Xây dựng phương pháp đánh giá kháng nguyên ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao tại Viện Vắcxin Nha Trang

Xây dựng phương pháp đánh giá kháng nguyên ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao tại Viện Vắcxin Nha Trang

Bộ giáo dục v đo tạo bộ y tế viện vệ sinh dịch tễ trung ơng ___________________________ nguyễn thị lan phơng xây dựng phơng pháp đánh giá kháng nguyên ngoại v nội độc tố trong vắcxin ho g - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho g an ton cao tại viện vắcxin nha trang Chuyên ngành: Vi khuẩn học Mã số: 62.72.6801 Tóm tắt luận án tiến sĩ y học H nội -2008 1 Công trình đợc hoàn thành tại: Viện vệ sinh dịch tễ trung ơng Viện vắcxin nha trang Ngời hớng dẫn khoa học: pgs.ts.lê văn hiệp pgs.ts. đặng đức anh Phản biện 1: PGS.TS. Đinh Hữu Dung Phản biện 2: PGS.TS. Lê Văn Phủng Phản biện 3: PGS.TS. Đào Xuân Vinh Luận án đã đợc bảo vệ trớc hội đồng chấm luận án cấp nhà nớc họp tại: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng vào hồi 9h ngày 24 tháng 6 năm 2006 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Th viện Quốc gia - Th viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng 2 MỞ ĐẦU Bệnh ho gà do vi khuẩn B.pertussis gây nên. Trước đây bệnh xảy ra rất thơng thường, đặc biệt là ở trẻ em, gây nên những hậu quả nghiêm trọng. Sau hơn 40 năm sử dụng vắcxin ho gà dưới dạng vắcxin phối hợp bạch hầu, ho gà và uốn ván (vắcxin DPT) trong chương trình tiêm chủng mở rộng (CTTCMR), đến nay bệnh cơ bản đã được kiểm sốt. Hàng năm Viện Vắcxin Nha Trang s ản xuất và cung cấp cho CTTCMR từ 8 đến 10 triệu liều vắcxin DPT, đủ để miễn dịch 3 mũi cơ bản cho trẻ mới sinh trong năm . Thành phần ho gà trong vắcxin DPT do Viện sản xuất là dạng tồn tế bào bất hoạt, có ưu điểm giá thành rẻ, hiệu lực bảo vệ kéo dài và bền vững. Mặc dù được sản xuất tn thủ theo những qui định nghiêm ngặt của Tổ chứ c Y tế Thế giới (TCYTTG) và của cơ quan Kiểm định Quốc gia nhưng những vấn đề liên quan đến bản chất của vắcxin tồn tế bào vẫn cho thấy vắcxin có tỷ lệ phản ứng phụ nhất định trên người sử dụng. Có ít nhất 5 loại độc tố là HLT, PT, LPS, ATC, và TCT tham gia vào độc tính đặc hiệu của ho gà. Tuy nhiên hiện nay độc tính của vắcxin chỉ được kiểm tra bằng thử nghiệm tăng trọng chuột mang tính chất an tồn chung hơn là xác định độc tính đặc hiệu của từng kháng ngun độc tố riêng biệt. TCYTTG khuyến cáo các nhà sản xuấ nên hình thành các thử nghiệm phù hợp để giám sát chất lượng của vắcxin đặc biệt ngoại độc tố ho gà PT và nội độc tố, 2 thành phần khơng bị huỷ bởi nhiệt nhưng chiếm tỷ lệ khá cao trong vắcxin. Việc hình thành hệ thống gồm 4 thử nghiệm giám sát nồng độ và hoạt tính củ a ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà thực sự cần thiết để bảo đảm tính an tồn và hiệu lực của vắcxin. Đồng thời việc xác định các giới hạn phù hợp của các kháng ngun này trong vắcxin là vấn đề quan trọng trong qui trình sản xuất vắcxin ho gà an tồn cao. Xuất phát từ những quan điểm trên chúng tơi thực hiện đề tài “Xây dựng các phương pháp đánh giá kháng ngun ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an tồn cao tại Viện Vắcxin Nha trang” với các mục tiêu sau: 3 1. Xõy dng 4 phng phỏp ỏnh giỏ khỏng nguyờn ngoi c t ho g v ni c t trong vcxin ho g ton t bo bt hot. 2. Xác định và đánh giá tơng quan giữa các thành phần kháng nguyên, ảnh hởng của một số yếu tố liên quan đến tính an toàn và công hiệu của vắcxin ho gà sản xuất tại Viện Vắcxin Nha Trang là căn cứ đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao. Nhng úng gúp mi v giỏ tr thc tin ca lun ỏn L cụng trỡnh u tiờn ti Vit Nam xõy dng v thm nh hon chnh cỏc phng phỏp xỏc nh hm lng v hot tớnh khỏng nguyờn c t ho g v ni c t trong vcxin ho g ton t bo b t hot. õy l nhng phng phỏp cho kt qu nhanh nờn cú giỏ tr ng dng cao kim nh trong qui trỡnh sn xut vcxin ho g ton t bo hin nay. ng thi cỏc phng phỏp ny cũn l nhng cụng c hu ớch ỏnh giỏ cht lng khi phỏt trin cỏc vcxin ho g tinh ch ti Vit nam. Lun ỏn ó xỏc nh c hm lng v hot tớnh ca cỏc khỏng nguyờn gõy c chớnh trong vcxin ho g v ỏnh giỏ s tng quan gia cỏc khỏng nguyờn ú v i c tớnh c hiu ca vcxin. õy l mt trong nhng vn quan trng gii quyt tớnh an ton mc cao nht cú th t c ca vcxin ho g ton t bo ang sn xut ti Vit nam. Xỏc nh c cỏc nh hng ca phng phỏp bt hot, thi gian lu tr nh hng ca cht hp ph i vi tớnh an ton v cụng hiu ca v cxin ho g m trc õy cha cú tỏc gi no ỏnh giỏ mt cỏch cú h thng. xut c tiờu chun sn xut vcxin ho g an ton cao vi nhng ch tiờu c th, cú th ng dng ngay qui trỡnh xut ny trong thc t sn xut vcxin ho g hin nay ti Vin Vcxin. Cu trỳc ca lun ỏn Lun ỏn gm 120 trang, 4 chng. Cu trỳc tng phn nh sau: t vn : 2 trang. Ch ng 1: Tng quan 28 trang, 6 hỡnh minh ha. Chng 2: Vt liu Phng phỏp: 19 trang, 2 hỡnh minh ha. Chng 3: Kt qu 43 trang, 30 bng, 15 hỡnh. Chng 4: Bn lun 25 trang, 2 hỡnh. Kt lun: 2 trang. ngh: 1 trang. Ph lc 2 trang. 110 ti liu trong ú 18 ti liu ting Vit v 92 ti liu ting Anh, 4 cụng trỡnh cú liờn quan n lun ỏn. 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh ho gà 1.1.1 Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh ho gà là vi khuẩn Bordetella pertussis. 1.1.2 Dịch tễ học và sinh bệnh học Hàng năm trên thế giới có khoảng 20-40 triêu người mắc, số người chết khoảng 200.000 – 300.000. Tỷ lệ mắc ho gà giảm rõ rệt nhờ CTTCMR. Tại Việt Nam, trước những năm 70 số mắc từ 70000 -100000. Sau TCMR tỷ lệ mắc và chết vì ho gà giảm rõ rệt và t ừ năm 1995 đến nay bệnh đã được khống chế . Sinh bệnh học: lây truyền trực tiếp do tiếp xúc với ngưoời mang mầm bệnh. Cơ chế sinh bệnh do ngoại độc tố và nội độc tố của vi khuẩn. 1.1.3 Các kháng nguyên chính Các yếu tố bám dính bao gồm: FHA (filamentous haemagglutinin), FIM (Fimbriae: ngưng kết nguyên 1, 2, 3), Pectartin. Các độc tố bao gồm: PT (pertussis toxin), ATC (Adenylate cyclase toxin), TCT (Tracheal cytotoxin), DNT (Dermonecrotic toxin) 1.1.4 Đáp ứng miễn dịch Đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào là cơ chế bảo vệ quan trọng. Miễn dịch qua trung gian tế bào có vai trò trong đáp ứng miễn dịch tự nhiên và duy trì sự bảo vệ lâu dài sau mắc bệnh. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin ho gà toàn tế bào giống với quá trình nhiễm trùng tự nhiên. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin ho gà vô bào trên người bao gồm cả 2 hướng ch ọn lọc Th1 và Th2. 1.2 Sản xuất và kiểm định vắcxin ho gà 1.2.1 Vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt Liên quan đến sản xuất vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt bao gồm các yêu cầu về chủng giống, môi trường, nuôi cấy lên men, tách lọc thu sinh khối, bất hoạt và pha chế vắcxin. 5 Kiểm định vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt theo tiêu chuẩn của TCYTTG. 1.2.2 Vắcxin ho gà vô bào Vắcxin ho gà vô bào là vắcxin tinh chế thường chứa các kháng nguyên PT, FHA và PRN. Tuy nhiên thành phần kháng nguyên, hàm lượng kháng nguyên chưa có sự thống nhất của các nhà sản xuất. Tiêu chuẩn của vắcxin ho gà vô bào giống với vắcxin ho gà toàn tế bào nhưng trong phương pháp kiểm định cần xác định hàm lượng của các kháng nguyên và hiệu quả đáp ứng miễn dịch trên súc vật thí nghi ệm vaø xác định công hiệu của vắcxin. Kiểm tra an toàn đặc hiệu bằng thử nghiệm tăng trọng chuột. 1.3 Xây dựng và đánh giá phương pháp phân tích 1.3.1. Các thử nghiệm invitro và invivo xác định hàm lượng và hoạt tính độc tố ho gà Hiện nay phương pháp tăng trọng chuột (MWG) là phương pháp đánh giá tính an toàn dùng để xuất xưởng của vắcxin ho gà. Một số thử nghiệm đã được phát triển dự a vào đặc tính kháng nguyên của vắcxin theo nhu cầu của nhà sản xuất: - Định lượng kháng nguyên độc tố ho gà bằng phản ứng ELISA - Các thử nghiệm trên tế bào CHO - Xác định yếu tố nhạy cảm histamin (HSF) - Thử nghiệm xác định yếu tố kích hoạt lymphô bào (LPF) - Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) … 1.3.2. Đánh giá qui trình phân tích và thẩm định phương pháp Đánh giá qui trình phân tích là một yêu cầu trước khi áp dụng phương pháp. Trong đ ó một số các thuộc tính của qui trình phân tích ( phương pháp phân tích) cần được đánh giá trong quá trình thẩm định bao gồm: độ đúng (accuracy), độ chính xác (precision), độ nhạy (sensitivity), độ đặc hiệu (selectivity)….Thực hiện một nghiên cứu tương quan giữa 2 phương pháp đôi khi cũng cần thiết trong thẩm định. 6 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1.Sinh phẩm - Nước cốt ho gà BP 509, BP134, PM (Viện Vắcxin ) - Vắcxin ho gà mẫu chuẩn Quốc gia RP5 (Viện KĐQG - Việt Nam), mẫu chuẩn xác định yếu tố kích hoạt lympho bào PU585 (Viện RIVM –Hà Lan) - Độc tố ho gà mẫu chuẩn Quốc tế JNIH-5 (Viện NIBSC - Anh) - Kháng thể đơn dòng kháng độc tố ho gà (Biken -Nhật bản) - Cộng hợp kháng thỏ g ắn biotin ( Sigma) - Fetuin (Sigma) - Lysat ( Bio Whitake) - Endotoxin chuẩn (Cambrex) 2.1.2.Tế bào – Môi trường – Dung dịch - Tế bào CHO –K1 (Viện Biken - Nhật) - Môi trường EMEM + 10% HTBTB (Sigma) - Các dung dịch đệm, dung dịch thuốc nhuộm… 2.1.3 Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt 11-14g; 15-17g 2.1.4 Hoá chất: Tetramethylbenzidine, Tween 20, axit sulfuaric… 2.1.5 Dụng cụ thiết bị: Multichannels, máy đọc ELISA, máy siêu âm đồng hoá, máy ly tâm lạnh, tủ ấm, cân… 2.2 Phương pháp 2.2.3 Xây dựng các phương pháp xác định kháng nguyên độ c tố ho gà PT và nội độc tố trong vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt  Các bước cơ bản để hình thành và ứng dụng phương pháp mới: xác định các điều kiện tối ưu của phương pháp, xây dựng qui trình thực hiện và thẩm định phương pháp (độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng).  