Xây dựng quy trình xác định dư lượng thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, clorantraniliprol, alpha cypermethrin trên rau củ tại thành phố cần thơ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN HUỲNH PHƯƠNG UYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THIAMETHOXAM, IMIDACLOPRID, ACETAMIPRID, CLORANTRANILIPROL, ALPHA CYPERMETHRIN TRÊN RAU CỦ TẠI THÀNH PHỐ CẦN THƠ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CẦN THƠ – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN HUỲNH PHƯƠNG UYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THIAMETHOXAM, IMIDACLOPRID, ACETAMIPRID, CLORANTRANILIPROL, ALPHA CYPERMETHRIN TRÊN RAU CỦ TẠI THÀNH PHỐ CẦN THƠ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành:Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 60.72.04.10 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.DS PHẠM THỊ TỐ LIÊN CẦN THƠ – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn Cô TS DS Phạm Thị Tố Liên Các số liệu kết nêu luận văn trung thực, chưa công bố cơng trình khác Cần Thơ, ngày tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Huỳnh Phương Uyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô TS DS Phạm Thị Tố Liên nhiệt tình hướng dẫn, định hướng, hỗ trợ tạo điều kiện cho tơi kiến thức q báu để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Phòng đào tạo Sau Đại học Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Khoa Dược Trường Đại học Y Dược Cần Thơ tạo điều kiện giúp hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn Ban Giám Đốc Công Ty Cổ Phần Warrantek - Cần Thơ hỗ trợ thiết bị trình nghiên cứu thực nghiệm để tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn anh chị em Công Ty Cổ Phần Warrantek - Cần Thơ, hỗ trợ nhiều trình nghiên cứu thực nghiệm Và cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè quan tâm động viên tơi q trình học tập thực luận văn MỤC LỤC Trang Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu hóa chất bảo thực vật 1.1.2 Tổng quan thuốc bảo vệ thực vật………………… 1.2 Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật phương pháp xác định 14 1.2.1 Quy định mức dư lượng tối đa cho phép……………… 14 1.2.2 Phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật… 15 1.3 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật 18 1.3.1 Các quy trình xử lý mẫu…………………………………… 18 1.3.2 Tình hình nghiên cứu phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật rau củ ………………………………………………………… 21 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng, địa điểm vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 24 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ………………………………………… 24 2.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu………………………… 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu………………………………………… 25 2.2.2 Cỡ mẫu……………………………………………………… 25 2.2.3 Phương pháp chọn mẫu…………………………………… 25 2.2.4 Nội dung nghiên cứu……………………………………… 25 2.2.5 Phương pháp thu thập số liệu………………… 34 2.2.6 Phương pháp hạn chế sai số……………………………… 36 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu………………………………… 36 2.3 Đạo đức nghiên cứu…………………………………… 36 Chƣơng KẾT QUẢ 37 3.1 Xây dựng qui trình xác định đồng thời dư lượng thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, chlorantraniliprole, alpha