Thông tin tài liệu
i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ NGUYỄN TẤN ĐẠT NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA TẠP A CỦA DICLOFENAC ĐƢỢC TỔNG HỢP ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẨM CÓ DICLOFENAC Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 60.72.04.10 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN Cần Thơ - Năm 2019 ii LỜI CAM ĐOAN Nhóm nghiên cứu cam đoan kết nghiên cứu trung thực chƣa đƣợc công bố đề tài Nguyễn Tấn Đạt iii LỜI CẢM ƠN Con xin kính gửi lời tri ân đến cha mẹ gia đình ln đồng hành biến cố sống Em xin kính gửi lời tri ân đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Hội đồng đánh giá luận văn Khoa Dƣợc Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ tạo điều kiện học tập tốt cho chúng em Em xin kính gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Nguyễn Thị Ngọc Vân, em xin cảm ơn cô tận tình hƣớng dẫn chúng em suốt trình thực đề tài, cô gƣơng sáng cho chúng em học tập lĩnh vực chuyên môn nhiều điều quý giá khác từ cách nhìn sống Em xin chân thành cảm ơn Thầy Nguyễn Đức Tuấn, Thầy Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Thầy Lữ Thiện Phúc truyền dạy cho chúng em kiến thức tảng quý báu giúp chúng em vững bƣớc đƣờng định hƣớng xây dựng đề tài Em xin chân thành cảm ơn Cô Võ Huỳnh Trang, Thầy Lê Thành Tụ, cô Quản Thị Thu Trang, cô Huỳnh Ngọc Nhƣ Quỳnh, cô Dƣơng Thị Thanh Tâm, anh Nguyễn Minh Đạt, chị Lê Vinh Bảo Châu, bạn Nguyễn Thanh Quân anh chị, thầy Phịng thí nghiệm phân tích trung tâm - Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM, Phịng thí nghiệm Cơng nghệ hóa học Dầu khí Đại học Bách Khoa TP HCM, Trung tâm ngoại ngữ - Đại học Cần Thơ, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP HCM, tận tình giúp đỡ chúng em trình thực đề tài Em xin cảm ơn anh chị đồng nghiệp Trung tâm thực hành Y Dƣợc - Trƣờng Đại học Võ Trƣờng Toản, cảm ơn anh chị lớp Cao học Chuyên khoa Kiểm nghiệm thuốc độc chất Khóa 2017 – 2019 giúp đỡ em thời gian qua Em xin gửi lời cảm ơn đến Bác sĩ Thăng anh chị y bác sĩ Bệnh viện Tâm thần TP HCM iv MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục bảng .viii Danh mục hình vẽ, đồ thị x ĐẶT VẤN ĐỀ 45 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Tạp chất tạp chất đối chiếu 1.2 Diclofenac tạp chất A diclofenac 1.3 Kiểm nghiệm tạp chất A diclofenac 56 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 60 2.1 Đối tƣợng 60 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 60 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 60 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 60 2.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 60 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 61 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 61 2.2.2 Cỡ mẫu 61 2.2.3 Phƣơng pháp chọn mẫu 61 2.2.4 Nội dung nghiên cứu 61 2.2.5 Phƣơng pháp thu thập đánh giá số liệu 67 v 2.2.6 Phƣơng pháp hạn chế sai số 68 2.2.