Xây dựng qui trình bào chế và tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao định chuẩn kiểm soát hàm lượng nuciferin từ lá sen hồng thu hái tại đồng tháp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ ĐẶNG QUỲNH TRÂN XÂY DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CHO VIÊN NANG CHỨA CAO ĐỊNH CHUẨN KIỂM SOÁT HÀM LƯỢNG NUCIFERIN TỪ LÁ SEN HỒNG THU HÁI TẠI ĐỒNG THÁP LUẬN VĂN THẠC SĨ CẦN THƠ – Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ ĐẶNG QUỲNH TRÂN XÂY DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CHO VIÊN NANG CHỨA CAO ĐỊNH CHUẨN KIỂM SOÁT HÀM LƯỢNG NUCIFERIN TỪ LÁ SEN HỒNG THU HÁI TẠI ĐỒNG THÁP Chuyên ngành: kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ CẦN THƠ – Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận văn Đặng Quỳnh Trân LỜI CẢM ƠN Quyển luận văn hoàn thành dựa tham khảo tài liệu nghiên cứu có liên quan, sách, báo chuyên ngành nhiều tác giả, đặc biệt tư vấn q Thầy Cơ q trình thực nghiệm, cùng hợp tác tất thành viên nhóm Trước tiên, nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ mơn hóa phân tích kiểm nghiệm tạo mọi điều kiện, tận tình hướng dẫn, Thầy truyền đạt tận tình kiến thức quý báu kinh nghiệm bổ ích để nhóm có hội rèn luyện, nhằm nâng cao kỹ phát triển chuyên sâu công việc người Dược sĩ làm công tác kiểm nghiệm sau Xin cảm ơn tất thành viên nhóm nghiên cứu dược K43 K44 giúp đỡ, động viên, hỗ trợ lẫn nhau, cùng giải khó khăn q trình thực Trong trình thực chắn khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong nhận góp ý, nhận xét từ q Thầy Cơ để nhóm rút kinh nghiệm quý báo bổ ích cho báo cáo Cuối cùng, em xin kính chúc q Thầy Cơ dồi nhiều sức khỏe, thành công công việc sống Trân trọng cảm ơn! Tác giả luận văn Đặng Quỳnh Trân MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan dược liệu Sen hồng hợp chất nuciferin 1.2 Xây dựng cơng thức, qui trình bào chế viên nang chứa cao dược liệu 12 1.3 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên nang chứa cao dược liệu 15 1.4 Các cơng trình nghiên cứu chế phẩm viên nang từ dược liệu Sen hồng 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3 Đạo đức nghiên cứu 32 Chương KẾT QUẢ 33 3.1 Xây dựng công thức, qui trình bào chế cho viên nang chứa cao chuẩn hóa kiểm sốt hàm lượng nuciferin từ Sen hồng 33 3.2 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao chuẩn hóa kiểm sốt hàm lượng nuciferin từ Sen hồng 52 Chương BÀN LUẬN 55 4.1 Xây dựng công thức, qui trình bào chế viên nang chứa cao chuẩn hóa kiểm soát hàm lượng nuciferin từ Sen hồng 55 4.2 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên nang chứa cao chuẩn hóa kiểm soát hàm lượng nuciferin từ Sen hồng 69 KẾT LUẬN 70 KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên ACN Acetonitrile Dược điển Việt Nam xuất DĐVN V lần thứ V CE Capillary electrophoresis High Performance Liquid HPLC Chromatography High Performance Thin Layer HPTLC Chromatography International Conference on ICH Harmonization IR Infrared Liquid Chromatography–Mass LC-MS Spectrometry