cypermethrin rau phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao……………… 37 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký tách thuốc bảo vệ thực vật hỗn hợp chuẩn…………………………………………………… 37 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu…………………………… 40 3.1.3 Thẩm định quy trình phân tích…………………………… 44 3.2 Ứng dụng quy trình để xác định tỉ lệ rau củ có tồn dư thuốc bảo vệ thực vật…………………………………………………………… 50 CHƢƠNG BÀN LUẬN…………………………… ………52 4.1 Xây dựng qui trình xác định đồng thời dư lượng thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, chlorantraniliprole, alpha cypermethrin rau phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao……………… 52 4.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký tách thuốc bảo vệ thực vật hỗn hợp chuẩn…………………………………………………… 52 4.1.2 Xây dựng qui trình xử lý mẫu…………………………… 55 4.1.3 Thẩm định qui trình phân tích…………………………… 62 4.2 Ứng dụng qui trình để xác định tỉ lệ rau củ có tồn dư thuốc bảo vệ thực vật…………………………………………………………… 63 KẾT LUẬN………………………………………………………… 65 KIẾN NGHỊ…… .……………………………………………… 66 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt, ký Chữ nguyên Tiếng Việt ACP Alpha cypermethrin Alpha cypermethrin ACT Acetamiprid Acetamiprid hiệu AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà hóa học phân tích thức BVTV Bảo vệ thực vật Bảo vệ thực vật CLR Chlorantraniliprol Chlorantraniliprol Food and Agriculture Tổ chức lương thực Organization of the Nông nghiệp Liên Hiệp United Nations Quốc High performance Sắc kí lỏng hiệu liquid chromatography cao IMD Imidacloprid Imidacloprid TMX Thiamethoxam Thiamethoxam FAO HPLC DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các thuốc trừ sâu sử dụng nghiên cứu……… 10 Bảng 1.2 Mức MRL theo Bộ y tế…………………………………… 14 Bảng 1.3 Mức MRL theo Codex…………………………………… 15 Bảng 1.4 Tóm tắt nghiên cứu thuốc BVTV…………………… 23 Bảng 2.1 Khảo sát thành phần tỉ lệ pha động………………… 26 Bảng 2.2 Khảo sát phương pháp chiết…………………… 29 Bảng 2.3 Khảo sát hỗn hợp muối sử dụng 29 Bảng 2.4 Khảo sát hỗn hợp chất hấp phụ 29 Bảng 2.5 Nồng độ thuốc BVTV xác định khoảng tuyến tính 31 Bảng 2.6 Nồng độ thuốc BVTV xác định độ 32 Bảng 2.7 Mã hóa nơi lấy mẫu loại rau 33 Bảng 2.8 Các dung mơi, hóa chất sử dụng nghiên cứu 34 Bảng 2.9 Thông tin chất chuẩn sử dụng nghiên cứu 34 Bảng 3.1 Kết điều kiện sắc ký khảo sát 37 Bảng 3.2 Kết khảo sát hỗn hợp muối sử dụng 42 Bảng 3.3 Kết tính tương thích hệ thống 45 Bảng 3.4 Kết khoảng tuyến tính đường hồi qui 47 Bảng 3.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 48 Bảng 3.6 Độ độ xác nồng độ thấp 49 Bảng 3.7 Độ độ xác nồng độ trung bình 49 Bảng 3.8 Độ độ xác nồng độ cao 50 Bảng 3.9 Kết phân tích mẫu rau ứng dụng 51 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Tóm tắt quy trình chiết QuEChERS theo phiên 20 Hình 2.1 Qui trình xử lý mẫu phương pháp QuEChERS cải tiến đề xuất 28 Hình 3.1 Sắc ký đồ chương trình gradient bước sóng tối ưu 38 Hình 3.2 Biểu đồ gradient pha động 40 Hình 3.3 Sắc ký đồ dịch chiết sau làm SPE 40 Hình 3.4 Biểu đồ khảo sát yếu tố phương pháp chiết 41 Hình 3.5 Biểu đồ kết khảo sát hỗn hợp chất hấp phụ 42 Hình 3.6 Dịch chiết sau xử lý khảo sát yếu tố từ C1-5 43 Hình 3.7 Qui trình xử lý mẫu tối ưu 43 Hình 3.8 Sắc ký đồ tương thích hệ thống imidacliprid 44 Hình 3.9 Sắc ký