Đang tải... (xem toàn văn)
Insulin là thuốc đầu tiên sản xuất bằng công nghệtái tổhợp gen được dùng cho người từnăm 1978. Nguyên lý của công nghệnày, cho đến nay, không có gì thay đổi nhưng bản quyền và các chi tiết kỹthuật đều được bảo hộbởi các Công ty hoặc cơsởnghiên cứu lớn; các nước muốn phát triển công nghệsản xuất insulin của riêng mình đều phải tựlàm lấy từ đầu. Vì những lý do trên, chúng tôi đềxuất nghiên cứu này, là bước khởi đầu, với hy vọng có thểsản xuất được insulin trong nước trong tương lai gần, đáp ứng nhu cầu đang tăng lên của xã hội. Nghiên cứu này nhằm mục đích: 1) thiết kếvector biểu hiện insulin và 2) chọn tếbào biểu hiện insulin.
BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp Giai đoạn 1: Thiết kế vector và chọn tế bào biểu hiện Insulin Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Lê Văn Phủng Cơ quan chủ trì đề tài: Trường đại học Y Hà Nội Mã số đề tài (nếu có): 7950 Năm 2010 2 Những chữ viết tắt ĐTĐ Đái tháo đường BMI Body Mass Index (chỉ số khối cơ thể) IDF International Diabetes Federation (Hiệp hội ĐTĐ quốc tế) PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus aquaticus TAE Tris-Acetate-EDTA (Đệm TAE) EMBL European Molecular Biology Laboratory (Phòng thí nghiệm sinh học phân tử châu Âu) DDBJ ADN Data Bank of Japan (Ngân hàng dữ liệu ADN Nhật Bản) NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin sinh học Quốc gia (Mỹ) 3 MỤC LỤC Nội dung Trang Đặt vấn đề 5 Chương 1: Tổng quan 6 1. Tình hình mắc bệnh đái tháo đường 6 2. Insulin 7 Lịch sử phát hiện 7 Cấu trúc phân tử 9 Quá trình hình thành insulin trong cơ thể 10 Cơ chế tác động của insulin 11 Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp 13 Nhu cầu insulin hiện nay 16 Pre-proinsulin và Proinsulin 18 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 1. Proinsulin 21 1.1. Vật liệu 21 1.2. Phương pháp 22 1.2.1. Khuếch đại gen proinsulin 22 1.2.2. Tạo vector mang gen proinsulin 22 1.2.3. Tạo dòng E. coli DH5a mang plasmid tái tổ hợp 22 1.2.4. Tuyển chọn thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự gen 22 1.2.5. Cảm ứng biểu hiện và phân tích bằng SDS-PAGE 23 1.2.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp và nhận dạng bằng Western blot 23 2. Đối với insulin: chuỗi A, B 23 2.1. Vật liệu 24 2.2. Hoá chất 26 2.3. Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1. Tách chiết và tinh sạch plasmid 26 2.3.2. Tạo plasmid tái tổ hợp 27 2.3.3. Phương pháp đọc trình tự 27 2.3.4. Phương pháp biểu hiện protein 28 2.3.5. Phương pháp phân tích và nhận dạng protein bằng khối phổ 28 2.3.6. Phương pháp tinh chế protein bằng sắc ký ái lực Ni- NTA 29 2.3.7. Phương pháp cắt loại bỏ đuôi His Tag 29 3. Các tế bào biểu hiện 29 3.1. Vật liệu 29 3.2. Phương pháp 29 4 Chương 3. Kết quả 30 1. Proinsulin 30 2. Chuỗi A, chuỗi B 32 3. Kết quả tế bào biểu hiện 44 Chương 4: Bàn luận 45 Kết luận 47 Kiến nghị 47 Tài liệu tham khảo 48 5 ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường là bệnh được quan tâm từ lâu trên toàn thế giới vì gánh nặng cho gia đình và xã hội mà nó gây ra. Hiện nay, trên thế giới có khoảng 263 triệu người mắc bệnh đái tháo đường và con số này tiếp tục tăng lên. Ước tính đến năm 2025, con số này sẽ lên tới 330 triệu người (gần 6% dân số toàn cầu). Tỷ lệ bệnh tăng lên (so với hiện nay) ở các nước phát triển là 42%, như ng ở các nước đang phát triển (như Việt Nam) có thể sẽ là 170% trong vòng 30 năm tới [1]. Ở Mỹ, có khoảng 14 triệu người mắc bệnh đái tháo đường; hàng năm, 250.000 bệnh nhân đái tháo đường chết vì các biến chứng của bệnh này. Ở Singapore, tỷ lệ bệnh đái tháo đường tăng lên theo thời gian: năm 1975 là 1,9%; 1984 là 4,7%; 1992 là 8,6% [2]. Ở nước ta, theo Tạ Văn Bình và cộng sự [3], tỷ lệ mắc bệnh chung trên cả nước là 2,7%; như vậy, có khoảng 2,3 triệu bệnh nhân đang mắc đái tháo đường, con số này còn tăng lên đồng hành với sự tăng trưởng kinh tế và những thay đổi về lối sống và các điều kiện sống. Đặc điểm của bệnh đái đường (đặc biệt là týp 1) là phải dùng Insulin hàng ngày và phải dùng suốt đời. Với tỷ lệ đái tháo đường như hiện nay, hàng năm cả nước phải chi một số tiền không nhỏ cho việc mua insulin (khoảng 11.000 tỷ đồng), chưa kể tiền điều trị nhiều biến chứng của nó. Ở nước ta hiện nay, toàn bộ insulin đều phải nhập ngoại; vì vậy, nếu tự sản xuất được trong nước, giá thành thuốc sẽ hạ và điều đó mang lại ý nghĩa kinh tế và xã hội không nhỏ. Insulin là thuốc đầu tiên sả n xuất bằng công nghệ tái tổ hợp gen được dùng cho người từ năm 1978. Nguyên lý của công nghệ này, cho đến nay, không có gì thay đổi nhưng bản quyền và các chi tiết kỹ thuật đều được bảo hộ bởi các Công ty hoặc cơ sở nghiên cứu lớn; các nước muốn phát triển công nghệ sản xuất insulin của riêng mình đều phải tự làm lấy từ đầu. Vì những lý do trên, chúng tôi đề xuất nghiên cứu này, là bước khở i đầu, với hy vọng có thể sản xuất được insulin trong nước trong tương lai gần, đáp ứng nhu cầu đang tăng lên của xã hội. Nghiên cứu này nhằm mục đích: 1) thiết kế vector biểu hiện insulin và 2) chọn tế bào biểu hiện insulin. 6 Chương 1. TỔNG QUAN 1. Tình hình mắc bệnh đái tháo đường Định nghĩa: Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) hay bệnh tiểu đường là một nhóm các bệnh chuyển hoá được đặc trưng bởi tăng glucose máu mạn tính do hậu quả của thiếu hụt hoặc giảm hoạt động của insulin hoặc kết hợp cả hai [3, 4]. Phân loại (1999): Theo phân loại đang dùng chính thức và đượ c chấp nhận rộng rãi hiện nay [3, 4], bệnh ĐTĐ được phân làm 2 nhóm: Bệnh đái tháo đường týp 1: Thiếu insulin do tế bào β bị phá huỷ, thường thiếu hụt insulin tuyệt đối. Nguyên nhân của hiện tượng phá huỷ tế bào β thường là do tự miễn dịch (qua trung gian tế bào), cũng có khi không tìm thấy nguyên nhân (vô căn). Bệnh thường gặp ở người trẻ tuổi (< 35 tuổi), lứa tuổi hay gặp nhấ t là 10 - 16 tuổi (Michael J. Fowler et al., 2007). Đây