LDL LOD LOQ MS PDA PTN RSD SKĐ SKLM TEA UV-Vis Low density lipoprotein Limit of detection Limit of quantitation Mass Spectrometry Photo Diode Array Phịng thí nghiệm Relative Standard Deviation Sắc ký đồ Sắc ký lớp mỏng Triethylamin Ultraviolet-Visible Nghĩa Tiếng Việt Điện di mao quản Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lớp mỏng hiệu cao Hội nghị quốc tế hài hòa Hồng ngoại Sắc ký lỏng ghép khối phổ Lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp Giới hạn phát Giới hạn định lượng Khối phổ Dãy diod quang Độ lệch chuẩn tương đối Tử ngoại - khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Nelumbo Bảng 1.2 Tóm tắt số nghiên cứu định tính định lượng nuciferin Sen Bảng 1.3 Qui định độ đồng khối lượng cho viên nang 16 Bảng 2.1 Bảng qui đổi liều dùng 27 Bảng 2.2 Dự kiến công thức viên nang cứng chứa cao chiết từ Sen 29 Bảng 2.3 Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn 31 Bảng 2.4 Dung môi tá dược 31 Bảng 2.5 Trang thiết bị 31 Bảng 3.1 Kết khảo sát pha tĩnh 33 Bảng 3.2 Kết khảo sát thay đổi thành phần pha động 34 Bảng 3.3 Kết khảo sát pH pha động 35 Bảng 3.4 Kết khảo sát tốc độ dòng khác 35 Bảng 3.5 Kết thẩm định tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn nuciferin 37 Bảng 3.6 Kết thẩm định tính tương thích hệ thống mẫu thử nuciferin 37 Bảng 3.7 Kết thẩm định tính tuyến tính 40 Bảng 3.8 Kết xác định LOD LOQ 40 Bảng 3.9 Kết thẩm định độ xác trung gian phương pháp 41 Bảng 3.10 Kết thẩm định độ phương pháp 42 Bảng 3.11 Kết thẩm định tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn nuciferin 43 Bảng 3.12 Kết thẩm định tính tuyến tính 45 Bảng 3.13 Kết thẩm định độ xác trung gian phương pháp 46 Bảng 3.14 Kết khảo sát cao chuẩn hóa Sen MgCO3 47 Bảng 3.15 Kết khảo sát cao chuẩn hóa Sen SYLOID® 244 FP 47 Bảng 3.16 Các công thức khảo sát tỷ lệ tá dược độn cơng thức viên nang cao chuẩn hóa Sen 48 Bảng 3.17 Kết khảo sát tỷ lệ tá dược độn công thức viên nang cao chuẩn hóa Sen 48 Bảng 3.18 Các công thức khảo sát viên nang cao chuẩn hóa Sen 49 Bảng 3.19 Kết định lượng cơng thức khảo sát viên nang cao chuẩn hóa Sen 49 Bảng 3.20 Kết độ hịa tan cơng thức khảo sát viên nang cao chuẩn hóa Sen 50 Bảng 3.21 Kết cơng thức thích hợp viên nang cao chuẩn hóa Sen 50 Bảng 3.22 Kết độ đồng khối lượng 52 Bảng 3.23 Kết định lượng nuciferin viên nang 53 Bảng 3.24 Kết độ hòa tan 54 Bảng 3.25 Kết giới hạn vi khuẩn viên nang 54 DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh loài Sen hồng Sen trắng Hình 3.1 Kết chồng pic SKĐ cột sắc ký 33 Hình 3.2 Kết chồng pic SKĐ tỉ lệ pha động 34 Hình 3.3 Kết chồng pic SKĐ pH khác 35 Hình 3.4 Kết chồng pic SKĐ tốc độ dòng khác 36 Hình 3.5 Kết chồng pic SKĐ mẫu chuẩn tiêm lặp lại lần liên tiếp 38 Hình 3.6 Kết chồng pic SKĐ mẫu thử tiêm lặp lại lần liên tiếp 38 Hình 3.7 Kết chồng phổ UV mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn 38 Hình 3.8 Kết chồng pic SKĐ thể tính đặc hiệu 39 Hình 3.9 Độ tinh khiết pic 39 Hình 3.10 Đồ thị tương quan nồng độ diện tích đỉnh nuciferin 40 Hình 3.11 Chồng pic