Nghiên cứu sự dimer hóa của protein rhau dung hợp được cảm ứng bởi cấu trúc g quadruplex song song

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ∞0∞ PHAN HÙNG VIỆT NGHIÊN CỨU SỰ DIMER HÓA CỦA PROTEIN RHAU DUNG HỢP ĐƯỢC CẢM ỨNG BỞI CẤU TRÚC G-QUADRUPLEX SONG SONG LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ∞0∞ PHAN HÙNG VIỆT NGHIÊN CỨU SỰ DIMER HÓA CỦA PROTEIN RHAU DUNG HỢP ĐƯỢC CẢM ỨNG BỞI CẤU TRÚC G-QUADRUPLEX SONG SONG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS ĐẶNG THANH DŨNG Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc GIẤY XÁC NHẬN Tôi tên là: Phan Hùng Việt Ngày sinh: 10/06/1983 Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Nơi sinh: Bình Thuận Mã học viên: 1884202010011 Tơi đồng ý cung cấp tồn văn thông tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh kết nối tồn văn thông tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học Sở Khoa học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Ký tên (Ghi rõ họ tên) i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn “Nghiên cứu dimer hóa protein RHAU dung hợp cảm ứng cấu trúc G-quadruplex song song” nghiên cứu tơi Ngoại trừ tài liệu tham khảo trích dẫn luận văn này, tơi cam đoan tồn phần hay phần nhỏ luận văn chưa công bố sử dụng để nhận cấp nơi khác Khơng có sản phẩm/nghiên cứu người khác sử dụng luận văn mà khơng trích dẫn theo quy định Luận văn chưa nộp để nhận cấp trường đại học sở đào tạo khác Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2021 Phan Hùng Việt ii LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Đặng Thanh Dũng PGS.TS Phan Thị Phượng Trang hướng dẫn em tồn q trình thực luận văn Cảm ơn thầy cô hướng dẫn, động viên tạo điều kiện thuận lợi để em học tập, hoàn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi để em có hội học tập, trau dồi kiến thức, tiếp cận điều kiện tốt nghiên cứu Đồng thời cảm ơn tới anh chị, bạn, em Trung tâm Khoa học Công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn, trao đổi tạo điều kiện suốt trình thực đề tài Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình ln điểm tựa vững hoàn cảnh Xin cảm ơn tất người! Phan Hùng Việt iii TÓM TẮT Nhiều protein hệ thống sống thường kết hợp với tạo thành cấu trúc oligomer giúp tăng cường tính ổn định thực chức sinh học Trong đó, nghiên cứu cho thấy protein dimer đóng góp nhiều vai trị quan trọng hoạt động sinh trưởng tế bào Vì thế, phương pháp cảm ứng tạo protein dimer đời nhằm giúp người chủ động việc điều hịa q trình sinh học tiến tới ứng dụng y học Đầu tiên, phương pháp thiết kế protein mang lại kết đáng ý dimer diễn theo chiều thuận, dẫn đến việc điều hịa hoạt tính protein bị cản trở Để khắc phục nhược điểm này, phương pháp sử dụng chất cảm ứng bên nghiên cứu phát triển Cho đến nay, nhiều chất cảm ứng khác sử dụng song vẫb tồn hạn chế định Chẳng hạn, việc sử dụng rapamycin đòi hỏi protein mục tiêu dung hợp với protein domain có kích thước lớn ảnh hưởng đến chức protein mục tiêu Trong đó, cucurbit[8]uril hệ thống chủ khách tan khó chuyển vào tế bào Vì vậy, việc tìm phân tử để cảm ứng dimer protein điều đáng quan tâm G-quadruplex phân tử có nhiều tiềm cho mục tiêu ưu điểm sau: trình tự RNA hay DNA nên gây trở ngại cho tế bào, kích thước ngắn dễ tổng hợp hóa học… Các công bố khoa học chứng minh phân tử G-quadruplex liên kết đặc hiệu với phân tử protein RHAU Kết hình thành nên ý tưởng dung hợp protein mục tiêu với đoạn peptide RHAU, sau áp dụng tương tác đặc hiệu G-quadruplex RHAU để cảm ứng dimer protein Ngoài ra, để đánh giá dimer hóa protein, sử dụng phương pháp FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) với cặp protein thị màu CFP YFP (Cyan Fluorescent Protein Yellow Fluorescent Protein) Các protein có phần quang phổ chồng lấp thỏa mãn điều kiện FRET, đồng thời chúng protein dễ biểu hiện, có ánh sáng phát quang bền dễ quan sát iv Từ nhận định trên, đề tài đặt mục tiêu “Nghiên cứu dimer hóa