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 68 Chƣơng 3: KẾT QUẢ 25 3.1 Tiêu chuẩn hóa tạp chất đối chiếu A diclofenac 25 3.2 Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời diclofenac tạp chất A thành phẩm thuốc phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao 36 3.3 Ứng dụng quy trình định lƣợng đồng thời diclofenac tạp chất A thành phẩm thuốc phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao 42 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 45 4.1 Tiêu chuẩn hóa tạp chất đối chiếu A diclofenac 45 4.2 Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời diclofenac tạp chất A thành phẩm thuốc phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao 52 4.3 Ứng dụng quy trình định lƣợng đồng thời diclofenac tạp chất A thành phẩm thuốc phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao 57 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT TỪ NGUYÊN Ý NGHĨA ACN Acetonitril Acetonitril AP Acid phosphoric Acid phosphoric As Asymmetry Hệ số bất đối BP British Pharmacopoeia Dƣợc điển Anh DĐVN Dƣợc điển Việt Nam Dƣợc điển Việt Nam DIC Diclofenac Diclofenac DTA Differential thermal analysis Phân tích nhiệt vi sai e Giới hạn tin cậy Giới hạn tin cậy ESI Electrospray ionization Ion hóa phun electron Flt Giá trị F lý thuyết Giá trị F lý thuyết Ftn Giá trị F thực nghiệm Giá trị F thực nghiệm HPLC High performance liquid chromatography The International Council for Harmonisation of Technical ICH Requirements for Pharmaceuticals for Human Use The International ISO Organization for Standardization Sắc ký lỏng hiệu cao Hội nghị Quốc tế Hài hịa hóa thủ tục đăng ký dƣợc phẩm sử dụng cho ngƣời Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc tế IR Infrared Hồng ngoại k’ Capacity factor Hệ số dung lƣợng LOD Limit of Detection Giới hạn phát vii LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lƣợng Khoảng tin cậy Khoảng tin cậy m/z Mass-to-charge ratio MeOH Methanol Methanol MS Mass spectrometry Khối phổ N The number of theoretical plates Tỉ số khối lƣợng điện tích Số đĩa lý thuyết NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân PDA Photometric Diode Array Dãy diod quang Rs Resolution Hệ số phân giải RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối S Area Diện tích đỉnh S/N Signal-to-noise ratio Tỉ lệ tín hiệu nhiễu TB Trung bình Trung bình TGA Thermogravimetric analysis Phân tích nhiệt vi sai tR Retention Time Thời gian lƣu U Measurement uncertainty Độ không đảm bảo đo USP United States Pharmacopeia Dƣợc điển Mỹ UV-Vis Ultraviolet–visible Tử ngoại – khả kiến viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Giới hạn cho phép tạp chất nguyên liệu Bảng 1.2: Ngƣỡng báo cáo tạp chất thành phẩm Bảng 1.3: Ngƣỡng định danh tạp chất thành phẩm Bảng 1.4: Ngƣỡng xác định độc tính tạp chất thành phẩm Bảng 1.5: Giới hạn tối đa cho phép tạp chất A diclofenac 56 Bảng 1.6: Các nghiên cứu định lƣợng tạp chất A diclofenac 56 Bảng 2.1: Danh mục hóa chất 67 Bảng 2.2: Danh mục thiết bị 67 Bảng 3.1: Hiệu suất quy trình tổng hợp tinh chế 25 Bảng 3.2: Kết xác định độ tinh khiết 26 Bảng 3.3: Các đỉnh đặc trƣng phổ IR sản phẩm 28 Bảng 3.4: Dữ liệu phổ 13C-NMR 30 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR 30 Bảng 3.6: Kết tính tƣơng thích hệ thống 31 Bảng 3.7: Kết khảo sát tính tuyến tính 33 Bảng 3.8: Kết khảo sát độ xác 33 Bảng 3.9: Kết khảo sát độ 33 Bảng 3.10: Kết đánh giá tạp chất A diclofenac 34 Bảng 3.11: Kết định lƣợng sau q trình đóng lọ 34 Bảng 3.12: Kết phân tích ANOVA yếu tố 35 Bảng 3.13: Kết định lƣợng hai phịng thí nghiệm 35 Bảng 3.14: Kết phân tích ANOVA hai yếu tố 35 Bảng 3.15: Kết giá trị ấn định 36 Bảng 3.16: Kết khảo sát pha động 36 Bảng 3.17: Kết tính tƣơng thích