SKĐ mẫu thử thẩm định độ xác liên ngày 41 Hình 3.12 Chồng pic SKĐ mẫu thử thẩm định độ mức nồng độ 42 Hình 3.13 Kết chồng pic SKĐ mẫu chuẩn mơi trường hịa tan 43 Hình 3.14 Kết chồng pic SKĐ thể tính đặc hiệu 44 Hình 3.15 Độ tinh khiết pic 44 Hình 3.16 Đồ thị tương quan nồng độ diện tích đỉnh nuciferin 45 Hình 3.17 Chồng pic SKĐ mẫu thử thẩm định độ xác ngày 46 Hình 3.18 Kết phối trộn cao chuẩn hóa Sen với tá dược 47 Hình 3.19 Chồng pic SKĐ kết định lượng cơng thức khảo sát 49 Hình 3.20 Chồng pic SKĐ kết độ hịa tan cơng thức khảo sát 50 Hình 3.21 Kết chồng pic lần tiêm mẫu thử 53 Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ pha động Rs 56 Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ pha động As 56 Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH pha động As 57 PL58 Mẫu ❖ Ngày Mẫu PL59 Mẫu Mẫu PL60 Mẫu Mẫu PL61 Phụ lục COA chuẩn nguyên liệu PL5.1 Chuẩn nuciferin PL62 PL5.2 Syloid® 244 FP PL63 PL5.3 Avicel ph101 PL64 PL5.4 Lactose PL65 PL5.5 Talc PL66 PL5.6 Magnesi stearat PL67 Phụ lục Kết kiểm nghiệm vi sinh PL68 PL69 Phụ lục Dự thảo qui trình kiểm nghiệm TIÊU CHUẨN CƠ SỞ Khoa Dược Đại học Y – Dược Cần Thơ VIÊN NANG Bộ mơn Hóa Phân Tích – Kiểm CAO CHUẨN HĨA LÁ SEN Có hiệu lực từ: Nghiệm Thuốc – Độc Chất Ban hành theo định số: … ngày … tháng …… năm 2022 Yêu cầu kỹ thuật 1.1 Công thức pha chế cho viên: Cao chuẩn hóa Sen: 300mg Tá dược: avicel pH101, lactose, syloid® 244EP, magnesi stearat, talc vừa đủ viên 1.2 Nguyên liệu Cao chuẩn hóa Sen đạt tiêu chuẩn sở Avicel pH101, lactose, syloid® 244 FP, magnesi stearat đạt tiêu chuẩn USP Talc đạt tiêu chuẩn BP Cồn 96o đạt tiêu chuẩn DĐVN IV 1.3 Chất lượng thành phẩm 1.3.1 Tính chất: Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, thân xanh nhạt Bột thuốc nang màu nâu đen, mùi đặc trưng 1.3.2 Độ đồng khối lượng: ± 7,5% so với khối lượng trung bình bột thuốc nang 1.3.3 Định tính: Phải có pic đặc trưng nuciferin 1.3.4 Định lượng: Hàm lượng Nuciferin mỗi viên phải đạt từ 85,0% – 115,0% (25,5 mg – 34,5 mg) so với hàm lượng ghi nhãn, tính theo khối lượng trung bình thuốc nang PL70 1.3.5 Độ hịa tan: Hàm lượng nuciferin hịa tan sau 45 phút khơng thấp 70% so với lượng ghi nhãn 1.3.6 Giới hạn nhiễm khuẩn Tên tiêu Tổng số vi khuẩn hiếu khí Tổng số nấm men, nấm mốc Salmonella Escherichia Coli Phương pháp thử Đơn vị tính CFU/g CFU/g /10g CFU/g Mức tối đa 104 102 Không phát 10 2.1 Tính chất Bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt yêu cầu nêu 2.2 Độ đồng khối lượng Thử theo DĐVN V, phụ lục 11.3 Mức chất lượng: ± 7,5% so với khối lượng trung bình thuốc nang 2.3 Định tính Chuẩn bị pha động: Dung dịch A: Acetonil, Dung dịch B: Trietyamin 0,1% điều chỉnh Acid acetic 30% đến pH 8,5 Chuẩn bị mẫu: Mẫu chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc nuciferin: hòa tan 10 mg chất chuẩn Nuciferin methanol vào bình định mức 10 mL dung dịch gốc 1000 µg/mL Dung dịch chuẩn làm việc nuciferin 15 µg/mL: Hút xác 75L dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL cho vào bình định mức mL, bổ sung