đồ độ đặc hiệu TMX, IMD, ACT, CLR 46 Hình 3.10 Sắc ký đồ đặc hiệu ACP 46 Hình 3.11 Đồ thị tuyến tính ACP 47 Hình 3.12 Đồ thị tuyến tính TMX, IMD, ACT, CLR 48 Hình 4.1 Dịch chiết yếu tố A1, 2, 3, .57 Hình 4.2 Dịch chiết không lọc lọc bã rau 59 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nước có nơng nghiệp phát triển lâu đời với nhiều mặt hàng nông sản xuát chủ lực mang tầm vóc quốc tế gạo, điều, cà phê, gia vị, rau củ Tuy nhiên, việc bùng nổ dân số, với xu hướng thị hóa cơng nghiệp hóa ngày mạnh để đáp ứng nhu cầu nơng sản cách thâm canh để tăng sản lượng trồng [16] Khi thâm canh hậu tất yếu tránh gây cân sinh thái, kéo theo phá hoại dịch hại ngày tăng Bên cạnh đó, nước ta có khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm quanh năm điều kiện thuận lợi cho phát triển trồng môi trường tốt cho phát sinh phát triển sâu bệnh, cỏ dại Theo thống kê, thất thu hàng năm loài dịch hại gây chiếm khoảng 35% khả sản lượng mùa màng (khoảng 75 tỷ đôla); thiệt hại sâu 13,8% (29,7 tỷ đơla); bệnh 11,6% (24,8 tỷ đôla); cỏ dại 9,5% (20,4 tỷ đơla) Nếu tính cho diện tích nơng nghiệp giới 1,5 tỷ hécta, khơng kể đồng cỏ bãi hoang thiệt hại bình qn 47- 60 đơla hécta [10] Để giảm thiệt hại dịch hại gây người nơng dân cần sử dụng biện pháp phịng trừ, biện pháp hóa học coi quan trọng.[16] Kết khảo sát 120 hộ nông dân thực xã thuộc tỉnh Vĩnh Long cho thấy: nhóm hoạt chất sử dụng phổ biến thuốc có nguồn gốc sinh học (29,8%), cúc tổng hợp (16,1%), lân hữu (15,5%), cyanoamidine (13,6%), phenylpyrazol (10,7%) carbamat (7,3%) Cũng qua khảo sát cho thấy 120 hộ nơng dân có hộ (chiếm 5,83%) sử dụng loại hoạt chất suốt thời gian canh tác Tất hộ lại phối trộn – hoạt chất nhằm mở rộng phổ tác dụng tăng hiệu lực phòng trừ sâu bệnh [28] Sắc ký đồ mũi tiêm từ – Sắc ký đồ dung môi pha động dung môi pha mẫu PH L C DỮ LIỆU THƠ THẨ ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH Dữ liệu tính tuyến tính Thiamethoxam Nồng độ 0.5 10 Trung bình 175.6754 295.9661 517.033 984.5034 1793.261 2403.864 Diện tích đỉnh 187.97977 129.3678 342.05347 227.046 597.83563 480.8196 965.12677 1077.574 1867.95764 1801.822 2596.83032 2362.881 209.6786 318.7988 472.4438 910.8097 1710.002 2251.881 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.998433792 R Square 0.996870037 Adjusted R Square 0.996087546 Standard Error 55.97358725 Observations ANOVA df Regression Residual Total Intercept X Variable Flt Tlt SS MS 3991402.839 3991403 12532.16988 3133.04 4003935.009 Coefficients Standard Error t Stat 59.97401659 35.47268478 1.69071 227.8611141 6.383966165 35.6927 7.708647422 2.776445105 F Significance F 1273.970231 3.67759E-06 P-value Lower 95% Upper 95%Lower 95.0% Upper 95.0% 0.166154548 -38.51394545 158.462 -38.5139 158.462 3.67759E-06 210.1363825 245.5858 210.1364 245.5858 y = 227.8611x Dữ liệu tính tuyến tính Imidacloprid Nồng độ 0.5 10 Trung bình 145.1759 296.691 574.1487 1216.796 2349.345 3234.027 Diện tích đỉnh 146.39186 146.7872 319.50357 273.3902 659.44379 575.1591 1325.83215 1218.243 2339.16821 2405.632 3209.6748 3375.409 142.3486 297.1793 487.8431 1106.312 2303.235 3116.997 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.99781 R Square 0.99562 Adjusted R Square 0.99453 Standard Error 91.8735 Observations ANOVA df Regression Residual Total Intercept