hệ thống 38 Bảng 3.18: Kết khảo sát tính tuyến tính diclofenac 41 ix Bảng 3.19: Kết khảo sát tính tuyến tính tạp A 41 Bảng 3.20: Kết khảo sát độ xác 41 Bảng 3.21: Kết khảo sát độ 42 Bảng 3.22: Kết ứng dụng định lƣợng mẫu thành phẩm 43 Bảng 3.23: Kết ứng dụng định lƣợng mẫu điều kiện bảo quản bất lợi 44 Bảng 4.1: Diện tích pic mẫu chuẩn 58 x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo diclofenac Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo tạp chất A diclofenac 55 Hình 2.1: Sơ đồ tổng hợp theo quy trình 62 Hình 2.2: Sơ đồ tổng hợp theo quy trình 62 Hình 2.3: Sơ đồ tổng hợp theo quy trình 62 Hình 2.4: Sơ đồ tổng hợp theo quy trình 63 Hình 3.1: Sơ đồ tổng hợp tinh chế tạp A 25 Hình 3.2: Độ tinh khiết pic sắc ký đồ 3D xác định độ tinh khiết 26 Hình 3.3: Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết sản phẩm 27 Hình 3.4: Phổ IR sản phẩm 27 Hình 3.5: Phổ MS sản phẩm 28 Hình 3.6: Phổ 1H-NMR sản phẩm tổng hợp 29 Hình 3.7: Phổ 13C-NMR sản phẩm tổng hợp 29 Hình 3.8: Công thức cấu tạo tạp chất A diclofenac 31 Hình 3.9: Sắc ký đồ tính đặc hiệu quy trình định lƣợng tạp A 32 Hình 3.10: Độ tinh khiết pic tạp chất A mẫu thử 32 Hình 3.11: Phổ UV mẫu thử, mẫu chuẩn mẫu thử thêm 32 Hình 3.12: Sắc ký đồ khảo sát pha động 37 Hình 3.13: Sắc ký đồ tính đặc hiệu quy trình định lƣợng 38 Hình 3.14: Sắc ký đồ tính đặc hiệu mẫu phân hủy 39 Hình 3.15: Độ tinh khiết pic diclofenac tạp A 40 Hình 3.16: Sắc ký đồ mẫu LOD LOQ tạp A 40 Hình 3.17: Sắc ký đồ mẫu ứng dụng 44 Hình 4.1: Giai đoạn phản ứng tổng hợp tạp A 48 Hình 4.2: Giai đoạn phản ứng tổng hợp tạp A 49 92 chọn lọc cao hơn, tạo sản phẩm phụ hơn, nên oxalyl clorid lựa chọn tốt cho quy trình tổng hợp tạp A - Dimethylformamid chất xúc tác thƣờng đƣợc sử dụng phản ứng tạo acyl clorid Tuy nhiên, nhiệt độ sôi dimethylformamid cao, khoảng 153oC Vì thế, sau phản ứng, cần thực quay dƣới áp suất giảm nhằm loại bỏ dung môi, đảm bảo an tồn phịng thí nghiệm tránh ảnh hƣởng nhiệt độ cao đến chất lƣợng sản phẩm - Phân tích chế phản ứng tổng hợp tạp A theo Clayden [13] gồm ba giai đoạn nhƣ sau: + Giai đoạn 1: oxalyl clorid phản ứng với DMF tạo phức hợp iminium + Giai đoạn 2: phức iminium phản ứng với DIC tạo hợp chất acyl clorid giải phóng DMF với gốc acyl R (2,6-dichlorophenylamino)phenyl + Giai đoạn 3: gốc acyl clorid tự phản ứng với nhóm amin cấu trúc tạo liên kết amid, đóng vịng lactam Hình 4.1: Giai đoạn phản ứng tổng hợp tạp A 93 Hình 4.2: Giai đoạn phản ứng tổng hợp tạp A - Từ chế phản ứng tổng hợp tạp A, nhận thấy sản phẩm phụ đƣợc tạo thành từ phản ứng hỗn hợp khí CO, CO2 HCl Vì thế, thêm từ từ tác nhân oxalyl clorid vào phản ứng, nhận thấy có tƣợng xuất bọt khí phát sinh mùi clo nồng nặc Để đảm bảo an tồn phịng thí nghiệm, nên thực q trình tổng hợp tạp chất A tủ hốt có trang bị lọc khí, thƣờng sử dụng tủ hốt có màng lọc than hoạt tính - Sau thêm oxalyl clorid, để yên khoảng 30 phút, dung dịch sản phẩm biến đổi màu sắc đậm dần từ không màu sang màu vàng nhạt Sản phẩm sau tinh chế có màu nâu nhạt giống nhƣ màu sắc tạp chất A đƣợc mô tả tài liệu tham khảo [11], [35] với nhiệt độ nóng chảy xác định máy Bibby Stuart SMP3 khoảng 128oC 4.1.2 Xác định độ tinh khiết cấu trúc Lựa chọn phƣơng pháp HPLC pha đảo, đầu dò PDA, chế độ Max plot để xác định độ tinh khiết sản phẩm sau tinh chế phƣơng pháp có độ tin cậy cao, phù