4 phương pháp xác định kháng nguyên ngoại độc tố ho gà và nội độc tố là: 7 - Xây dựng và chuẩn hoá phương pháp ELISA định lượng nồng độ kháng nguyên độc tố ho gà PT trong vắcxin ho gà toàn tế bào. - Xây dựng, chuẩn hoá và thẩm định phương pháp chuẩn độ độc tố ho gà hoạt động trên tế bào CHO-K1. - Xây dựng phương pháp xác định yếu tố kích hoạt tăng lymphô bào (LPF) trên chuột nhắt trắng - Xây dựng và chuẩn hoá phương pháp LAL xác định nội độc tố (endotoxin) trong vắcxin ho gà toàn tế bào 2.2.4 Phương pháp kiểm định công hiệu và an toàn đặc hiệu vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt - Phương pháp thử thách xác định công hiệu của vắcxin ho gà: Theo thường qui của TCYTTG. - Phương pháp tăng trọng chuột (MWG) xác định an toàn đặc hiệu của vắcxin ho gà: Theo thường qui của TCYTTG. 2.2.5 Xây dựng tiêu chuẩn pha vắcxin ho gà - Tương quan giữa chỉ số tă ng trọng chuột và chỉ số tăng bạch cầu. - Tương quan giữa các kết quả xác định hàm lượng, hoạt tính của PT với số lượng bạch cầu chuột. - Tương quan giữa số lượng vi khuẩn và nồng độ endotoxin với tăng trọng chuột. - Công hiệu của thành phần ho gà trước và sau hấp phụ AlPO 4 . - Ảnh hưởng của phương pháp bất hoạt và thời gian lưu trữ.  Đề xuất tiêu chuẩn pha vắcxin ho gà: - Đậm độ vi khuẩn (OIU/ml) - Nồng độ nội độc tố (EU/ml) - Hàm lượng kháng nguyên PT tính bằng μg/ml (pp ELISA) - Hoạt tính kháng nguyên PT tính bằng μg/ml (ppCHO-K1) - Chỉ số tăng bạch cầu (LPU) - Chỉ số tăng trọng chuột (%). 8 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1. Xây dựng các phương pháp xác định độc tố ho gà PT và nội độc tố trong vắcxin ho gà toàn tế bào 3.1.1. Xây dựng và chuẩn hoá phản ứng ELISA định lượng nồng độ PT 3.1.1.1 Tối ưu các điều kiện của phản ứng ELISA - Nồng độ fetuin tối ưu: 25μg/ml - Nồng độ kháng thể thỏ kháng PT: 1/500 - Cộng hợp phù hợp cho hệ ELISA -fetuin: Cộng hợp kháng thỏ gắn Biotin và SBC 1/5000 3.1.1.2. Xây dựng đường chuẩn Khoảng tuyến tính có OD từ 0,1-1,4 tương đương nồng độ PT trong mẫu thử từ 0,03μg/ml đến 0,25 μg/ml (hình 3-3). Hình 3 -3. Đồ thị đường chuẩn của phản ứng 3.1.1.2. Kết quả xác định độ nhạy của phản ứng: LOD của phản ứng có OD là 0,090255 và LOQ có OD tương đương 0,1416. D ựa theo đường chuẩn độ nhạy của phản ứng là 0,025 μg/ml. 3.1.1.3. Kết quả xác định tính đặc hiệu: Mật độ quang của mẫu thử không có PT tương đương với mật độ quang nền (mẫu trắng). Nếu mẫu thử có PT có mật độ quang cao gấp trên 20 lần mật độ quang nền. -1.2 -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 -3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 Lg [ kháng nguyên PT (mcg)] Lg(OD 450) 9 3.1.1.4. Độ chính xác và độ đúng của phương pháp ELISA  Độ chính xác: Hệ số biến thiên trung bình: - Trong cùng phản ứng : CV= 12,74% - Giữa các lần thực hiện phản ứng: CV= 7,67%  Độ đúng: Tỷ lệ phục hồi: trung bình 98,11% 3.1.1.5 Xử lý mẫu và ảnh hưởng của mẫu khơng tinh khiết đến tính ổn định của phương pháp - Xử lý mẫu bằng đồng hố, sau đó ly tâm 10000 rpm. Hàm lượng PT trong mẫu được đồng hóa ln cao h ơn mẫu khơng được đồng hố. - Trong điều kiện bình thường với các mẫu thử không tinh khiết (PM 46 Ỉ 48) và canh khuẩn ho gà (BP134: 1306, BP 134: 3306 và BP509: 1406) Phương pháp có tính ổn định đạt u cầu độ chính xác và độ đúng (CV=3,17 % , tỷ lệ phục hồi của tất cả các mẫu đạt > 90% trung bình đạt 94,55%.) 3.1.2 Kết quả xây dựng và chuẩn hố phương pháp chuẩn độ độc tố ho gà PT hoạt động trên tế bào CHO –K1. 3.1.2.1. Tối ưu hố các đ iều kiện cho phản ứng CHO –K1 - Mơi trường ni tế bào: Mơi trường EMEM có 10% huyết thanh bào thai bê hay có 5% huyết thanh bào thai bê và 10% Glutamin thuận lợi cho tế bào CHO-K1 phát triển. - Số lượng tế bào trong phản ứng chuẩn độ: 10 6 tế bào/ml - Thời gian gây nhiễm: thời gian gây nhiễm 72h cho thấy tế bào có hình thái đặc hiệu nhất. Cho tế bào cùng lúc chuẩn độ hay cho trước khi chuẩn độ 24h đều có kết quả như nhau 3.1.2.2.Tính đặc hiệu của độc tố ho gà tác động trên tế bào CHO–K1 Tính đặc hiệu thể hiện bằng sự biến đổi đặc hiệu hình thái của tế bào khi được tiếp xúc với độc tố ho gà hoạt động hoặc vi khuẩ n ho gà độc. Hiệu quả này khơng xảy ra khi tế bào tiếp xúc với các vi khuẩn khác hay các [...]... các phương pháp mới được xây dựng trong giám sát qui trình sản xuất vắcxin ho gà 2 Áp dụng qui trình pha vắcxin ho gà đạt an tồn cao dựa trên các chỉ tiêu đã đề xuất 3 Tiếp tục nghiên cứu cải tiến chủng sản xuất, qui trình bất ho t, giải độc PT và tỷ lệ hỗn hợp nước cốt ho gà đơn, nhằm tạo được vắcxin ho gà có hàm lượng cao kháng ngun PT đã giải độc để tiếp tục giảm các chỉ số về đậm độ vi khuẩn và nội. .. với nhận xét này Đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà Từ những nghiên cứu tương quan ở trên qui trình pha vắcxin ho gà được đề xuất theo các chỉ tiêu sau: - Đậm độ vi khuẩn: 2 7-3 0 OIU/ml - Nồng độ nội độc tố: < 25000 EU/ml - Hàm lượng kháng ngun PT: 0, 6- 1,2 µg/ ml (phản ứng ELISA) - Ho t tính kháng ngun PT: 0, 1-0 ,3 µg/ ml (chuẩn độ tế bào CHO–K1) - Chỉ số tăng bạch cầu LPU: ≤ 5,5 - Tăng trọng chuột... Th?i gian PM b ? t ho ? t nhi ? t PM b ? t ho ? t formalin 12 ( tháng ) 0 ,1 % Hình 3-1 6 Tính ổn định an tồn MWG của vắcxin ho gà 120 Tỉ lệ giảm LP (%) 100 80 60 40 20 0 0 3 PM bất ho t nhiệt 6 9 12 Thời gian (tháng) PM bất ho t formalin 0,1% Hình 3-1 7 Tính ổn định LPF của vắcxin ho gà 18 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 4.1 Xây dựng và chuẩn hóa các phương pháp xác định độc tố PT và nội độc tố trong vắcxin ho gà tồn...10 kháng ngun khác của ho gà ho c khi độc tố PT ho t động bị trung hồ bới kháng huyết thanh ho gà tồn phần ( bảng 3-1 1 và 3-1 2) Bảng 3-1 1 Tác động của một số chủng vi khuẩn trên tế bào CHO-K1 Mẫu thử Biến đổi hình thái tế bào 15 x109 VK/ml 5x109VK/ml 1x109 VK/ml H influenza - - - Liên cầu - - - E.coli - - - BP 18323 + + + BP 134 + + + BP 