Nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp giai đoạn 1 thiết kế véc tơ và chọn tế bào biểu hiện insulin

Insulin là thuốc đầu tiên sản xuất bằng công nghệtái tổhợp gen được dùng cho người từnăm 1978. Nguyên lý của công nghệnày, cho đến nay, không có gì thay đổi nhưng bản quyền và các chi tiết kỹthuật đều được bảo hộbởi các Công ty hoặc cơsởnghiên cứu lớn; các nước muốn phát triển công nghệsản xuất insulin của riêng mình đều phải tựlàm lấy từ đầu. Vì những lý do trên, chúng tôi đềxuất nghiên cứu này, là bước khởi đầu, với hy vọng có thểsản xuất được insulin trong nước trong tương lai gần, đáp ứng nhu cầu đang tăng lên của xã hội. Nghiên cứu này nhằm mục đích: 1) thiết kếvector biểu hiện insulin và 2) chọn tếbào biểu hiện insulin.

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Lê Văn Phủng

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường đại học Y Hà Nội

Mã số đề tài (nếu có):

7950

Năm 2010

Những chữ viết tắt

ĐTĐ Đái tháo đường

BMI Body Mass Index (chỉ số khối cơ thể)

IDF International Diabetes Federation (Hiệp hội ĐTĐ quốc tế)

PCR Polymerase Chain Reaction

Taq Thermus aquaticus

TAE Tris-Acetate-EDTA (Đệm TAE)

EMBL European Molecular Biology Laboratory (Phòng thí nghiệm sinh

học phân tử châu Âu)

DDBJ ADN Data Bank of Japan (Ngân hàng dữ liệu ADN Nhật Bản)

NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông

tin sinh học Quốc gia (Mỹ)

MỤC LỤC

Đặt vấn đề 5

Chương 1: Tổng quan 6

1 Tình hình mắc bệnh đái tháo đường 6

2 Insulin 7

Lịch sử phát hiện 7

Cấu trúc phân tử 9

Quá trình hình thành insulin trong cơ thể 10

Cơ chế tác động của insulin 11

Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp 13

Nhu cầu insulin hiện nay 16

Pre-proinsulin và Proinsulin 18

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21

1 Proinsulin 21

1.1 Vật liệu 21

1.2 Phương pháp 22

1.2.1 Khuếch đại gen proinsulin 22

1.2.2 Tạo vector mang gen proinsulin 22

1.2.3 Tạo dòng E coli DH5a mang plasmid tái tổ hợp 22

1.2.4 Tuyển chọn thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự gen 22

1.2.5 Cảm ứng biểu hiện và phân tích bằng SDS-PAGE 23

1.2.6 Tinh sạch protein tái tổ hợp và nhận dạng bằng Western blot 23

2 Đối với insulin: chuỗi A, B 23

2.1 Vật liệu 24

2.2 Hoá chất 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Tách chiết và tinh sạch plasmid 26

2.3.2 Tạo plasmid tái tổ hợp 27

2.3.3 Phương pháp đọc trình tự 27

2.3.4 Phương pháp biểu hiện protein 28

2.3.5 Phương pháp phân tích và nhận dạng protein bằng khối phổ 28

2.3.6 Phương pháp tinh chế protein bằng sắc ký ái lực Ni- NTA 29

2.3.7 Phương pháp cắt loại bỏ đuôi His Tag 29

3 Các tế bào biểu hiện 29

3.1 Vật liệu 29

3.2 Phương pháp 29

Chương 3 Kết quả 30

1 Proinsulin 30

2 Chuỗi A, chuỗi B 32

3 Kết quả tế bào biểu hiện 44

Chương 4: Bàn luận 45

Kết luận 47

Kiến nghị 47

Tài liệu tham khảo 48

Ở Mỹ, có khoảng 14 triệu người mắc bệnh đái tháo đường; hàng năm, 250.000 bệnh nhân đái tháo đường chết vì các biến chứng của bệnh này Ở Singapore, tỷ lệ bệnh đái tháo đường tăng lên theo thời gian: năm 1975 là 1,9%;

1984 là 4,7%; 1992 là 8,6% [2]

Ở nước ta, theo Tạ Văn Bình và cộng sự [3], tỷ lệ mắc bệnh chung trên cả nước là 2,7%; như vậy, có khoảng 2,3 triệu bệnh nhân đang mắc đái tháo đường, con số này còn tăng lên đồng hành với sự tăng trưởng kinh tế và những thay đổi về lối sống và các điều kiện sống

Đặc điểm của bệnh đái đường (đặc biệt là týp 1) là phải dùng Insulin hàng ngày và phải dùng suốt đời Với tỷ lệ đái tháo đường như hiện nay, hàng năm cả nước phải chi một số tiền không nhỏ cho việc mua insulin (khoảng 11.000 tỷ đồng), chưa kể tiền điều trị nhiều biến chứng của nó Ở nước ta hiện nay, toàn

bộ insulin đều phải nhập ngoại; vì vậy, nếu tự sản xuất được trong nước, giá thành thuốc sẽ hạ và điều đó mang lại ý nghĩa kinh tế và xã hội không nhỏ Insulin là thuốc đầu tiên sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp gen được dùng cho người từ năm 1978 Nguyên lý của công nghệ này, cho đến nay, không có

gì thay đổi nhưng bản quyền và các chi tiết kỹ thuật đều được bảo hộ bởi các Công ty hoặc cơ sở nghiên cứu lớn; các nước muốn phát triển công nghệ sản xuất insulin của riêng mình đều phải tự làm lấy từ đầu

Vì những lý do trên, chúng tôi đề xuất nghiên cứu này, là bước khởi đầu, với hy vọng có thể sản xuất được insulin trong nước trong tương lai gần, đáp ứng nhu cầu đang tăng lên của xã hội

Nghiên cứu này nhằm mục đích: 1) thiết kế vector biểu hiện insulin và 2) chọn tế bào biểu hiện insulin

Chương 1 TỔNG QUAN

1 Tình hình mắc bệnh đái tháo đường

Định nghĩa: Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) hay bệnh tiểu đường là một nhóm

các bệnh chuyển hoá được đặc trưng bởi tăng glucose máu mạn tính do hậu quả của thiếu hụt hoặc giảm hoạt động của insulin hoặc kết hợp cả hai [3, 4]