là một dạng bệnh nặng, trong đó các tế bào có nhiệm vụ tiết insulin của tuyến tụy bị phá hủy nên cơ thể không có insulin để sử dụng. Nếu không điều trị kịp thời và đúng đắn, bệnh nhân sẽ bị nhiều biến chứng nặng và dẫn đến tử vong (Rother et all., 2007). Bệnh đái tháo đường týp 2: Do kháng insulin ở cơ quan đích kèm theo giảm ch ức năng tế bào β, riêng rẽ hoặc kết hợp cả hai. Đái tháo đường type 2 là loại đái tháo đường “không phụ thuộc insulin”. Bệnh thường gặp ở người trên 40 tuổi, người béo phì, trong đó cơ thể vẫn sản xuất insulin nhưng không sử dụng được, gọi là hiện tượng kháng insulin (Michael J. Fowler et al., 2007) hoặc sử dụng kém hiệu quả. Bệnh diễn biến từ từ, có khi không có triệu chứng gì và chỉ được phát hiện tình cờ qua khám sức khỏe định kỳ có thử đường trong máu và nước tiểu (Eberhart, MS; Ogden C, Engelgau M, Cadwell B, Hedley AA and Saydah SH et all., 2004). Tình hình bệnh ĐTĐ ở nước ta đã được công bố trong nhiều nghiên cứu: Tỷ lệ mắc bệnh ở Hải Phòng 0,3% (1991), Huế 0,7% (1996); ngoại thành Hà Nội 0,61%, nội thành 4,35% (Cường, 2004). Tỷ lệ trung bình của cả nước là 2,7% (đã điều chỉnh, tỷ lệ thô là 3,5%) (Bình, 2006) [3]. Tỷ lệ mắc bệ nh ở các khu vực khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê: Miền núi và Tây Nguyên 2,1%; đồng bằng 2,7%; trung du và miền biển 2,2% và thành phố 4,4% [3, 5]. Theo phân loại của Hiệp hội đái tháo đường quốc tế và Tổ chức Y tế thế giới, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường của Việt Nam nằm trong khu vực II (tỷ lệ 2-4,99%), giống các nước khác trong khu vực như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia và thấp hơn các nước khu vực III (tỷ lệ 5-7,99%), nh ư Nhật bản, Hàn Quốc, Malaysia, Singapore, Australia [6]. 7 Tỷ lệ mắc bệnh đái đường có xu thế tăng theo sự tăng trưởng kinh tế và các thay đổi về xã hội: Hà Nội, năm 1991 là 1,1%; năm 2004 là 2,45% [5]. Theo một thống kê khác của Bệnh viện Nội tiết trung ương, chi phí trung bình hàng ngày cho bệnh nhân đái đường (không có biến chứng) cao gấp 7,47 lần lương tối thiểu (thời điểm thống kê) [3, 5]. Ở Anh, khoảng 1,6 triệu người bị ĐT Đ. Ở Mỹ, số người bị ĐTĐ tăng từ 5,3% năm 1997 lên 6,5% năm 2003 và tiếp tục tăng nhanh. Những người lứa tuổi trên 65 bị ĐTĐ gấp hai lần người lứa tuổi 45-54 [7]. Chẩn đoán xác định bệnh ĐTĐ bằng định lượng đường máu: lúc đói ≥126 mg/dl (≥7 mmol/l), thử ít nhất 2 lần liên tiếp; sau ăn hoặc bất kỳ lúc nào ≥200 mg/dl ( ≥11,1 mmol/l). Biến chứng và hậu quả của đái tháo đường: Nếu không được phòng và chữa kịp thời, bệnh ĐTĐ dễ gây biến chứng. Có thống kê đã cho thấy: 44% người bệnh đái tháo đường bị biến chứng thần kinh, 71% có biến chứng về thận, 8% bị biến chứng mắt (giảm thị lực, có thể dẫn đến mù lòa). Các biến chứng thường gặp khác có th ể kể ra sau đây [3, 8]: - Tim mạch: có thể gây đột quị, rối loạn tuần hoàn ngoại vi. - Suy giảm tình dục, liệt dương. - Hoại tử chi: có thể phải cắt cụt. - Nhiễm