình bảo quản lạnh. .. Kết nghiên cứu ứng dụng qui trình bảo quản van tim thực nghiệm .36 3.1.1 Kết lấy mẫu nghiên cứu 36 3.1.2 Kết thực qui trình kiểm tra vi khuẩn van tim sau lấy 38 3.1.3 Kết thực