509 + + + (+): tÕ bµo bÞ t¸c ®éng ®Ỉc hiƯu (-) tÕ bµo... độ độc tố ho gà ho t động trong vắcxin ho gà khơng vượt q 0,4 μg/ml (bảng 3-2 5) 3.2.3.Tương quan giữa đậm độ vi khuẩn ( độ đục) và nồng độ nội độc tố với tăng trọng chuột Số lượng vi khuẩn và nồng độ nội độc tố có ảnh hưởng đến sự tăng trọng của chuột đặc biệt sau 18h và 24 giờ Trọng lượng của chuột chỉ hồi phục sau ngày thứ 3 (hình 3-1 2, 3-1 3, 3-1 4) Tăng trọng trung bình (g 15 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 ... 3-1 2 Ảnh hưởng đặc hiệu của độc tố ho gà trên tế bào CHO –K1 Mẫu thử Biến đổi hình thái tế bào Anti pertussis serum 89/530 AGG-2 serum 89/598 B.pertussis 88/522 H influenza - - + E.coli K12 - - + Liên cầu - - + BP 18323 - + + BP 134 - + + BP 509 - + + JNIH- 5 - + + (+): tÕ bµo bÞ t¸c ®éng ®Ỉc hiƯu (-) tÕ bµo b×nh th−êng 11 3.1.2.3 Xác định nồng độ tối thiểu của độc tố ho gà tác động trên tế bào CHO... có thể chấp nhận được Trong thời gian này PT tiếp tục bị bất ho t ở 4oC đồng thời chất bảo quản merthiolate có trong vắcxin cũng tham gia thúc đẩy q trình bất ho t này TCYTTG cũng khuyến cáo hạn dùng của vắcxin ho gà khơng vượt q 1 năm, vì thế thời gian sử dụng của vắcxin ho gà bất ho t nhiệt sản xuất tại Viện Vắcxin trong giới hạn 6-9 tháng là hợp lý Đối với vắcxin ho gà bất ho t thêm với formalin... Nhiều tác giả chứng minh nội độc tố ảnh hưởng đến trọng lượng chuột trong thử nghiệm MWG Các thí nghiệm của chúng tơi cũng cho thấy kết quả tương tự Kiểm tra một số mẫu thử vắcxin ho gà (30 OIU/ml) cho thấy nồng độ nội độc tố có độ biến thiên cao từ 6000 -1 6000 EU/ml nhưng khơng vượt q 20000 EU/ml Vì thế giới hạn tối đa có thể đề xuất cho nồng độ nội độc tố trong vắcxin ho gà là khơng vượt q 25000... vi khuẩn hiện tại nên đề xuất ở khoảng 27 – 30 OIU/ml (13,5 -1 5 OIU/liều) Tại thời 6-9 tháng các chỉ số sinh học bao gồm cơng hiệu, an tồn và chỉ số tăng bạch cầu của vắcxin ho gà bất ho t nhiệt ở mức độ ổn định cao và phù hợp với các mức giới hạn về an tồn, cơng hiệu và LPF đề xuất ở trên Theo Ackland N nếu kết quả MWG khơng đạt nên để vắcxin ở 4oC trong một khoảng thời gian nữa để giảm độc tính xuống... thế nồng độ kháng ngun PT xác định bằng phản ứng ELISA đề xuất ở 0, 6-1 ,2 µg/ml (0, 3-0 ,6 µg/liều) trong đó nồng độ PT ho t động chuẩn độ trên tế bào CHO –K1 là 0, 1-0 ,3 µg/ml (0,0 5-0 ,15µg/liều) Có sự tương quan cao giữa chỉ số tăng bạch cầu và ho t tính xác định trên tế bào CHO –K1 vì cả 2 đều đánh giá ho t tính của PT nhưng xác định bằng các phương pháp và thể hiện bằng các đơn vị khác nhau Nhiều tác . 4 phương pháp xác định kháng nguyên ngoại độc tố ho gà và nội độc tố là: 7 - Xây dựng và chuẩn ho phương pháp ELISA định lượng nồng độ kháng nguyên độc tố ho gà PT trong vắcxin ho gà toàn. các phương pháp đánh giá kháng ngun ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an tồn cao tại Viện Vắcxin Nha trang với các mục tiêu sau: 3 1. Xõy. trắng - Xây dựng và chuẩn ho phương pháp LAL xác định nội độc tố (endotoxin) trong vắcxin ho gà toàn tế bào 2.2.4 Phương pháp kiểm định công hiệu và an toàn đặc hiệu vắcxin ho gà toàn tế