X Variable 1 SS MS F Significance F 7681809.844 7681809.844 910.086299 7.19137E-06 33762.99525 8440.748813 7715572.839 Coefficients Standard Error t Stat P-value -40.7733 58.22391536 -0.700283627 0.52234084 316.111 10.47847119 30.16763661 7.1914E-06 Flt tlt 7.708647422 2.776445105 y = 316.1107x Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% -202.4287594 120.8822502 -202.4287594 120.8822502 287.0178111 345.2036112 287.0178111 345.2036112 Dữ liệu tính tuyến tính Acetamiprid Nồng độ 0.5 10 Trung bình 180.0516 389.2908 691.2382 1430.486 2555.33 3418.01 Diện tích đỉnh 191.87364 177.6967 446.51709 338.778 776.07184 685.6683 1534.80164 1466.017 2756.30835 2426.685 3669.42432 3432.815 170.5844 382.5772 611.9746 1290.64 2482.998 3151.792 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.998354465 R Square 0.996711638 Adjusted R Square 0.995889547 Standard Error 83.14214335 Observations ANOVA df Regression Residual Total SS MS 8380931.982 8380932 27650.46401 6912.62 8408582.446 Coefficients Standard Error t Stat 40.79378891 52.69047757 0.77422 330.1821519 9.482626648 34.8197 Intercept X Variable Flt tlt 7.708647422 2.776445105 F Significance F 1212.411044 4.05945E-06 P-value Lower 95% Upper 95% 0.482018976 -105.4984296 187.086007 4.05945E-06 303.8541595 356.510144 y = 330.1822x Lower 95.0% Upper 95.0% -105.4984296 187.0860074 303.8541595 356.5101442 Dữ liệu tính tuyến tính Clorantraniliprol Nồng độ 0.5 10 Trung bình 14.46169 36.79753 98.21307 182.5012 432.0565 Diện tích đỉnh 9.83933 20.991 50.11374 26.24246 103.37463 121.018 182.87122 211.672 419.1106 502.6541 12.55474 34.03638 70.24654 152.9603 374.4048 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.99868 R Square 0.99736 Adjusted R Square 0.99648 Standard Error 10.0394 Observations ANOVA df Regression Residual Total Intercept X Variable 1 SS MS F Significance F 114137.7759 114137.7759 1132.44591 5.76854E-05 302.3661648 100.7887216 114440.142 Coefficients Standard Error t Stat P-value 0.15236 6.382432267 0.023872552 0.98245339 43.6153 1.296075625 33.65183373 5.7685E-05 Flt tlt 7.708647422 2.776445105 Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% -20.15938304 20.46411293 -20.15938304 20.46411293 39.49063036 47.74001253 39.49063036 47.74001253 y = 43.6153x Dữ liệu tính tuyến tính Alpha cypermethrin Nồng độ Trung bình 39.38859 54.38675667 144.9024067 188.36181 10 335.33722 Diện tích đỉnh 44.32025 46.40167 78.53252 25.16054 125.2016 185.4687 220.3113 160.5638 393.8631 541.3302 27.4439 59.4672 124.037 184.21 70.8183 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.995996909 R Square 0.992009842 Adjusted R Square 0.989346456 Standard Error 12.34215277 Observations ANOVA df Regression Residual Total Intercept X Variable Flt tlt SS 56736.7 456.986 57193.6 MS F Significance F 56736.65221 372.4619141 0.000303855 152.328735 Coefficients Standard Error -0.65267651 9.66542 33.28870286 1.72487 7.708647422 2.776445105 t Stat P-value Lower 95% -0.067526964 0.95041081 -31.41235886 19.29927237 0.000303855 27.79940216 y = 33.2887x Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% 30.10700583 -31.41235886 30.10700583 38.77800357 27.79940216 38.77800357 Dữ liệu độ độ xác Thiamethoxam ồng độ Số lần Ngày Ngày Ngày (µg/mL) tiêm 0.44422 0.46167 0.44170 0.43657 0.44026 