trùng cơ hội. Các yếu tố nguy cơ đối với bệnh ĐTĐ: - Tiền sử gia đình có liên quan với bệnh ĐTĐ. - Tiền sử s ản khoa, thai kỳ. - Chỉ số BMI cao, thừa cân, béo phì, vòng eo lớn. - Tăng huyết áp. - Ít hoạt động thể lực. 2. Insulin Lịch sử phát hiện Năm 1869, Paul Langerhans [9], một sinh viên ở Viện giải phẫu bệnh Berlin, khi học cấu trúc của tuỵ dưới kính hiển vi, đã phát hiện ra rằng, có một số đám nhỏ tế bào (“little heaps of cells”; về sau gọi là islets of Langerhans, tiểu đả o Langerhans) chưa thấy có tài liệu nào mô tả. Phát hiện này đã được nhiều nhà nghiên cứu thời đó chú ý, đặc biệt là về mặt cấu trúc và chức năng của chúng. 8 Về cấu trúc, người ta nhận thấy, chúng không có các đường thông với các ống dẫn trong tuỵ [10]; về chức năng, Edouard Laguesse [11] gợi ý rằng, các đảo này có thể sản xuất ra những chất có vai trò điều hoà trong quá trình tiêu hoá. Để làm rõ nhận định này, con trai của Langerhans, Archibald, đã làm hết mình, giúp cha tìm hiểu cơ chế điều hoà trong quá trình tiêu hoá và đã thu được nhiều kết quả quan trọng [10]. Hai mươi năm sau phát hiện của Langerhans, năm 1889, Oscar Minkowski, một nhà nộ i khoa người Đức đã phối hợp với Joseph von Mering [12], cắt bỏ tuỵ của một con chó khoẻ mạnh để xem xét ảnh hưởng của nó tới tiêu hoá. Sau vài ngày mất tuỵ, người nuôi chó nhận thấy, có nhiều ruồi đến bâu vào nước tiểu của con chó này. Khi thử nước tiểu của nó, người ta thấy có đường. Đó là phát hiện đầu tiên về mối liên quan giữa tuỵ và đái tháo đường. Đến năm 1901, sau nhiều bướ c nghiên cứu lớn, Eugene Opie đã chứng minh mối liên quan rõ ràng giữa đảo Langerhans với ĐTĐ: “bệnh ĐTĐ là do phá huỷ đảo Langerhans và chỉ xảy ra khi chúng bị phá huỷ hoàn toàn hoặc một phần”. Trong 2 thập kỷ tiếp theo, một số nghiên cứu đã đi theo hướng xử lý tuỵ động vật để thu lấy chất điều trị ĐTĐ (Zuelzer 1906, Scott 1912, Kleiner 1919). Năm 1921, Nicolae Paulescu [13], Giáo sư trường đại h ọc Y Dược Bucharest (Hungary), là người đầu tiên công bố đã tách được insulin và ông đã gọi nó là pancrein. Năm 1920, Frederic Banting (Canada) [14] thấy rằng, các chất tiết (secretions) của tuỵ đã phá huỷ (các?) chất tiết [secretion (s?)] của đảo Langerhans; vì vậy, không thể chiết xuất chất này từ tuỵ và cho rằng, chất tiết “nội tuỵ” đã điều hoà glucose máu nên nó có thể đóng vai trò là chìa khoá trong điều trị ĐTĐ. Năm 1921, cũng vẫn là Banting, khi phẫu thuật, ông nhận thấy rằng, có thể làm tắc một số độ ng mạch của tuỵ để làm teo phần lớn nhu mô tuỵ nhưng không ảnh hưởng tới các đảo Langerhans. Ông nghĩ rằng, có thể làm teo như thế để thu lấy chất tiết tương đối thuần khiết từ các đảo này. Ông đã thực hiện thành công ý tưởng này tại trường đại học Toronto (Canada) và sau này, ông đã được nhận giải thưởng Nobel về công trình này [15]. Khi các tế bào “tiêu hoá” của tuỵ bị phá huỷ, hàng nghìn đảo Langerhans vẫn còn l ại, nhóm nghiên cứu đã thu được chất tiết ra từ các đảo (islet) này, họ gọi tên là isletin (chất mà hiện nay gọi là insulin). Dùng isletin tiêm cho những con chó đã bị cắt tuỵ, nhóm nghiên cứu đã giữ được cho chúng sống trong vài tháng; trong khi đó, những con chó không được tiêm thì chết rất nhanh. 