Phân loại (1999): Theo phân loại đang dùng chính thức và được chấp nhận

rộng rãi hiện nay [3, 4], bệnh ĐTĐ được phân làm 2 nhóm:

Bệnh đái tháo đường týp 1: Thiếu insulin do tế bào β bị phá huỷ, thường thiếu hụt insulin tuyệt đối Nguyên nhân của hiện tượng phá huỷ tế bào β thường là do tự miễn dịch (qua trung gian tế bào), cũng có khi không tìm thấy nguyên nhân (vô căn)

Bệnh thường gặp ở người trẻ tuổi (< 35 tuổi), lứa tuổi hay gặp nhất là 10 -

16 tuổi (Michael J Fowler et al., 2007) Đây là một dạng bệnh nặng, trong đó các tế bào có nhiệm vụ tiết insulin của tuyến tụy bị phá hủy nên cơ thể không có insulin để sử dụng Nếu không điều trị kịp thời và đúng đắn, bệnh nhân sẽ bị nhiều biến chứng nặng và dẫn đến tử vong (Rother et all., 2007)

Bệnh đái tháo đường týp 2: Do kháng insulin ở cơ quan đích kèm theo

giảm chức năng tế bào β, riêng rẽ hoặc kết hợp cả hai

Đái tháo đường type 2 là loại đái tháo đường “không phụ thuộc insulin” Bệnh thường gặp ở người trên 40 tuổi, người béo phì, trong đó cơ thể vẫn sản xuất insulin nhưng không sử dụng được, gọi là hiện tượng kháng insulin (Michael J Fowler et al., 2007) hoặc sử dụng kém hiệu quả Bệnh diễn biến từ

từ, có khi không có triệu chứng gì và chỉ được phát hiện tình cờ qua khám sức khỏe định kỳ có thử đường trong máu và nước tiểu (Eberhart, MS; Ogden C, Engelgau M, Cadwell B, Hedley AA and Saydah SH et all., 2004)

Tình hình bệnh ĐTĐ ở nước ta đã được công bố trong nhiều nghiên cứu:

Tỷ lệ mắc bệnh ở Hải Phòng 0,3% (1991), Huế 0,7% (1996); ngoại thành Hà Nội 0,61%, nội thành 4,35% (Cường, 2004) Tỷ lệ trung bình của cả nước là 2,7% (đã điều chỉnh, tỷ lệ thô là 3,5%) (Bình, 2006) [3] Tỷ lệ mắc bệnh ở các khu vực khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê: Miền núi và Tây Nguyên 2,1%; đồng bằng 2,7%; trung du và miền biển 2,2% và thành phố 4,4% [3, 5] Theo phân loại của Hiệp hội đái tháo đường quốc tế và Tổ chức Y tế thế giới, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường của Việt Nam nằm trong khu vực II (tỷ lệ 2-4,99%), giống các nước khác trong khu vực như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia và thấp hơn các nước khu vực III (tỷ lệ 5-7,99%), như Nhật bản, Hàn

Tỷ lệ mắc bệnh đái đường có xu thế tăng theo sự tăng trưởng kinh tế và các thay đổi về xã hội: Hà Nội, năm 1991 là 1,1%; năm 2004 là 2,45% [5]

Theo một thống kê khác của Bệnh viện Nội tiết trung ương, chi phí trung

bình hàng ngày cho bệnh nhân đái đường (không có biến chứng) cao gấp 7,47 lần lương tối thiểu (thời điểm thống kê) [3, 5]

Ở Anh, khoảng 1,6 triệu người bị ĐTĐ Ở Mỹ, số người bị ĐTĐ tăng từ 5,3% năm 1997 lên 6,5% năm 2003 và tiếp tục tăng nhanh Những người lứa tuổi trên 65 bị ĐTĐ gấp hai lần người lứa tuổi 45-54 [7]

Chẩn đoán xác định bệnh ĐTĐ bằng định lượng đường máu: lúc đói

≥126 mg/dl (≥7 mmol/l), thử ít nhất 2 lần liên tiếp; sau ăn hoặc bất kỳ lúc nào

≥200 mg/dl (≥11,1 mmol/l)

Biến chứng và hậu quả của đái tháo đường:

Nếu không được phòng và chữa kịp thời, bệnh ĐTĐ dễ gây biến chứng

Có thống kê đã cho thấy: 44% người bệnh đái tháo đường bị biến chứng thần kinh, 71% có biến chứng về thận, 8% bị biến chứng mắt (giảm thị lực, có thể dẫn đến mù lòa) Các biến chứng thường gặp khác có thể kể ra sau đây [3, 8]:

- Tim mạch: có thể gây đột quị, rối loạn tuần hoàn ngoại vi

- Suy giảm tình dục, liệt dương

- Hoại tử chi: có thể phải cắt cụt

- Nhiễm trùng cơ hội

Các yếu tố nguy cơ đối với bệnh ĐTĐ:

- Tiền sử gia đình có liên quan với bệnh ĐTĐ

- Tiền sử sản khoa, thai kỳ

- Chỉ số BMI cao, thừa cân, béo phì, vòng eo lớn

số đám nhỏ tế bào (“little heaps of cells”; về sau gọi là islets of Langerhans,

tiểu đảo Langerhans) chưa thấy có tài liệu nào mô tả Phát hiện này đã được nhiều nhà nghiên cứu thời đó chú ý, đặc biệt là về mặt cấu trúc và chức năng của chúng

Về cấu trúc, người ta nhận thấy, chúng không có các đường thông với các ống dẫn trong tuỵ [10]; về chức năng, Edouard Laguesse [11] gợi ý rằng, các đảo này có thể sản xuất ra những chất có vai trò điều hoà trong quá trình tiêu hoá

Để làm rõ nhận định này, con trai của Langerhans, Archibald, đã làm hết mình, giúp cha tìm hiểu cơ chế điều hoà trong quá trình tiêu hoá và đã thu được nhiều kết quả quan trọng [10]