hợp với cấu trúc, độ phân cực sản phẩm dự kiến phù hợp với điều kiện thực tế phịng thí nghiệm Trên sắc ký đồ xác định độ tinh khiết, thời gian lƣu pic sản phẩm khoảng 3,6 phút Khi tiến hành sắc ký đến 60 phút với pha động có tỉ lệ MeOH chiếm 85%, pic phụ xuất khoảng 15 phút chế độ Max 94 plot Trong đó, pic phụ lớn xuất thời gian lƣu 6,8 phút chiếm khoảng 0,4% tổng diện tích đỉnh Sau xác định độ tinh khiết sản phẩm 99%, tiếp tục tiến hành đo phổ IR, MS NMR sản phẩm phân tích phổ phƣơng pháp đáng tin cậy, đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định cấu trúc sản phẩm Phổ hồng ngoại: Phổ IR sản phẩm xuất đỉnh đặc trƣng phù hợp với phổ IR tạp chất A Khi so sánh phổ IR DIC sản phẩm, nhận thấy phổ IR sản phẩm khơng xuất tín hiệu nhóm amin N – H nhƣ cấu trúc DIC số sóng 3300 – 3350 cm-1 có xuất thêm nhóm C = O vịng lactam cấu trúc tạp chất A số sóng 1726 cm-1 Phổ IR sản phẩm hoàn toàn phù hợp với kết phổ IR tạp A nhóm nghiên cứu Somashekar [39] liệu phổ IR công ty LGC Standards [35] Khối phổ: Phổ MS nguồn ESI+ sản phẩm tổng hợp cho mảnh có m/z = 278,0138 tƣơng ứng với [C14H1035Cl2NO]+ m/z = 280,0108 tƣơng ứng với [C14H1037Cl35ClNO]+; hoàn toàn phù hợp với khối lƣợng công thức phân tử tạp chất A: C14H9Cl2NO (M = 278,13) Phổ NMR: Phân tích liệu phổ NMR cho thấy số lƣợng vị trí carbon, proton phù hợp với công thức cấu tạo tạp chất A Phổ 13 C-NMR phổ DEPT cho tín hiệu có độ dời hóa học hồn tồn phù hợp với 14 nguyên tử carbon cấu trúc tạp chất A Kết phổ 1H-NMR 13C-NMR sản phẩm phù hợp với liệu phân tích phổ tạp chất A nhóm nghiên cứu Somashekar [39] Feng Wang [16] 95 Từ liệu phổ IR, MS NMR, xác định đƣợc cấu trúc sản phẩm tổng hợp tạp chất A DIC: 1-(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2Hindol-2-on 4.1.3 Đánh giá thiết lập tạp chất đối chiếu A diclofenac Các chuyên luận nguyên liệu thành phẩm DIC dƣợc điển bắt buộc phải kiểm soát tạp chất liên quan Cục Quản lý Dƣợc Việt Nam yêu cầu phải kiểm tra tạp chất liên quan cách chặt chẽ nguyên liệu thành phẩm đăng ký sản xuất lƣu hành Vì thế, việc đánh giá chất lƣợng sản phẩm tạp A thiết lập tạp chất đối chiếu A DIC góp phần hỗ trợ cho việc đa dạng hóa nguồn cung ứng tạp chất đối chiếu phục vụ cho công tác kiểm tra, quản lý chất lƣợng thuốc DIC thị trƣờng DĐVN IV không bắt buộc phải có tạp chất đối chiếu A kiểm nghiệm tạp chất liên quan DIC Tuy nhiên, DĐVN V ban hành có hiệu lực từ ngày 01/7/2018 lại quy định bắt buộc phải có tạp chất đối chiếu A để xác định mức giới hạn tạp chất nguyên liệu thành phẩm DIC Điều chứng minh đƣợc tính cấp thiết nghiên cứu tiêu chuẩn hóa tạp chất A nhằm phục vụ trực tiếp cho nhu cầu kiểm nghiệm nƣớc, tránh phụ thuộc vào nguồn cung ứng tạp chất chuẩn từ nƣớc Hơn nữa, quy trình tổng hợp tinh chế tạp chất A vừa đƣợc đề xuất đơn giản, sản phẩm sau đánh giá đạt đƣợc chất lƣợng cao, độ tinh khiết 99% Với quy trình tổng hợp này, tạp chất A đƣợc chuẩn bị phịng thí nghiệm có nhu cầu sử dụng chất chuẩn làm việc thử nghiệm nội bộ, mà không cần phụ thuộc vào ngân hàng tạp chất chuẩn đơn vị phát hành, góp phần tiết kiệm chi phí kiểm nghiệm, tạp chất đối chiếu A DIC đƣợc bán với giá cao: 34 triệu đồng/lọ 25 mg (Dƣợc điển Mỹ), triệu đồng/lọ 15 mg (Dƣợc điển Châu Âu), triệu đồng/lọ 25 mg (Dƣợc điển Anh), 23 triệu đồng/lọ 100 mg (công ty 96 LGC Standards), 25 triệu đồng/lọ 50 mg (Công ty TLC PharmChem) theo giá bán ngày 19/3/2019 trang điện tử hai công ty Sigma-Aldrich LGC Standards Kết đánh giá sản phẩm tạp chất A cho thấy hàm lƣợng đƣợc xác định 99,18% với độ không đảm bảo đo thấp U = 0,01 Hiệu suất tồn quy trình cao (khoảng 45%), lƣợng sản phẩm 600 mg với thời gian tổng hợp tinh chế khoảng 24 Sản phẩm đƣợc cung cấp chuyển giao quy trình cho đơn vị có nhu cầu phát hành chất chuẩn, góp phần làm đa dạng hóa nguồn cung ứng tạp chất đối chiếu, tiết kiệm chi phí cho cơng tác kiểm tra chất lƣợng thuốc DIC thị trƣờng 4.2 Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời diclofenac tạp chất A thành phẩm thuốc phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tiến hành khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký định lƣợng đồng thời DIC tạp chất A viên nén dựa vào nhiều tiêu chí thực nghiệm, đƣợc trình bày cụ thể nhƣ sau: Điều kiện khảo sát ban đầu: - Pha tĩnh: Cột sắc ký C18 Restek (25 cm; 4,6 mm; µm) - Pha động: MeOH – nƣớc AP pH 2,5 (85:15, tt/tt) - Tốc độ dòng: mL/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 μL - Nồng độ định lƣợng: DIC 500 µg/mL tạp A 1,0 µg/mL MeOH (tạp A chiếm 0,2% nhƣ giới hạn cho phép tạp A Dƣợc điển) Dung môi pha mẫu: Lựa chọn MeOH dung môi pha mẫu đặc tính hịa tan vạn MeOH Hơn nữa, thử nghiệm độ tan tạp A dung môi khác nội dung đánh giá chất lƣợng sản phẩm mục 3.1.3.1, nhận thấy tạp A tan tốt dung môi MeOH với độ tan 0,1 g/mL 97 Pha tĩnh: Dựa vào tài liệu tham khảo đề cập mục 1.3, lựa chọn điều kiện pha tĩnh cố định cột pha đảo C18 hãng Restek cột sắc ký chịu đƣợc khoảng pH rộng từ 2,5 đến 8,0 phù hợp với điều kiện pha động dự kiến khảo sát Bƣớc sóng phân tích: Khi tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký ban đầu, chế độ Mixed View, sắc ký đồ hiển thị tồn thang sóng từ 200 nm đến 800 nm cho kết quả: - Trong khoảng bƣớc sóng từ 200 đến 240 nm, pic DIC có hệ số As > 1,6 - Trong khoảng bƣớc sóng từ 270 đến 800 nm, pic DIC có hệ số As < 1,2 nhƣng tín hiệu tạp A thấp, tín hiệu tạp A giảm dần tăng dần bƣớc sóng Vì thế, 240 đến 270 nm khoảng bƣớc sóng phù hợp để định lƣợng đồng thời DIC tạp A, thỏa mãn yêu cầu hệ số bất đối đáp ứng độ nhạy tốt cho phƣơng pháp Trong điều kiện sắc ký khảo sát, tạp A có cực đại hấp thu 257 nm Để đảm bảo độ nhạy tốt cho tạp chất A, 257 nm đƣợc lựa chọn bƣớc sóng định lƣợng quy trình Bƣớc sóng phù hợp, tƣơng tự với bƣớc sóng định lƣợng 254 nm tài liệu tham khảo mục 1.3 Thể tích tiêm mẫu: Thể tích tiêm mẫu khảo sát ban đầu 20 µL Đây thể tích tiêm mẫu thƣờng quy chuyên luận DĐVN hành Khi giảm thể tích tiêm, tín hiệu tạp A giảm, làm ảnh hƣởng đến độ nhạy phƣơng pháp Khi tăng thể tích tiêm lên 25 µL, pic DIC nồng độ 1100 µg/mL bị tải mẫu bƣớc sóng 257 nm, gây khó khăn cho cơng tác thẩm định tính tuyến tính độ quy trình 98 Vì vậy, lựa chọn 20 µL thể tích tiêm mẫu cố định cho quy trình định lƣợng DIC tạp chất A Pha động: DĐVN V, BP 2017 tài liệu tham khảo mục 1.3 thƣờng sử dụng đệm natri dihydrophosphat, triethylamin phosphat, kali dihydrophosphat thành phần pha động Tuy nhiên, đề xuất thực khảo sát thay đệm phosphat dung dịch acid phosphoric đệm phosphat trình sắc ký thƣờng gây tƣợng kết tinh muối làm tắc nghẽn hệ thống Acid phosphoric bền dung dịch bay nên giúp ổn định pH pha động cho q trình phân tích Lựa chọn điều kiện pha động dựa vào tiêu