9 Khi động vật bị lấy mất tuỵ, nồng độ glucose máu tăng cao, một hình ảnh giống như bệnh đái tháo đường. Nhóm nghiên cứu này, về sau, phối hợp với James Collip [14], nhà hoá sinh, đã thành công trong tinh chế isletin và tiến hành thử lâm sàng. Ngày 11 tháng 01 năm 1922, bệnh nhân (Leonard Thompson, 14 tuổi) đái tháo đường đầu tiên, nằm ở bệnh viện đa khoa Toronto, đã được tiêm insulin. Tuy nhiên, insulin này chưa được tinh chế tốt nên Thompson đã bị dị ứng n ặng và việc tiêm bị tạm dừng. Mười hai ngày tiếp theo, Collip đã làm việc suốt ngày đêm để cải tiến quy trình tinh sạch insulin và đã thu được insulin với chất lượng cao hơn. Đến ngày 23/01/1922, liều thứ 2 đã được tinh chế xong và lại được dùng cho bệnh nhân. Kết quả thử lần này thật hoàn hảo, hầu như không có tác dụng phụ nào và nó đã làm hết hoàn toàn đường niệu của bệnh nhân. Năm 1922, Best [14] đã c ố gắng cải tiến các kỹ thuật của mình để có thể thu được một lượng lớn hơn insulin, đáp ứng cho nhu cầu điều trị cấp bách của nhiều bệnh nhân lúc đó; tuy nhiên, các chế phẩm này đều không đủ độ tinh sạch. Hãng dược phẩm Eli Lilly đã mời Best cộng tác và sau đó họ đã vượt qua được nhiều khó khăn lớn để có thể sản xuất một l ượng lớn insulin tinh khiết. Ngay sau đó, insulin này được thương mại hoá. Trước khi có các nghiên cứu y học, trên thị trường chỉ có các insulin nguồn gốc từ động vật; vào những năm 50, người ta đã biết được trình tự acid amin của insulin [16] và insulin “người” đã được tập đoàn Genentech sản xuất bằng công nghệ gen, với E. coli, lần đầu tiên trên thế giới năm 1977 [17]. Cấu trúc bậc 1 của insulin được F. Sanger [16], nhà sinh học phân tử người Anh, xác định năm 1955. Đây là protein đầu tiên trong y học được xác định chính xác trình tự các acid amin. Năm 1958, ông được nhận giải Nobel Hoá học cho công trình này [18]. Năm 1969, Hodgkin [19] đã xác định cấu trúc bậc 3 của insulin bằng nhiễu xạ tia X, dẫn tới phát triển các kỹ thuật ghi hình tinh thể. Bà được giải Nobel Hoá học cho công này vào năm 1969. Năm 1977, Yalow [18] được nhận giải Nobel Y học về phát triển kỹ thuật miễn dịch phóng xạ dùng cho insulin. Cấu trúc phân tử (Hình 1) Phân tử insulin người gồm hai chuỗi polypeptide: chuỗi A gồm 21 amino acid và chuỗi B gồm 30 amino acid [2, 20]. Hai cầu nối disulfur (A7 - B7, A20 - B19) như hai sợi dây “buộc” chặt hai chuỗi với nhau. Trong chuỗi A còn có một cầu nối disulfur giữa gốc A6 và A11 đảm bảo cho phân tử ổn định hình dạng trong không gian. Một điều đặc biệt là, cả 3 cầu nối này đều bất biến ở tất cả các dạng insulin của động vật (Sanger et all., 1988) [21]. Ho ạt tính của insulin sẽ mất khi gẫy các cầu nối này [22], [2, 23, 24]. 