Hai mươi năm sau phát hiện của Langerhans, năm 1889, Oscar Minkowski, một nhà nội khoa người Đức đã phối hợp với Joseph von Mering [12], cắt bỏ tuỵ của một con chó khoẻ mạnh để xem xét ảnh hưởng của nó tới tiêu hoá Sau vài ngày mất tuỵ, người nuôi chó nhận thấy, có nhiều ruồi đến bâu vào nước tiểu của con chó này Khi thử nước tiểu của nó, người ta thấy có đường Đó là phát hiện đầu tiên về mối liên quan giữa tuỵ và đái tháo đường

Đến năm 1901, sau nhiều bước nghiên cứu lớn, Eugene Opie đã chứng minh mối liên quan rõ ràng giữa đảo Langerhans với ĐTĐ: “bệnh ĐTĐ là do phá huỷ đảo Langerhans và chỉ xảy ra khi chúng bị phá huỷ hoàn toàn hoặc một phần”

Trong 2 thập kỷ tiếp theo, một số nghiên cứu đã đi theo hướng xử lý tuỵ động vật để thu lấy chất điều trị ĐTĐ (Zuelzer 1906, Scott 1912, Kleiner 1919) Năm 1921, Nicolae Paulescu [13], Giáo sư trường đại học Y Dược Bucharest (Hungary), là người đầu tiên công bố đã tách được insulin và ông đã gọi nó là

pancrein. Năm 1920, Frederic Banting (Canada) [14] thấy rằng, các chất tiết (secretions) của tuỵ đã phá huỷ (các?) chất tiết [secretion (s?)] của đảo Langerhans; vì vậy, không thể chiết xuất chất này từ tuỵ và cho rằng, chất tiết

“nội tuỵ” đã điều hoà glucose máu nên nó có thể đóng vai trò là chìa khoá trong điều trị ĐTĐ

Năm 1921, cũng vẫn là Banting, khi phẫu thuật, ông nhận thấy rằng, có thể làm tắc một số động mạch của tuỵ để làm teo phần lớn nhu mô tuỵ nhưng không ảnh hưởng tới các đảo Langerhans Ông nghĩ rằng, có thể làm teo như thế để thu lấy chất tiết tương đối thuần khiết từ các đảo này Ông đã thực hiện thành công ý tưởng này tại trường đại học Toronto (Canada) và sau này, ông đã được nhận giải thưởng Nobel về công trình này [15] Khi các tế bào “tiêu hoá” của tuỵ bị phá huỷ, hàng nghìn đảo Langerhans vẫn còn lại, nhóm nghiên cứu

đã thu được chất tiết ra từ các đảo (islet) này, họ gọi tên là isletin (chất mà hiện nay gọi là insulin) Dùng isletin tiêm cho những con chó đã bị cắt tuỵ, nhóm

nghiên cứu đã giữ được cho chúng sống trong vài tháng; trong khi đó, những con chó không được tiêm thì chết rất nhanh

Khi động vật bị lấy mất tuỵ, nồng độ glucose máu tăng cao, một hình ảnh giống như bệnh đái tháo đường Nhóm nghiên cứu này, về sau, phối hợp với James Collip [14], nhà hoá sinh, đã thành công trong tinh chế isletin và tiến hành thử lâm sàng

Ngày 11 tháng 01 năm 1922, bệnh nhân (Leonard Thompson, 14 tuổi) đái tháo đường đầu tiên, nằm ở bệnh viện đa khoa Toronto, đã được tiêm insulin Tuy nhiên, insulin này chưa được tinh chế tốt nên Thompson đã bị dị ứng nặng

và việc tiêm bị tạm dừng Mười hai ngày tiếp theo, Collip đã làm việc suốt ngày đêm để cải tiến quy trình tinh sạch insulin và đã thu được insulin với chất lượng cao hơn Đến ngày 23/01/1922, liều thứ 2 đã được tinh chế xong và lại được dùng cho bệnh nhân Kết quả thử lần này thật hoàn hảo, hầu như không có tác dụng phụ nào và nó đã làm hết hoàn toàn đường niệu của bệnh nhân

Năm 1922, Best [14] đã cố gắng cải tiến các kỹ thuật của mình để có thể thu được một lượng lớn hơn insulin, đáp ứng cho nhu cầu điều trị cấp bách của nhiều bệnh nhân lúc đó; tuy nhiên, các chế phẩm này đều không đủ độ tinh sạch Hãng dược phẩm Eli Lilly đã mời Best cộng tác và sau đó họ đã vượt qua được nhiều khó khăn lớn để có thể sản xuất một lượng lớn insulin tinh khiết Ngay sau đó, insulin này được thương mại hoá

Trước khi có các nghiên cứu y học, trên thị trường chỉ có các insulin nguồn gốc từ động vật; vào những năm 50, người ta đã biết được trình tự acid amin của insulin [16] và insulin “người” đã được tập đoàn Genentech sản xuất

bằng công nghệ gen, với E coli, lần đầu tiên trên thế giới năm 1977 [17]

Cấu trúc bậc 1 của insulin được F Sanger [16], nhà sinh học phân tử người Anh, xác định năm 1955 Đây là protein đầu tiên trong y học được xác định chính xác trình tự các acid amin Năm 1958, ông được nhận giải Nobel Hoá học cho công trình này [18] Năm 1969, Hodgkin [19] đã xác định cấu trúc bậc 3 của insulin bằng nhiễu xạ tia X, dẫn tới phát triển các kỹ thuật ghi hình tinh thể Bà được giải Nobel Hoá học cho công này vào năm 1969 Năm 1977, Yalow [18] được nhận giải Nobel Y học về phát triển kỹ thuật miễn dịch phóng

cả các dạng insulin của động vật (Sanger et all., 1988) [21] Hoạt tính của insulin sẽ mất khi gẫy các cầu nối này [22], [2, 23, 24]

Hình 1: Cấu trúc phân tử insulin người

Phân tử insulin gồm hai chuỗi polypeptide: chuỗi A, 21 amino acid và chuỗi B, 30 amino acid Hai cầu disulfur (A7 - B7, A20 - B19) là các liên kết đồng hóa trị; cầu thứ 3 nằm trong

chuỗi A (6-11)

Quá trình hình thành insulin trong cơ thể (Sơ đồ 1)