vừa đủ pha động, thu dung dịch chuẩn có nồng độ 15 µg/mL Lọc qua màng lọc millipore 0,45 μm trước tiêm vào hệ thống HPLC Mẫu thử : Dung dịch thử: cân 20 viên nang, tính khối lượng trung bình viên nghiền mịn thành bột Cân xác khoảng khối lượng trung bình viên, cho vào bình định mức dung tích 50 mL Thêm khoảng 40 mL MeOH, siêu âm PL71 thời gian 20 phút để hòa tan Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc Lọc, hút xác 125 L cho vào bình định mức mL bổ sung pha động vừa đủ, lắc thu dung dịch thử có nồng độ nuciferin khoảng 15 µg/mL Lọc qua màng lọc millipore 0,45 μm trước tiêm vào hệ thống HPLC Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký pha đảo Phenomenex Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm, µm) Pha động: Dung dịch A – Dung dịch B (55 : 45(tt/tt)) Detector: Bước sóng 272 nm Tốc độ dịng : mL/phút Thể tích tiêm: 20 µL Nhiệt độ cột: 25ºC Mức chất lượng: sắc ký đồ dung dịch thử phải có pic có thời gian lưu tương ứng với pic nuciferin dung dịch chuẩn 2.4 Định lượng: phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Chuẩn bị dung môi pha động, mẫu chuẩn, mẫu thử mục 2.3 Tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn nuciferin lần liên tiếp Trên sắc ký đồ thu được, hệ số đối xứng pic nuciferin không lớn 2,0 Độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic lần lặp lại khơng q 2,0% Tiến hành sắc ký với dung dịch thử Từ diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng nuciferin chuẩn tính hàm lượng nuciferin chế phẩm Mức chất lượng: Hàm lượng Nuciferin mỗi viên phải đạt từ 85,0% – 115,0% (25,5 mg – 34,5 mg) so với hàm lượng ghi nhãn, tính theo khối lượng trung bình thuốc nang PL72 2.5 Độ hịa tan Thông số Điều kiện Môi trường Dung dịch đệm phosphate pH 6,8 Thể tích mơi trường 900 mL Thiết bị Kiểu cánh khuấy Tốc độ quay 100 vòng/phút Nhiệt độ môi trường 37 ± 0,5 oC Thời điểm lấy mẫu 45 phút Thể tích lấy mẫu 10 mL Tại thời điểm 45 phút, hút xác 10 mL dung dịch mơi trường thử độ hịa tan, lọc qua giấy lọc Hút xác mL dịch lọc, cho vào bình định mức 10 mL, thêm pha động vừa đủ 10 mL, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm tiêm vào hệ thống HPLC Tiến hành sắc ký với dung dịch thử Từ diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, tính hàm lượng nuciferin hòa tan sau 45 phút Mức chất lượng: Hàm lượng nuciferin hịa tan sau 45 phút khơng thấp 70% so với lượng ghi nhãn 2.6 Giới hạn nhiễm khuẩn Theo DĐVN PL 13,6 ... qui trình bào chế cho viên nang chứa cao định chuẩn kiểm soát hàm lượng nuciferin từ Sen hồng Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao định chuẩn kiểm soát hàm lượng nuciferin từ. .. thức, qui trình bào chế cho viên nang chứa cao chuẩn hóa kiểm sốt hàm lượng nuciferin từ Sen hồng 33 3.2 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao chuẩn hóa kiểm sốt hàm lượng nuciferin. .. qui trình bào chế cho viên nang chứa cao chuẩn hóa kiểm soát hàm lượng nuciferin từ Sen hồng 3.1.1 Xây dựng thẩm định qui trình định lượng Nuciferin cho viên nang chứa cao chuẩn hóa Sen hồng