10 Hình 1: Cấu trúc phân tử insulin người Phân tử insulin gồm hai chuỗi polypeptide: chuỗi A, 21 amino acid và chuỗi B, 30 amino acid. Hai cầu disulfur (A7 - B7, A20 - B19) là các liên kết đồng hóa trị; cầu thứ 3 nằm trong chuỗi A (6-11) Quá trình hình thành insulin trong cơ thể (Sơ đồ 1) Insulin được tạo ra từ tiền thân của nó là proinsulin. Phân tử insulin hoạt động được tạo thành từ protein tiền thân này bằng quá trình thủy phân protein (proteolytic) dưới tác dụng của các enzym trypsin của tuyến tụy (endopeptidases PC1, PC2, PC3) [25]. Cuối cùng, insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết tích tụ trong tế bào chất cho đến khi được kích hoạt để giải phóng. Quá trình này gồm hai giai đoạn: Giai đoạn 1: Thủy phân để cắt đoạn peptide tín hiệu, gồm 23 axit amin ở đầu amin tự do của pre-proinsulin để tạo thành phân tử proinsulin chứa ba liên kết cầu disulphur. Giai đoạn 2: Thủy phân tiếp để cắt rời đoạn peptid C (35 acid amin) để tạo thành phân tử insulin hoàn thiện (có hoạt tính), bao gồm 51 acid amin, thực hiện chức năng của nó trong cơ thể [26]. Có thể tóm tắt quá trình hình thành insulin trong cơ thể theo sơ đồ dưới đây: [...]... trình chuyển hoá và sự biểu hiện của nó Năm 19 67, Steiner và Chance phát hiện ra cấu trúc phân tử proinsulin Năm 19 81, Peter Gens và Geore Choury đã biểu hiện pre-proinsulin chuột bằng tế bào thận khỉ [46], [47] Đến năm 19 83, Orgad Lans đã biểu hiện gen proinsulin người bằng hệ thống tế bào của động vật có vú Năm 19 92, Masahiko đã nghiên cứu biểu hiện proinsulin có biến đổi trên dòng tế bào COS - 7 [48]... Năm 19 87, tổng hợp insulin thành công trong tế bào nấm men [34] Tình hình sản xuất insulin tái tổ hợp trong nước: Ở Việt Nam cũng có một số nghiên cứu về sản xuất insulin tái tổ hợp nhưng chỉ dừng lại ở mức độ tiếp cận như trường đại học Y Hà Nội [35, 36], đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh [37- 41] Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã mô hình hóa thành công một quy trình sản xuất insulin. .. trúc (refolding) sau biểu hiện [50] Một số nghiên cứu proinsulin ở Việt Nam: Một nghiên cứu được công bố của Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh, với sự kết hợp của công ty 19 Ajinomoto Đó là nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin của người tái tổ hợp trong E coli Các tác giả đã biểu hiện thành công mini-proinsulin, nhưng chưa nghiên cứu sâu hơn về hoạt... ADN mẫu, mỗi bậc 10 0 bp Thiết kế plasmid biểu hiện proinsulin Sau khi nối ghép và nuôi cấy sàng lọc, plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc, kết quả minh hoạ trên Hình 4 M 1 2 3 279 Hình 4: Kết quả PCR khuẩn lạc mang gen proinsulin M: Thang ADN mẫu, mỗi bậc 10 0 bp 1, chứng âm tính; 2 và 3 dương tính (279 bp) Biểu hiện gen proinsulin trong E coli BL 21 (DE3) Kết quả biểu hiện trên Hình 5... song nhằm thu lại vetor pET32c mở vòng có đầu tương thích với đoạn ADN trên Sản phẩm phản ứng được điện di trên