Insulin được tạo ra từ tiền thân của nó là proinsulin Phân tử insulin hoạt động được tạo thành từ protein tiền thân này bằng quá trình thủy phân protein (proteolytic) dưới tác dụng của các enzym trypsin của tuyến tụy (endopeptidases PC1, PC2, PC3) [25] Cuối cùng, insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết tích tụ trong tế bào chất cho đến khi được kích hoạt để giải phóng Quá trình này gồm hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: Thủy phân để cắt đoạn peptide tín hiệu, gồm 23 axit amin ở

đầu amin tự do của pre-proinsulin để tạo thành phân tử proinsulin chứa ba liên kết cầu disulphur

Giai đoạn 2: Thủy phân tiếp để cắt rời đoạn peptid C (35 acid amin) để tạo

thành phân tử insulin hoàn thiện (có hoạt tính), bao gồm 51 acid amin, thực hiện chức năng của nó trong cơ thể [26]

Có thể tóm tắt quá trình hình thành insulin trong cơ thể theo sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 1: Các bước hình thành insulin

trong cơ thể [27]

1 Dịch mã và chuyển vị trí: gen pre-proinsulin được dịch Sản phẩm của gen này là một protein chứa chuỗi B, C và A và một peptide tự tín hiệu

2 Gấp nếp (folding), oxy hoá và cắt peptid tín hiệu

3 Chuyển từ lưới nội bào (ER) qua bộ Golgi, đóng gói

4 Cắt đoạn peptid C, còn lại hai đoạn B và A

5 Hoàn thiện phân tử insulin chín

Cơ chế tác động của insulin (Sơ đồ 2)

Insulin tác dụng bằng cách gắn vào receptor đặc hiệu nằm trên màng tế bào của hầu hết các mô Không chỉ các mô đích chịu tác dụng của insulin là gan, cơ, và mô mỡ mà còn ở các mô khác như tế bào máu, tế bào não và tế bào sinh dục [24], [2, 22] Receptor insulin là một glycoprotein xuyên màng gồm 2 tiểu đơn vị α nằm hoàn toàn ở màng ngoài tế bào, chứa vùng gắn insulin và 2 tiểu đơn vị là β, một protein xuyên màng có hoạt tính tyroxin kinase Bốn đơn

vị này gắn đối xứng với nhau bằng cầu nối disulfur

Khi insulin gắn với tiểu đơn vị α, nó sẽ kích thích hoạt tính tyroxin kinase của phần β trong tế bào, khởi động chuỗi phản ứng, kết quả tạo ra một loạt các phản ứng phosphoryl hoá trong tế bào đại diện cho chất truyền tin thứ 2 của insulin, dẫn đến thể hiện một loạt các tác dụng trên chuyển hoá glucid,

lipid, protid bằng cách hoạt hoá hệ thống vận chuyển glucose và ion, tăng vận

chuyển glucose vào tế bào, hoạt hoá hoặc bất hoạt enzym, tác động trên tổng hợp protein và sao mã gen [2, 23], [28]

Sơ đồ 2: Tác động của insulin tới sự hấp thu glucose

Insulin gắn vào receptor của nó (1) rồi hoạt hoá nhiều hệ protein (2) Những protein này gồm chuyển vị trí của Glut-4 transporter đến màng sinh chất và thu nhận glucose (3), tổng hợp glycogen (4), phân huỷ glycogen (5) và tổng hợp acid béo (6)[29]

Insulin đóng vai trò quan trọng trong toàn bộ quá trình chuyển hoá carbonhydrat, lipid, protid, sinh ra năng lượng duy trì quá trình hoạt động và phát triển của cơ thể [2]

Trên chuyển hoá glucose: Tác dụng hạ đường huyết do làm tăng tính

thấm của màng tế bào đối với glucose, làm glucose vận chuyển vào trong tế bào

dễ dàng [2, 28], thúc đẩy tổng hợp glycogen ở gan, do hoạt hoá hexokinase và glycogen synthase, đồng thời ức chế huỷ glycogen ở gan do ức chế phosphorylase [2, 22], ức chế tân tạo glucose ở gan, do đó làm giảm nguyên liệu tạo glucose [2, 8], tăng dự trữ và sử dụng glucose ở gan, cơ và mô mỡ [2, 22]

Trên chuyển hoá lipid: Làm giảm acid béo tự do trong vòng tuần hoàn và

thúc đẩy dự trữ tryglycerid ở mô mỡ [2, 23]

Trên chuyển hoá protid: Làm tăng tổng hợp protein do tăng thu nhận acid

amin vào tế bào và kích thích hoạt tính của ribosome, ức chế quá trình oxi hoá acid amin, ức chế sự giáng hoá protein ở cơ và các mô khác, do đó giảm hầu hết các acid amin trong máu Đồng thời ức chế tân tạo glucose từ acid amin [22],

[23]

Trên chuyển hoá năng lượng: Insulin đóng vai trò quan trọng trong việc

duy trì và điều hoà chuyển hoá năng lượng [28]

Công nghệ sản xuất Insulin tái tổ hợp

Hiện nay, có nhiều kỹ thuật sản xuất insulin tái tổ hợp, nhưng tất cả đều dựa trên những nguyên tắc chung giống nhau Không có phương pháp nào trực tiếp sản xuất ra insulin hoàn chỉnh mà đều gián tiếp qua một số phương pháp

Có hai phương pháp tiếp cận chính [30]:

Phương pháp thứ nhất: Tạo ra Proinsulin, gồm 3 chuỗi peptide (A, B và C), sau

đó cắt chuỗi C để tạo thành insulin hoàn chỉnh (gồm chuỗi A và B) Sản xuất theo con đường proinsulin chỉ cần lên men và tách chiết Các bước chính được tóm tắt như sau:

Bước 1: Tách gen mã hoá cho proinsulin

Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 11 Có thể dùng cDNA từ ngân hàng gen hoặc từ tuyến tuỵ Nếu tách từ tuỵ thì đầu tiên phải tách mRNA, sau đó dùng RT-PCR để thu lấy cDNA Do mRNA người thường có đuôi poly A nên

sử dụng chuỗi poly T để bắt cặp với đuôi poly A đó để thu mRNA rồi tiến hành cắt cầu A-T để thu được mRNA thuần, dùng cho RT-PCR