protein dung hợp với RHAU cấu trúc G-quadruplex song song” nhằm tìm phân tử có tiềm cảm ứng dimer protein Để hoàn thành mục tiêu trên, đề tài thực nội dung: - Dịng hóa tạo plasmid pTD14 mang gen mã hóa cho protein RHAU-YFP - Kiểm tra biểu protein RHAU-YFP E coli BL21(DE3) - Tinh chế thu nhận protein mục tiêu RHAU-YFP - Kiểm tra dimer hóa RHAU-CFP/RHAU-YFP cảm ứng cấu trúc G-quadruplex T95-2T phương pháp FRET Đề tài thực Trung tâm Khoa học Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đạt kết quả: - Tạo dịng thành cơng vector pTD14 mang gen mã hóa cho protein dung hợp RHAU-YFP - Biểu protein RHAU-YFP vi khuẩn E coli BL21 (DE3) với nồng độ chất cảm ứng 0,05 mM IPTG 16оC qua đêm - Thu nhận thành công protein RHAU-YFP cột tinh chế HisTrap - Chứng minh phân tử G-quadruplex T95-2T cảm ứng dimer hóa protein RHAU-CFP RHAU-YFP - Xác định nồng độ G-quadruplex T95-2T tối ưu cho khả cảm ứng dimer hóa cao điều kiện thí nghiệm 500 µM Về ý nghĩa, đề tài tạo mơ hình cho hệ thống cảm ứng G-quadruplexRHAU tiềm cho việc nghiên cứu dimer protein tiến tới ứng dụng protein chức tế bào v ABSTRACT The dimerization of proteins plays an important role in cellular activities such as enzyme activation, signal transmission through receptors and regulation of gene expression Methods that mediate protein dimerization are introduced and developed to help regulate biological processes G-quadruplex is a potential molecule mediating the dimerization of proteins through specifically binding to two RHAU peptides However, to date, this function of G-quadruplex has not been extensively studied In this study, we cloned vector pTD14 carrying the yfp gene fusing with RHAU peptide RHAU-YFP protein was then expressed and purified Dimerization of this protein and RHAU-CFP protein was mediated by G-quadruplex and observed by FRET reaction The results showed that RHAU-YFP protein could be expressed from the cloned vector pTD14 under the temperature of 16OC and the IPTG concentration of 0.05 mM in 24 hours The highest amount of the target protein was yielded with imidazole concentrations between 20 mM and 100 mM when purified through His-tag column The FRET reaction showed that Gquadruplex was capable of mediating the dimerization of proteins RHAU-YFP and RHAU-CFP under the experimental conditions and G-quadruplex at concentration of 500 μM for the highest dimerization ability The results can be used for further studies on the application of G-quadruplex to regulate biological processes in medical research vi MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Tóm tắt .iii Abstract v Mục lục vi Danh mục hình đồ thị ix Danh mục bảng x Danh mục chữ viết tắt xi Chương GIỚI THIỆU 1.1 Cơ sở hình thành luận văn 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Câu hỏi nghiên cứu 1.4 Phạm vi đối tượng nghiên cứu 1.4.1 Phạm vi nghiên cứu 1.4.2 Đối tượng nghiên cứu 1.5 Phương pháp nghiên cứu 1.6 Ý nghĩa nghiên cứu 1.7 Kết cấu luận văn Chương 2.1 CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU Sự dimer hóa protein 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Vai trò 2.1.3 Các phương pháp cảm ứng dimer protein 2.1.3.1 Phương pháp thiết kế protein 2.1.3.2 Phương pháp sử dụng chất bên 2.2 G-quadruplex 12 2.2.1 Cấu trúc 12 ... CATCCCGGGCACCTGAAAGGCCGCGAAATCGGCATGTGGTACGCGAAAA AACAGGGGCAGAAGAACAAGGAAGCGGAGAGGCAAGAGAGAGCTGTAGT ACACATGGATGAACGACGAGAAGAACAAATTGTACAGTTACTGAATTCTGT TCAAGCGAAG 3’ ❖ Oligo Các trình tự oligonucleotide sử dụng luận văn trình... TGCGAGATCTGGCGGCGGCAGCATGG TGAG Thu gen yfp CAGACTCGAGTTACTTGTACAGCTCGT (768 bp) CCATG TAATACGACTCACTATAGGG CAGACTCGAGTTACTTGTACAGCTCGT CCATG TAATACGACTCACTATAGGG PCR khuẩn lạc (937 bp) Giải trình tự gen Protein. .. Bảng 3.3 Bảng 3.3 Trình tự đoạn oligonucleotide Trình tự (5’ – 3’) Tên RNA T95-2T OND26 OND27 T7promoter OND27 T7promoter ❖ GGGUGGGUGGGUGGG Mục đích Tạo cấu trúc G- quadruplex TGCGAGATCTGGCGGCGGCAGCATGG