gel agarose 1, 7% và thể hiện trên Hình 9: Hình 9: Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme NcoI và BamHI trên gel agarose 1, 7% 1 : Plasmid tái tổ hợp pET14bInsA 2 : Plasmid tái tổ hợp pET14bInsB 33 3, 4: Plasmid tái tổ hợp pET32cIL2 M : Marker Hình 9 cho thấy, các plasmid đã bị cắt... kích thước tương ứng là 19 4 bp, 345 bp và vector gốc 5900 bp và được thể hiện trên Hình 10 : Hình 10 : Điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET32cInsA và pET32cInsB bằng enzyme NdeI 1- 8: Plasmid tái tổ hợp pET32cInsA 9: Plasmid tái tổ hợp pET32cInsB M: Marker ADN 34 Kết quả thể hiện trên hình 10 cho thấy, sau khi xử lý bằng enzyme NdeI, các plasmid InsA 2, 6, 7, 8 và InsB đều cho ra 4 băng... khả năng biến đổi sản phẩm sau quá trình dịch mã, nhờ vậy, quá trình sản xuất insulin đơn giản hơn [2] Nhiều nước đã sản xuất insulin tái tổ hợp, như Mỹ, Đức, Pháp Tuy vậy, tất cả các nước đều có bản quyền riêng mà ở nước ta, chưa thấy có tổ chức nào đứng ra mua một trong các bản quyền này [2] Về công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp: Hiện nay, hầu hết những phương pháp sản xuất insulin thương mại... phút và kéo dài 6-8 giờ Loại này gồm insulin tái tổ hợp, lợn hoặc bò kết tinh và được hoà tan dưới dạng dung dịch trong suốt 2 Loại tác dụng trung bình: có tác dụng sau khoảng 2 giờ tiêm và kéo dài khoảng 18 giờ Loại này gồm insulin tái tổ hợp, lợn hoặc bò kết hợp với chlorua kẽm hoặc protamine để hình thành một phức hợp protein với một tỷ lệ insulin tự do và insulin phức hợp nhất định để tạo ra một insulin. .. sinh học của protein này sau biểu hiện và về các điều kiện tối ưu trong quá trình biểu hiện [37, 38, 40, 41] Từ năm 2007, trường đại học Y Hà Nội cũng đã nghiên cứu và biểu hiện thành công proinsulin [35, 36] 20 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chiến lược nghiên cứu: Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo ra được chuỗi A và chuỗi B để làm nguyên liệu tạo ra phân tử insulin hoàn chỉnh Để đạt mục... tính nằm giữa insulin nhanh và insulin chậm 3 Loại tác dụng chậm: có tác dụng sau khoảng 7 giờ và kéo dài khoảng 36 giờ Loại này gồm insulin tái tổ hợp, lợn hoặc bò kết hợp với chlorua kẽm hoặc protamine để hình thành một phức hợp protein bền, theo đó insulin được giải phóng chậm 17 Pre-proinsulin và Proinsulin Cấu trúc phân tử của pre-proinsulin và proinsulin (Hình 2): Hình 2 Sơ đồ cấu tạo và trình tự . BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp Giai đoạn 1: Thiết kế vector và chọn tế bào biểu hiện Insulin. Năm 1987, tổng hợp insulin thành công trong tế bào nấm men [34]. Tình hình sản xuất insulin tái tổ hợp trong nước: Ở Việt Nam cũng có một số nghiên cứu về sản xuất insulin tái tổ hợp nhưng. insulin 11 Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp 13 Nhu cầu insulin hiện nay 16 Pre-proinsulin và Proinsulin 18 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 1. Proinsulin 21 1.1. Vật