Bước 2: Thiết kế plasmid tái tổ hợp

Cắt gen proinsulin và plasmid bằng enzyme hạn chế rồi nối chúng lại bằng ADN ligase của phage T4 Trong thành phần của vector biểu hiện, phải có promotor mạnh để giúp cho gen có thể biểu hiện được trong vi khuẩn Mặt khác, cần phải thiết kế trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất

Bước 3: Biến nạp plasmid vào E coli

Dùng kỹ thuật xung điện hoặc Ca++ Quá trình chọn lọc trực tiếp khuẩn lạc xanh-trắng trên đĩa môi trường nuôi cấy Sau đó, cần kiểm tra trình tự đoạn nucleotid đã được cài vào hay chưa bằng giải trình tự gen rồi so sánh với trình

tự gốc

Bước 4: Lên men

Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục trong các điều kiện tối ưu nhằm kích thích vi khuẩn sinh sản tối đa để thu được nhiều sinh khối nhất

Bước 5: Tiền tinh sạch

Sau lên men, tiến hành tách tế bào và khử trùng bằng nhiệt Dùng lysozyme để phá vỡ màng tế bào, sau đó dùng một hỗn hợp chất tảy rửa để tách lớp màng lipid Proinsulin được tách ra khỏi các mảnh vỡ tế bào bằng phương pháp ly tâm và lọc

Bước 6: Hoạt hoá

Hệ thống E coli có khả năng biểu hiện insulin nhưng không có khả năng

hoạt hoá in vivo Do đó phải thực hiện quá trình hoạt hoá insulin bằng cách xử

lý với các dung dịch đệm, giúp nó đạt được cấu trúc bậc 4; sau đó, dùng enzyme đặc hiệu, trypsin, để phân cắt proinsulin Khi đó, sản phẩm thu được mới có hoạt tính cần thiết

Bước 7: Tinh sạch insulin

Thường dùng phương pháp sắc ký, tách, các kỹ thuật bộc lộ sự khác nhau

về điện tích, kích thước và ái lực đối với nước của phân tử sắc ký như sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lọc gen Quá trình sắc ký được giám sát bằng cách phân tích các protein đặc hiệu nhờ ELISA Độ tinh sạch của insulin được đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian trong quá trình sản xuất nhờ những phòng thí nghiệm chuyên nghiệp Cuối cùng, insulin được tinh thể hoá

Phương pháp thứ 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B

Phương pháp này tránh được phải sản xuất các enzyme đặc hiệu cần thiết

để biến proinsulin thành insulin Nhà sản xuất chỉ cần 2 gen nhỏ: một gen cho chuỗi A, một gen cho chuỗi B Do đã biết trình tự chính xác của 2 gen này nên

có thể tổng hợp được chúng Mỗi phân tử ADN sau đó được chèn vào các plasmid Các bước tiếp theo của quá trình sản xuất chuỗi A và chuỗi B tương tự như sản xuất proinsulin Tuy nhiên, ở giai đoạn cuối, hai chuỗi A và B được trộn với nhau và nối bằng các cầu disulffur qua phản ứng oxy hoá-khử nhờ một chất oxy hoá

Ngoài E coli, ngày nay, người ta còn dùng nấm men, Saccharomyces

cerevisiae, trong sản xuất insulin Phương pháp này có ưu điểm là nấm men tạo

ra các phân tử insulin gần như hoàn chỉnh cấu trúc không gian Điều đó làm giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của các giai đoạn tinh sạch làm giảm giá thành sản phẩm

Các mốc chính trong lịch sử sản xuất insulin:

- Năm 1922, Fnedrick Banting và Chartes Best ở Toronto, Canada chiết xuất được insulin từ tụy bò và đã sử dụng nó trong điều trị, mở ra triển vọng to lớn cho ĐTĐ [31], [32], [33]

- Năm 1936, Hagedorn, bác sĩ người Đan Mạch đã kết hợp insulin và protein tạo nên Protamine có tác dụng kéo dài và sau đó kết hợp với kẽm tạo ra protamine kẽm insulin (PZI) có tác dụng kéo dài 24 - 72h [31], [32]

- Năm 1946, Hagedorn đã sản xuất được Isophan (NPH) có tác dụng trung gian, hiệu quả điều trị ĐTĐ rất tốt [31]

- Trong những năm 1963-1965, insulin được tổng hợp nhân tạo bằng phương pháp hoá học, nhưng giá thành rất cao, không phù hợp trong chữa bệnh [2]

- Năm 1969, Clowfoot Hodgkin đã xác định được cấu trúc bậc 3 của insulin

- Năm 1978, Herbert Boyer (Genentech) sản xuất thành công insulin tái tổ

hợp trong vi khuẩn E coli [33]

- Năm 1982, Eli Lilly đã dùng phương pháp hoá học để biến đổi proinsulin

- tiền insulin, thành insulin có hoạt tính Insulin người, sản xuất bằng kỹ thuật ADN tái tổ hợp, lần đầu tiên trên thế giới, đã được đưa ra thị trường với tên thương phẩm là Humulin [33]

- Năm 1987, tổng hợp insulin thành công trong tế bào nấm men [34]

Tình hình sản xuất insulin tái tổ hợp trong nước:

Ở Việt Nam cũng có một số nghiên cứu về sản xuất insulin tái tổ hợp nhưng chỉ dừng lại ở mức độ tiếp cận như trường đại học Y Hà Nội [35, 36], đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh [37-41] Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã mô hình hóa thành công một quy trình sản xuất insulin và đang thử nghiệm sản phẩm trên động vật [38] Chưa có cơ sở nào thực sự sản xuất được insulin, ngay cả ở quy mô phòng thí nghiệm

Tình hình sản xuất insulin trên thế giới:

Từ năm 1977, Eli Lilly đã dùng phương pháp hoá học để biến đổi tiền insulin thành insulin có hoạt tính và loại insulin này đã trở thành thuốc sản xuất bằng công nghệ gen đầu tiên được cấp phép dùng cho người [33] Đến những

năm 90, quy trình này được cải tiến nhờ thay E coli bằng nấm men

Saccharomyces cerevisiae, loại nấm này có khả năng biến đổi sản phẩm sau quá

trình dịch mã, nhờ vậy, quá trình sản xuất insulin đơn giản hơn [2]