0.43300 0.51 0.42579 0.45118 0.44208 0.44297 0.47554 0.47922 1.06473 0.92102 1.12920 1.00983 1.06391 0.92556 1.02 1.04949 0.92614 1.10948 0.93888 1.07499 0.94410 2.17563 1.89041 2.05879 1.81871 2.06668 1.85378 2.03 2.14930 1.85795 2.20349 1.88922 1.97773 1.71672 0.53159 0.51608 0.46716 0.51942 0.60359 0.52777 1.07095 1.07918 1.07502 1.06865 1.00566 1.08649 2.14390 2.12638 1.89209 2.05674 2.12356 2.10358 Dữ liệu độ độ xác Imidacloprid ồng độ Số lần Ngày (µg/mL) tiêm 0.54 1.07 2.15 6 0.50887 0.49299 0.49244 0.51555 0.50268 0.50551 0.96288 0.99075 0.96381 1.01858 0.98584 0.96885 1.99042 1.95936 1.89865 2.00138 2.02092 1.99082 Ngày 0.52115 0.51045 0.50987 0.52198 0.51193 0.51476 0.93816 0.94433 0.95161 0.94650 0.95968 0.93641 1.98800 1.94751 1.94712 1.88367 2.03250 1.97921 Ngày 0.51993 0.51473 0.51798 0.51765 0.51407 0.49236 0.99491 0.99970 1.01008 0.98054 0.93360 0.97275 2.03333 2.08996 2.07414 2.01603 2.05262 2.06762 Dữ liệu độ độ xác Acetamiprid ồng độ Số lần Ngày (µg/mL) tiêm 0.51 1.03 2.05 6 0.45130 0.46526 0.48050 0.50268 0.47732 0.46884 0.98913 0.96592 0.98120 0.97905 0.93812 0.96196 2.00180 1.96916 2.00678 1.98711 1.98185 2.02098 Ngày 0.51776 0.52223 0.52091 0.50112 0.51682 0.52072 1.08952 1.02099 1.08394 1.05813 1.06265 1.02426 1.97682 1.92258 1.97283 1.92750 1.97479 1.99012 Ngày 0.50486 0.51074 0.50731 0.50933 0.50852 0.51480 0.91733 0.94432 0.91703 0.94213 0.95002 0.97275 2.12458 2.12643 2.05728 1.98560 2.05262 2.11797 Dữ liệu độ độ xác Clorantraniliprol ồng độ Số lần Ngày (µg/mL) tiêm 0.53 1.06 2.11 6 0.49533 0.49009 0.50965 0.41703 0.48897 0.53982 1.08314 1.21192 1.15330 1.13976 1.06283 1.06106 1.98107 1.97566 2.10828 1.95896 1.86676 1.89984 Ngày 0.57123 0.49995 0.47969 0.60264 0.53645 0.54191 0.94682 0.90004 0.92958 0.86264 0.93602 1.04638 1.96658 2.34009 2.06850 1.89829 1.81800 1.69757 Ngày 0.54473 0.58412 0.46246 0.53840 0.56278 0.52409 1.00118 1.01008 0.96832 1.00764 0.94088 1.12318 2.17556 2.12643 1.99723 1.90839 2.14037 2.04882 Dữ liệu độ độ xác Alpha cypermethrin ồng độ Số lần Ngày (µg/mL) tiêm 2.23 3.35 4.47 6 1.99955 2.02788 2.02246 1.94088 1.97868 2.04917 2.97664 3.08756 3.05880 3.02737 3.11171 2.89903 3.96802 3.92681 3.94302 4.10373 4.09466 4.00509 Ngày 2.06904 2.00370 2.03196 1.93033 1.95778 1.98830 3.01469 3.05735 3.00368 2.98255 2.94982 3.02045 4.06034 4.09129 4.10262 4.10477 3.96496 4.10382 Ngày 2.06750 1.99656 1.98299 1.99920 1.92787 2.08586 3.06168 3.06820 3.01015 3.02705 2.97874 2.98248 4.04460 4.15804 4.06193 3.96911 4.02115 4.01001 Ữ IỆU ỨNG D G ĐỊ Mẫu A1 ƯỢNG TRÊN MẪU RAU Mẫu B1 Mẫu B2 Mẫu C2 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC C? ?N THƠ NGUY? ?N HUỲNH PHƯƠNG UY? ?N XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THIAMETHOXAM, IMIDACLOPRID, ACETAMIPRID, CLORANTRANILIPROL, ALPHA CYPERMETHRIN TR? ?N RAU CỦ TẠI THÀNH PHỐ... chlorantraniliprole, alpha cypermethrin rau phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Ứng dụng qui trình thẩm định để xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật rau củ b? ?n chợ qu? ?n Cái Răng, thành phố C? ?n Thơ 3 Chƣơng TỔNG... cho phương pháp Tuy nhi? ?n, phương pháp sắc ký sử dụng nhiều Trong phương pháp sắc ký sắc ký lỏng sắc ký khí ứng dụng nhiều 1.2.2.1 Kỹ thuật sắc ký khí Sắc ký khí xem kỹ thuật ph? ?n tích dư lượng