GC HPLC Carbonhydrat 1 • ðường không bay hơi, do ñó cần phải chuyển hóa thành chất bay hơi • Quá trình dẫn xuất hóa bằng phản ứng hóa học • Dạng dẫn xuất tạo ra acetates, ethyl ethers, and trimethylsi[.]
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ Gas Chromatography (Analysis for individual CHO’s) • ðường khơng bay hơi, cần phải chuyển hóa thành chất bay • Q trình dẫn xuất hóa phản ứng hóa học • Dạng dẫn xuất tạo ra: acetates, ethyl ethers, and trimethylsilyl ethers • Phương pháp dẫn xuất ñược lựa chọn phụ thuộc vào ñiều kiện nhiệt ñộ GC cần thiết cho bay dẫn xuất đường PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ Reduction to Alditol (for reducing sugars) BƯỚC: • ðường bị khử ñến alditols cách sử dụng sodium borohydride, NaBH4 (See Fig 10-7) • Khử aldehydes ketones đến alcohols bậc • Alditols (the alcohol form) sau acetylated với acetic anhydride để tạo alditol peracetates, phân tích GC (acetic acid derivatives are volatile) Phương pháp dẫn xuất khác Acetates • Xử lý sugar với acetyl chloride acetic anhydride – “Reflux” khoảng 4h với diện dung mơi hữu Methyl ethers • Xử lý sugar với either methyl iodide/silver oxide or dimethyl sulfate/NaOH TMS ethers • Xử lý sugars với pyridine a methylsilyl (silica based) media PHƯƠNG PHÁP HPLC You’ve Got a Problem to Solve I need a quantitative separation of carbohydrates in some of our products as soon as possible I’ll get on it! I’ll need a separation technique KỸ THUẬT PHÂN TÁCH I have two separation techniques in my lab, High Performance Liquid Chromatography and Gas Chromatography Which should I use? So sánh HPLC GC Tính chất bay Tính phân cực HPLC HPLC • Phân tách chất phân cực chất không phân cực • Khơng u cầu bay • Mẫu phải hịa tan pha động GC GC • Mẫu phải bay • Phân tách chất phân cực chất không phân cực So sánh HPLC GC 10 So sánh HPLC GC Nhiệt ảnh hưởng ñến mẫu HPLC Kích thước phân tử mẫu HPLC • Phân tích tiến hành nhiệt độ thấp nhiệt độ phịng • Khơng có giới hạn • Trong thực tế, độ hịa tan bị giới hạn GC GC • Mẫu phải chịu nhiệt độ cao • Thông thường < 500 amu (Da) So sánh HPLC GC Chuẩn bị mẫu Lượng mẫu HPLC HPLC • Mẫu phải lọc trước • Mẫu nên dung mơi giống pha động GC • Dung mơi phải bay hơi, thường có điểm sơi thấp chất phân tích • Kích thước mẫu phụ thuộc vào kích thước ct i.d GC ã Thng - àL So sánh HPLC GC Cơ chế phân tách Detectors HPLC HPLC • Cả pha tĩnh pha động có ảnh hưởng lên kêt phân tách • Phổ biến UV-Vis GC GC •Pha tĩnh có chức vận chuyển • Phổ biến FID, 13 Phân tích thành phần nào? Carbohydrates fructose Glucose Saccharose Palatinose Trehalulose isomaltose Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm) 70/30 Acetonitrile/Water mAU mL/min Detect=Refractive Index time 14 Phân tách Injector Separation in based upon differential migration between the stationary and mobile phases Stationary Phase - the phase which remains fixed in the column, e.g C18, Silica Mixer Pumps Mobile Phase - carries the sample through the stationary phase as it moves through the column Column Detector Waste Solvents High Performance Liquid Chromatograph Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection time Column Detector Solvents 31 The Chromatogram to - elution time of unretained peak tR- retention time - determines sample identity tR tR mAU Area or height is proportional to the quantity of analyte to 32 Injection time HPLC Analysis Parameters Mobile Phases Flow Rate Composition Injection Volume Column Oven Temperature 33 Wavelength Time Constant Modes of High Performance Liquid Chromatography Types of Compounds Mode Stationary Phase Mobile Phase Neutrals Weak Acids Weak Bases Reversed Phase C18, C8, C4 cyano, amino Water/Organic Modifiers Ionics, Bases, Acids Ion Pair C-18, C-8 Water/Organic Ion-Pair Reagent Compounds not soluble in water Normal Phase Silica, Amino, Cyano, Diol Organics Ionics Inorganic Ions Ion Exchange Anion or Cation Exchange Resin Aqueous/Buffer Counter Ion High Molecular Weight Compounds Polymers Size Exclusion Polystyrene Silica Gel FiltrationAqueous Gel PermeationOrganic 34 10 1/ SUPELCOSIL LC-NH2 Column 2/ SUPELCOGEL Columns 11 12 13 ... phân cực HPLC HPLC • Phân tách chất phân cực chất không phân cực • Khơng u cầu bay • Mẫu phải hịa tan pha động GC GC • Mẫu phải bay • Phân tách chất phân cực chất không phân cực So sánh HPLC... form) sau acetylated với acetic anhydride để tạo alditol peracetates, phân tích GC (acetic acid derivatives are volatile) Phương pháp dẫn xuất khác Acetates • Xử lý sugar với acetyl chloride acetic... HPLC GC Nhiệt ảnh hưởng ñến mẫu HPLC Kích thước phân tử mẫu HPLC • Phân tích tiến hành nhiệt độ thấp nhiệt độ phịng • Khơng có giới hạn • Trong thực tế, độ hịa tan bị giới hạn GC GC • Mẫu phải