Nhiều nước đã sản xuất insulin tái tổ hợp, như Mỹ, Đức, Pháp Tuy vậy, tất cả các nước đều có bản quyền riêng mà ở nước ta, chưa thấy có tổ chức nào đứng ra mua một trong các bản quyền này [2]

Về công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp:

Hiện nay, hầu hết những phương pháp sản xuất insulin thương mại đều dựa trên các chủng nấm men hoặc vi khuẩn như đã nói ở trên, kết hợp với các

kỹ thuật gen để sản xuất insulin người Người ta nuôi cấy các chủng này trên quy mô lớn, trong những bồn lên men bằng thép Sau đó, insulin được tách ra

và tinh sạch đến sản phẩm cuối cùng Đứng đầu trong lĩnh vực này là công ty

Bio-Technology General Họ đã sử dụng một dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin được biểu

hiện trong tế bào E coli làm tăng hiệu suất của quá trình biểu hiện protein và

tăng hiệu quả của quá trình hình thành các cầu nối Sau đó, proinsulin được chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin và carboxypeptidase B Tiếp đó là công ty Hoechst, họ dùng phuơng pháp sản xuất insulin bao gồm biểu hiện một

dạng dẫn xuất mới của insulin hoặc biểu hiện pre-proinsulin trong E coli; tạo các cầu nối disulfur in vitro; sau đó, xử lý bằng lysylendopeptidase hoặc

clostripain/carboxypeptidase B; cuối cùng tạo ra insulin Tập đoàn Novo Nordisk cũng dùng phương pháp này để biểu hiện mini-proinsulin trong nấm

men, sau đó xử lý mini-proinsulin in vitro bằng trypsin tạo thành insulin [2]

Tập đoàn Eli Lilly thì dùng phương pháp sản xuất theo kiểu “hai chuỗi” riêng

biệt, sử dụng Escherichia coli, thu chuỗi A và chuỗi B, trộn với nhau in vitro để

tạo cầu nối disulfur Hiện nay, Eli Lilly phát triển một phương pháp cải tiến hơn, biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt như phương

pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi

A và B bằng trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin [2]

Gần đây nhất, người ta đã đưa thành công gen insulin vào thực

vật và sản xuất được insulin từ thực vật, đặc biệt là từ cây rum

(safflower) Hướng sản xuất mới này hứa hẹn giảm được giá thành

insulin và việc dùng insulin sẽ thuận lợi hơn, tự nhiên hơn do việc dùng thực phẩm trong bữa ăn hàng ngày mà lại có chứa insulin [2, 42, 43]

Nhu cầu insulin hiện nay

Trước khi khám phá ra hoạt động của insulin, bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ không có cơ hội có một cuộc sống khoẻ mạnh, đặc biệt là bệnh nhân ĐTĐ typ I Ngày nay, số người sử dụng insulin sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngày một tăng Năm 1996, ở Mỹ chi phí cho điều trị ĐTĐ là 90 tỷ USD [1, 2] Theo hãng Eli Lilly, năm 2001, 95% số bệnh nhân ĐTĐ trên thế giới đã sử dụng insulin người

Các nước phát triển đã dùng insulin tái tổ hợp thay cho insulin có nguồn gốc động vật Hầu hết các công ty lớn đã ngừng hẳn việc sản xuất insulin động vật do những nhược điểm đáng kể của nó so với insulin tái tổ hợp

Năm 2005, nhu cầu insulin dùng trong trị bệnh đái tháo đường ước tính khoảng 4.000 đến 5.000 kg và dự kiến năm 2010 là 16.000 kg Nhu cầu về insulin của thế giới vượt qua con số vài tấn/năm và vì thế nguồn cung cấp insulin cho điều trị bệnh đái tháo đường đang thiếu hụt Từ những thập niên

tách chiết từ tuyến tụy của động vật như heo và bò Tuy nhiên, insulin người có

sự khác biệt trong thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi

A và một vị trí trong chuỗi B) và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B) Do đó gây ra những tác dụng không mong muốn (dị ứng) khi sử dụng insulin dạng này Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều khó khăn Sau đó, các phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo

và bò đã được phát triển bằng cách sử dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) Insulin người được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên tại Công ty Genentech (Mỹ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường vào năm

1982 Trong lịch sử, đây cũng là lần đầu tiên các nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công

Insulin trên thị trường hiện nay:

Insulin đang được bán trên thị trường dưới dạng thuốc tiêm, có 3 loại chính, phân theo thời gian tác động của chúng:

1 Loại tác dụng nhanh: có tác dụng sau tiêm khoảng 5 phút và kéo dài 6-8

giờ Loại này gồm insulin tái tổ hợp, lợn hoặc bò kết tinh và được hoà tan dưới dạng dung dịch trong suốt

2 Loại tác dụng trung bình: có tác dụng sau khoảng 2 giờ tiêm và kéo dài

khoảng 18 giờ Loại này gồm insulin tái tổ hợp, lợn hoặc bò kết hợp với chlorua kẽm hoặc protamine để hình thành một phức hợp protein với một tỷ lệ insulin

tự do và insulin phức hợp nhất định để tạo ra một insulin có hoạt tính nằm giữa insulin nhanh và insulin chậm

3 Loại tác dụng chậm: có tác dụng sau khoảng 7 giờ và kéo dài khoảng 36

giờ Loại này gồm insulin tái tổ hợp, lợn hoặc bò kết hợp với chlorua kẽm hoặc protamine để hình thành một phức hợp protein bền, theo đó insulin được giải phóng chậm

Pre-proinsulin và Proinsulin

Cấu trúc phân tử của pre-proinsulin và proinsulin (Hình 2):

Hình 2 Sơ đồ cấu tạo và trình tự amino acid của proinsulin

Proinsulin được hình thành từ pre-proinsulin Pre-proinsulin là một chuỗi peptid dài có 109 amino acid, gồm 4 chuỗi peptid ngắn: chuỗi peptid tín hiệu (signal peptide), chuỗi peptid B, C và A Ở tế bào chất, pre-proinsulin bị thuỷ phân, tách ra peptid tín hiệu ở đầu N tận, gồm 23 acid amin Phần còn lại là proinsulin có cấu tạo chuỗi polypeptid đơn gồm 86 acid amin