chí: thời gian phân tích ngắn, hệ số bất đối tốt hệ số phân giải cao DĐVN V BP 2017 quy định độ phân giải tạp A DIC định lƣợng tạp chất liên quan tối thiểu 6,5 với thời gian phân tích gấp 1,5 lần thời gian lƣu DIC nhằm tránh tá dƣợc tạp chất khác ảnh hƣởng đến tính đặc hiệu quy trình Khảo sát thành phần pha động: Với pha động ACN – nƣớc AP pH 2,5 thay đổi tỉ lệ 50:50, 40:60 30:70 tỉ lệ 30:70, DIC tạp A tách hoàn toàn với thời gian lƣu DIC 15,3 phút dẫn đến kéo dài thời gian phân tích Với mong muốn áp dụng chế độ chạy đẳng dòng nhằm đảm bảo độ lặp lại tốt cho quy trình phân tích nên hệ ACN – nƣớc AP không đƣợc lựa chọn Với pha động MeOH – nƣớc AP pH 2,5 tỉ lệ 85:15, thời gian lƣu DIC 7,2 phút Hai pic DIC tạp A tách hoàn toàn nên hệ pha động đƣợc lựa chọn cho khảo sát Khảo sát tỉ lệ pha động: Khi thay đổi tỉ lệ pha động, nhận thấy tỉ lệ 85:15 cho thời gian phân tích ngắn, nhiên hệ số phân giải DIC tạp A không cao (Rs = 2,5) 99 Ngƣợc lại, tỉ lệ 75:25 cho pic tách tốt với hệ số Rs 16,3 nhƣng thời gian phân tích kéo dài (thời gian lƣu DIC 13,4 phút) Lựa chọn tỉ lệ pha động 80:20 nhằm đảm bảo hai yếu tố: hệ số phân giải cao (Rs = 7,3) thời gian phân tích ngắn (10 phút) Khảo sát pH pha động: Khi khảo sát pH pha động thay AP acid formic, nhận thấy thay đổi loại acid pH pha động, hệ số phân giải thời gian lƣu DIC tạp A bị ảnh hƣởng Tuy nhiên, pH pha động loại acid lại ảnh hƣởng nhiều đến hệ số bất đối DIC Khi so sánh AP acid formic với giá trị pH tỉ lệ pha động, nhận thấy AP cho pic DIC cân đối so với acid formic Lựa chọn hệ MeOH – nƣớc AP pH 2,0 (80:20) pha động cho hệ số bất đối DIC gần 1,0 Nhận xét quy trình định lƣợng tạp A diclofenac viên nén: - DIC tạp A chất phân cực, thế, thành phần pha động cần có tỉ lệ MeOH cao để tiết kiệm thời gian phân tích Hệ pha động MeOH – nƣớc AP pH 2,0 với tỉ lệ MeOH chiếm 80% cho thời gian phân tích ngắn, khoảng 10 phút, thích hợp để áp dụng định lƣợng mẫu thành phẩm DIC thực tế - Các tài liệu tham khảo cho thấy DIC có giá trị pKa khoảng 4,1 Từ thực nghiệm, nhận thấy pH pha động có ảnh hƣởng lớn đến đối xứng pic DIC nhƣng ảnh hƣởng đến hệ số bất đối pic tạp A - Cũng qua khảo sát, nhận thấy việc sử dụng AP để điều chỉnh pH pha động cho pic DIC cân đối so với acid formic Và giá trị pH 2,0 dung dịch AP cho pic DIC có hệ số As gần 1,0 - Sắc ký đồ mẫu phân hủy điều kiện khắc nghiệt (Hình 3.14) cho thấy tạp chất A xuất tất mẫu khảo sát, nhiều phân 100 hủy DIC với HCl Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Ehab M Elzayat [15] Vì thế, ứng dụng sắc ký bán điều chế để tinh khiết hóa tạp chất A sau thực phân hủy DIC môi trƣờng acid HCl, điều kiện phân hủy cho lƣợng tạp A xuất nhiều tất thử nghiệm Ngoài ra, với điều kiện sắc ký vừa đƣợc xây dựng cho pic tạp chất A tách hoàn toàn với pic DIC pic tạp chất khác sau trình phân hủy (Hình 3.14) - Sau khảo sát điều kiện sắc ký, quy trình định lƣợng đồng thời DIC tạp chất A viên nén đƣợc thẩm định đạt yêu cầu theo hƣớng dẫn ICH tính tƣơng thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, đạt độ độ xác cao - Kết thẩm định cho thấy khoảng tuyến tính tạp chất A từ 0,1 đến 5,0 µg/mL tƣơng ứng từ 0,02 đến 1% so với DIC LOD LOQ tạp A nồng độ thấp lần lƣợt 0,04 µg/mL 0,1 µg/mL đáp ứng tốt yêu cầu ứng dụng việc định lƣợng tạp chất A tồn với hàm lƣợng thấp nguyên liệu thành phẩm thuốc DIC - Quy trình có giới hạn định lƣợng tạp A 0,1 g/mL tƣơng ứng 0,02% so sánh với nồng độ DIC Giá trị LOQ thấp 10 lần so với giới hạn cho phép tạp chất A chuyên luận nguyên liệu thành phẩm thuốc DIC DĐVN V BP 2017 (0,2%) Điều chứng tỏ phƣơng pháp định lƣợng vừa xây dựng có độ nhạy tốt, có khả phát định lƣợng đƣợc hàm lƣợng tạp A xuất mẫu nguyên liệu thành phẩm thuốc DIC - Nồng độ định lƣợng tạp chất A hoạt chất DIC chênh lệch 500 lần, trở ngại lớn trình xây dựng phƣơng pháp, vừa phải đảm bảo độ nhạy tốt cho tạp chất A với hàm lƣợng xuất 101 mẫu thấp, vừa phải tránh tƣợng tải mẫu cho đỉnh DIC Điều kiện sắc ký vừa đƣợc xây dựng đáp ứng tốt hai yêu cầu vừa nêu - Khi so sánh với quy trình định lƣợng khác, nhận thấy Silvana cộng [44] sử dụng hệ pha động MeOH – 2-propanol – đệm phosphat 50mM pH 5,5 (48:9:43, tt/tt/tt) cho kết pic tạp A xuất sau pic DIC với Rs 5,6 Giá trị LOQ tạp chất A 0,02% thời gian phân tích 15 phút Trong nghiên cứu Silvana, pic DIC bị kéo đuôi với hệ số As 1,9 nên có nguy ảnh hƣởng trực tiếp đến pic tạp chất A xuất phía sau pic DIC Trong nghiên cứu chúng tôi, Rs tạp chất A DIC 7,5; hệ số As DIC gần 1,0 thời gian phân tích 10 phút, tạp chất A xuất trƣớc DIC giúp tạo thuận lợi cho q trình phân tích, tránh tƣợng kéo pic DIC làm ảnh hƣởng đến kết định lƣợng tạp chất A Từ kết thẩm định quy trình theo hƣớng dẫn ICH mục 3.2, nhận thấy quy trình phân tích đảm bảo độ tin cậy cao để ứng dụng định lƣợng đồng thời DIC tạp A viên nén DIC 4.3 Ứng dụng quy trình định lƣợng đồng thời diclofenac tạp chất A thành phẩm thuốc phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao Kết ứng dụng định lƣợng DIC tạp A 30 mẫu chế phẩm cho thấy mẫu đạt tiêu chuẩn chất lƣợng hàm lƣợng DIC giới hạn tạp chất A theo DĐVN V BP 2017 Khi khảo sát tính đặc hiệu quy trình, tạp chất A xuất nhiều thành phẩm DIC tiếp xúc với acid, UV nhiệt độ cao (Hình 3.14) Vì thế, mẫu viên nén trƣớc tiến hành phân tích phải cịn nguyên vẹn bao bì trực tiếp đƣợc tiêm vào hệ thống sắc ký sau xử lý mẫu tối đa giờ, nhằm hạn chế ảnh hƣởng mơi trƣờng đến chất lƣợng mẫu phân tích 102 Dung dịch chuẩn chứa DIC 500 µg/mL tạp A 1,0 µg/mL đƣợc bảo quản tủ lạnh, sau 24 ngày đƣợc phân tích sắc ký cho kết bảng 4.1 Kết cho thấy dung dịch chuẩn quy trình phân tích đƣợc sử dụng ổn định tuần đƣợc bảo quản ngăn mát tủ lạnh, nhiệt độ từ – 8oC Bảng 4.1: Diện tích pic mẫu chuẩn Thời điểm Ban đầu Sau 24 Sau ngày DIC 42.173.969 42.059.710 42.494.630 Tạp A 1.253.989 1.236.971 1.251.237 % Diện tích pic DIC 100,00% 99,73% 100,76% so với ban đầu Tạp A 100,00% 98,64% 99,78% Diện tích pic Khi thử nghiệm mẫu ứng dụng đƣợc xử lý dƣới điều kiện bảo quản bất lợi nhƣ nhiệt độ 40oC 48 giờ, ánh sáng mặt trời trực tiếp 48 giờ, tia UV 365 nm cho kết hàm lƣợng tạp chất A tăng rõ rệt so sánh với mẫu thuốc ban đầu Hàm lƣợng tạp chất A tăng cao điều kiện chiếu tia UV dƣới ánh sáng mặt trời trực tiếp Tia UV đƣợc chiếu vào mẫu thuốc có bƣớc sóng 365 nm nằm vùng bƣớc sóng tia UV nhóm A (315 – 400 nm) nhóm chiếm 99% tia UV từ mặt trời tiếp xúc đƣợc đến mặt đất Từ đó, nhận thấy ánh sáng mặt trời, đặc biệt tia UV nhóm A có tác động mạnh mẽ đến độ ổn định viên nén DIC, thể cụ thể thông qua kết lƣợng tạp chất A phân hủy tăng từ 0,07% đến 0,12% so sánh với mẫu thuốc ban đầu (Bảng 3.23) Hầu hết chế phẩm viên nén DIC thị trƣờng đƣợc đóng bao bì trực