Phân tử proinsulin tương đối nhỏ, có khối lượng khoảng hơn 6000 dalton, được cấu tạo bởi 3 chuỗi peptid A, B, và C Chuỗi A gồm 21 acid amin, chuỗi

B gồm 30 acid amin liên kết với nhau bằng hai cầu nối disulphur và chuỗi peptid C gồm 35 acid amin, còn gọi là chuỗi peptid nối Việc định lượng peptid

C cho biết lượng insulin trong máu là nội sinh hay ngoại sinh, cũng có tác dụng phân biệt giữa ĐTĐ týp I và ĐTĐ týp II [23]

Gen mã hoá proinsulin:

Nghiên cứu bộ gen người cho thấy, gen mã hoá proinsulin cũng như insulin nằm ở nhiễm sắc thể số 11, trên cánh ngắn (11p) gắn gen IGF và gen β - globin Gen proinsulin đã được tách, tạo dòng và giải trình tự vào những năm

70 của thế kỷ XX, gồm 2 vùng: vùng mang mã di truyền (coding region) và

vùng không mang mã di truyền (no coding region)

Vùng mang mã di truyền có kích thước 1430 bp, có 2 intron, intron thứ nhất nằm giữa đoạn trình tự mã hoá chuỗi peptid tín hiệu và chuỗi peptid B; intron thứ 2 nằm giữa đoạn gen mang mã di truyền mã hoá chuỗi peptid C

Đoạn gen mang mã di truyền mã hoá 4 chuỗi peptid trong cấu trúc của phân tử pre-proinsulin: chuỗi peptid tín hiệu, chuỗi peptid B, chuỗi peptid C và chuỗi peptid A

Vùng không mang mã di truyền chia làm 3 cụm gen ký hiệu class I, class

II và class III Trong vùng không mang mã, có các trình tự điều hoà, trình tự tăng cường hoạt động gen (exon splicing enhance) và các trình tự lặp lại

(repeats) [34]

Quá trình tổng hợp trong cơ thể:

Khi nồng độ glucose máu tăng, ngay lập tức ARN thông tin của insulin được dịch mã, tạo nên một chuỗi đơn ban đầu gọi là preproinsulin trong tụy

Pre-proinsulin bao gồm một trình tự tín hiệu đầu amin, cần thiết để tiền chất hormon này đi qua được màng lưới nội chất tham gia vào quá trình sau dịch mã Quá trình sau dịch mã loại đi những phần không cần thiết cho hormon

có hoạt tính sinh học Khi đã vào màng lưới nội chất thì đoạn trình tự tín hiệu của pre-proinsulin không còn cần thiết nữa Bằng việc thuỷ phân loại bỏ đi đoạn peptid tín hiệu của nó trong suốt quá trình đi vào các tuyến nội tiết, proinsulin được tạo ra [44, 45]

Một số nghiên cứu về proinsulin trên thế giới:

Proinsulin đã được nghiên cứu nhiều trước đây, từ cấu trúc phân tử đến quá trình chuyển hoá và sự biểu hiện của nó

Năm 1967, Steiner và Chance phát hiện ra cấu trúc phân tử proinsulin Năm 1981, Peter Gens và Geore Choury đã biểu hiện pre-proinsulin chuột bằng

tế bào thận khỉ [46], [47] Đến năm 1983, Orgad Lans đã biểu hiện gen proinsulin người bằng hệ thống tế bào của động vật có vú Năm 1992, Masahiko đã nghiên cứu biểu hiện proinsulin có biến đổi trên dòng tế bào COS

- 7 [48]

Gần đây, có rất nhiều các nghiên cứu với gen proinsulin nguyên bản hay

đã được biến đổi nhằm tạo insulin dễ dàng hơn, như nghiên cứu của Chol Soo Shin Seung năm 1997, G Chang năm 1998 tạo mini-proinsulin [49] Năm

2003, C.W Hayo đã biểu hiện proinsulin có các điểm cắt đặc hiệu cho việc tạo insulin thuận lợi hơn Cũng trong năm 2003, proinsulin người đã được Zhi - Song Qiao biểu hiện và nghiên cứu cả quá trình sắp xếp lại cấu trúc (refolding) sau biểu hiện [50]

Một số nghiên cứu proinsulin ở Việt Nam:

Một nghiên cứu được công bố của Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh, với sự kết hợp của công ty

Ajinomoto Đó là nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin của người

tái tổ hợp trong E coli Các tác giả đã biểu hiện thành công mini-proinsulin,

nhưng chưa nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học của protein này sau biểu hiện và về các điều kiện tối ưu trong quá trình biểu hiện [37, 38, 40, 41] Từ năm 2007, trường đại học Y Hà Nội cũng đã nghiên cứu và biểu hiện thành công proinsulin [35, 36]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chiến lược nghiên cứu:

Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo ra được chuỗi A và chuỗi B để làm nguyên liệu tạo ra phân tử insulin hoàn chỉnh Để đạt mục tiêu đó, đề tài đã tiếp cận bằng 2 cách: tạo proinsulin (gồm chuỗi A, B và C nối với nhau) và tạo riêng biệt chuỗi A và chuỗi B:

1 Đối với Proinsulin

1.1 Vật liệu

- cDNA Proinsulin tuyến tuỵ người của hãng Ambion, Mỹ (Catalog

#: AM3322, Human pancreas cDNA, Ambion Inc, USA)

pET28a (+) có kích thước 5369 bp, có điểm khởi đầu phiên mã của

pBR322, gen kháng kanamicin, chứa promoter lac được cảm ứng bằng IPTG

(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) khi biểu hiện (Sơ đồ 3)

Sơ đồ 3: Sơ đồ cấu tạo pET28a(+)

Vùng đa tách dòng (multi-cloning site, mũi tên đậm ngược chiều kim đồng hồ) chứa các vị trí

cắt của BamH I và Xho I

- Chủng tế bào E coli DH5a [F -end A1 hsdR17 (rk/mk) supE44 thiλ- recA1 gyrA96∆lacU169 (Φ80 lacZ∆M15)] (Catalog #: DA-10, MCLAB) được dùng

làm chủng để nhân bản plasmid Chủng E coli BL21 (DE3) [F -, ompT, hsdS

(rB- mB), gal (DE3)] được dùng để biểu hiện proinsulin

- Enzyme giới hạn được lựa chọn theo thiết kế mồi và vector là Bam HI

và Xho I của Invitrogen

1 2 Phương pháp

1.2.1 Khuếch đại gen proinsulin

Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi Pins trên hệ thống GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) với công thức cho 25 µl phản ứng là: 0,4 µM cho mỗi mồi, 5 µl đệm 5x, 1 µM dNTPs, 1 µl Taq ADN polymease, 1 µl cDNA và thêm nước đủ đến 25 µl Điều kiện cho phản ứng: 95oC trong 5 phút;

35 chu kỳ: 95oC trong 30 giây, 52oC trong 30 giây, 72oC trong 60 giâyvà một chu kỳ: 72oC/7 phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%; đồng

thời thu lại sản phẩm, làm sạch sản phẩm bằng kít “PCR purification kit“

(QIAGEN) để dùng cho nhân dòng

1.2.2 Tạo vector mang gen proinsulin

- Xử lý vector pET 28a(+) và sản phẩm PCR tinh sạch với enzym giới

hạn BamHI và XhoI

- Điện di sản phẩm phản ứng trên gel agarose 1,5%

- Xử lý băng sản phẩm (lý thuyết): cắt băng sản phẩm trên gel và tinh

sạch bằng bộ kít Gel extraction kit của QIAGEN Sản phẩm thu được sau tinh

sạch chính là sản phẩm của sự nối ghép tạo giữa pET28a với gen proinsulin tại

các vị trí cắt của BamHI và XhoI

1.2.3 Tạo dòng E coli DH5a mang plasmid tái tổ hợp

Hỗn hợp phản ứng nối được biến nạp vào E coli DH5a bằng phương

pháp sốc nhiệt (42oC trong 42 giây) E coli mang plasmid tái tổ hợp được sàng

lọc bằng cách cấy trên môi trường thạch có kanamicin 50 µg/ml Tách chiết plasmid này bằng phương pháp Birnboin [51] Plasmid thu được, được ký hiệu

là pET-PINS

Những khuẩn lạc mọc được trên đĩa thạch có kanamicin 50 µg/ml là những khuẩn lạc có mang plasmid, chọn vài khuẩn lạc để kiểm tra bằng PCR với chu trình như trên, điện di sản phẩm trên gel agarose 1,5% và thang ADN

100 bp để kiểm tra sản phẩm, PCR cho kết quả dương tính với proinsulin thì khuẩn lạc đó có chứa plasmid tái tổ hợp Khi một khuẩn lạc nào đó được xác định là có mang plasmid tái tổ hợp mong đợi (mang gen proinsulin) thì cấy chuyển chúng sang môi trường LB để thu sinh khối, tách plasmid bằng QIAprepSpin Miniprep Kit (QIAGEN) Plasmid tái tổ hợp được giải trình tự theo phương pháp Sanger [21] với BigDye terminator v3.1 của Applied Biosystems Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự proinsulin chuẩn bằng phần mềm BLAST

1.2.5 Cảm ứng biểu hiện và phân tích bằng SDS -PAGE

Tương tự như tạo dòng E coli DH5a mang plasmid tái tổ hợp, plasmid tái tổ hợp cũng được biến nạp vào tế bào biểu hiện E coli BL21(DE3) (42oC/42 giây), sau đó nuôi cấy sàng lọc kiểm tra và được nuôi cấy trong môi trường LB,

có bổ xung kanamicin (50 µg/ml), nuôi ở 37oC, lắc 200 vòng /phút Khi mật độ

tế bào A600 đạt 0,8 thì bổ sung chất cảm ứng, IPTG (Isopropyl thiogalactopyranoside), nồng độ 1 mM nhằm cảm ứng biểu hiện proinsulin

β-D-1-Thu sinh khối và phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm trong đệm PBS, điện

di trên gel polyacrylamid 15% có SDS (SDS-PAGE) (Laemmli 1970), có thang chuẩn protein, thu hình ảnh và phân tích kết quả

1.2.6 Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực và nhận dạng bằng Western blot

Sắc ký ái lực được thực hiện trên cột 1,0 x 120 cm (Amersham Biosciences) với ProPond Resin, cân bằng cột với 250 mM NaH2PO4, pH 8,0 Mẫu được hoà tan trong đệm cân bằng và cho qua cột Thôi (elute) cột bằng Imidazole 3M, pH 6,0 Thể tích mỗi phân đoạn là 2 ml, kết quả được kiểm tra bằng OD280 và điện di trên SDS-PAGE để phân tích kết qu¶ Sau đó, sản phẩm được nhận dạng bằng Western blot

2 Đối với insulin: chuỗi A, B

Chiến lược (Sơ đồ 4)

Sơ đồ 4: Chiến lược sản xuất insulin theo hướng “hai chuỗi”

2.1 Vật liệu

- Vector tái tổ hợp pET14bInsA chứa chuỗi A và pET14bInsB chứa chuỗi B được thiết kế và xác định ở trường đại học tổng hợp Osaka, Nhật Bản (Sơ đồ 5)

Sơ đồ 5: Sơ đồ cấu tạo vector pET14b

Vector này chứa các vị trí cắt đặc hiệu của NcoI và BamHI

- Vector pET32c (Novagen) được cài chuỗi A, B lấy từ pET14bIns tại Viện Công nghệ sinh học (Sơ đồ 6):

Sơ đồ 6: Sơ đồ cấu tạo vector pET32

- Chủng tế bào E coli DH5a [F -end A1 hsdR17 (rk/mk) supE44 thiλ- recA1 gyrA96∆lacU169 (Φ80 lacZ∆M15)] (Catalog #: DA-10, MCLAB) được dùng

làm chủng để nhân bản plasmid Chủng E coli BL21 (DE3) [F -, ompT, hsdS

(rB- mB), gal (DE3)] được dùng để biểu hiện insulin