tiếp dạng vỉ với mặt dƣới tráng nhơm, mặt chất liệu polyme suốt, không màu nên thực tế, ánh sáng mặt trời tia UV nhóm A có hội tiếp xúc trực tiếp gây phân hủy DIC tạo tạp chất A thuốc 103 khơng đƣợc bảo quản quy định Vì thế, trình vận chuyển, phân phối sản phẩm, đặc biệt lƣu trữ nhà thuốc, viên nén DIC cần đƣợc tuân thủ nghiêm ngặt điều kiện bảo quản tránh ánh sáng Tƣơng tự, dƣới điều kiện bảo quản nhiệt độ 40oC ngày, tạp chất A gia tăng so với mẫu thuốc ban đầu, nhiên, lƣợng tạp A phát sinh không nhiều nhƣ dƣới điều kiện ánh sáng mặt trời trực tiếp Khí hậu Việt Nam nóng ẩm gió mùa, đặc biệt khu vực thu thập mẫu thành phẩm thuộc quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ thƣờng xuyên xuất đợt nắng nóng kéo dài Đa số nhà thuốc tuân thủ tốt việc tránh ánh sáng trì nhiệt độ nhƣ quy định Tuy nhiên, phận nhỏ nhà thuốc lơ công tác tuân thủ quy định điều kiện bảo quản, thƣờng hay tắt hệ thống điều hịa khơng giám sát kỹ biểu đồ nhiệt độ hàng ngày nhà thuốc Đây nguy làm phát sinh tạp chất A từ viên nén DIC trình bảo quản Để đảm bảo chất lƣợng thuốc DIC lƣu thông phân phối thị trƣờng, cần tự ý thức tuân thủ quy định bảo quản từ nhà thuốc trình kiểm tra, giám sát chặt chẽ từ quan quản lý 104 KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề tài, nhóm nghiên cứu hoàn thành mục tiêu đề luận văn với kết nhƣ sau: - Đã tổng hợp, tinh chế tiêu chuẩn hóa đƣợc tạp A diclofenac với hiệu suất tồn quy trình 45%, lƣợng sản phẩm 600 mg sau lần tổng hợp, thời gian tổng hợp 24 giờ, sản phẩm tạp chất A đạt độ tinh khiết 99%, đạt chất lƣợng làm chất đối chiếu kiểm nghiệm tạp chất liên quan diclofenac - Đã tiến hành xây dựng thẩm định quy trình định lƣợng tạp A diclofenac thành phẩm phƣơng pháp sắc ký lỏng theo hƣớng dẫn ICH, đạt yêu cầu tính đặc hiệu, tính tuyến tính với độ xác, độ cao giá trị LOQ thấp 10 lần so với quy định giới hạn tạp chất A dƣợc điển - Đã thực ứng dụng quy trình định lƣợng tạp A diclofenac để kiểm tra chất lƣợng 30 mẫu thành phẩm diclofenac dạng viên nén lƣu hành thị trƣờng quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ 105 KIẾN NGHỊ Từ kết thu đƣợc, nhóm nghiên cứu đƣa số kiến nghị định hƣớng tiếp tục nghiên cứu nhƣ sau: - Nghiên cứu theo dõi độ ổn định tạp chất đối chiếu A diclofenac để tính tốn đƣa chu kỳ đánh giá lại chất chuẩn theo hƣớng dẫn ISO Tổ chức Y tế Thế giới - Xây dựng, thẩm định ứng dụng quy trình định lƣợng đồng thời diclofenac tạp chất A dạng bào chế khác phƣơng pháp sắc ký lỏng - Tổng hợp thiết lập tạp chất đối chiếu khác diclofenac nhƣ xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời diclofenac tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm thuốc ... gian nghiên cứu 60 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 61 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 61 2.2.2 Cỡ mẫu 61 2.2.3 Phƣơng pháp chọn mẫu 61 2.2.4 Nội dung nghiên cứu. .. thu thập nhà thuốc thuộc quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ từ tháng 01 đến tháng 02 năm 2019 61 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm 2.2.2 Cỡ mẫu Cỡ mẫu tiến hành... A nghiên cứu giới 59 Trên giới, tạp chất A DIC đƣợc định lƣợng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) có điều kiện sắc ký bảng 1.6 Bảng 1.6: Các nghiên cứu định lƣợng tạp chất A diclofenac Năm
Ngày đăng: 18/03/2023, 17:15
Xem thêm:
