Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở vườn Quốc gia Cúc Phương

Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở vườn Quốc gia Cúc Phương

đại học quốc gia h nội Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên Đào Thị Lơng Nghiên cứu đặc điểm sinh học v phân loại nấm men sinh bo tử bắn phân lập từ Vờn Quốc gia Cúc Phơng Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mà số: 62.42.40.01 Tóm tắt Luận án tiến sĩ sinh học Hà Nội - 2007 Công trình đợc hoàn thành tại: - Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội - Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngời hớng dẫn khoa học: GS.TS Phạm Văn Ty GS.TS Nguyễn Lân Dũng Phản biện 1: GS TS Nguyễn Đình Quyến Phản biện 2: PGS TS Lê Gia Hy Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Xuân Thành Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng cấp chấm luận án tiến sĩ họp Vµo håi ngày tháng năm 200 Có thể tìm hiểu luận ¸n t¹i: - Th− viƯn Qc gia ViƯt Nam - Trung tâm Thông tin- Th viện, Đại học Quốc gia Hà Nội Mở đầu Tính cấp thiết luận án Nấm men sinh bào tử bắn nhóm nấm men lớn, tồn tự nhiên, chiếm 14/90 chi nấm men với số lợng loài chiếm 1/10 tổng số loài nấm men đà biết (khoảng 80 loài) Đây nhóm vi sinh vật phong phú, hữu thiên nhiên nhng từ trớc đến cha đợc biết đến Là nhóm nấm men có tiềm sinh hàng loạt enzym nên cần phải đợc nghiên cứu để phát enzym có tính Đây miền đất trống, nghiên cứu có khả phát nhiều loài cho khoa học, góp phần bổ sung vào danh mục loài giíi ViƯt Nam n»m khu vùc cã khÝ hËu nóng, ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Việt Nam đợc đánh giá quốc gia có đa dạng sinh học phong phú Việt Nam, nghiên cứu đa dạng vi sinh vật thực bắt đầu, để góp phần vào công tìm kiếm nguồn gen mới, tiến hành thẩm định, tìm cách ứng dụng lu giữ chúng cho hệ sau, thực đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ Vờn Quốc gia Cúc Phơng Mục đích đề tài - Tìm hiểu nấm men sinh bào tử bắn- nhóm vi sinh vật phong phú c trú nhiều loại mà từ tr−íc ®Õn ch−a hỊ biÕt ®Õn ë ViƯt Nam- khởi nguồn cho nhánh nghiên cứu đa dạng sinh học - Tìm kiếm phát loµi míi cho khoa häc, bỉ sung vµo danh mơc loài giới - Bớc đầu tìm hiểu khả sinh chất hoạt động sinh học (các loại enzym ngoại bào) nhóm nấm men Những đóng góp luận án: - Là công trình nghiên cứu đa dạng sinh học nấm men sinh bào tử bắn Việt Nam - Đà phát đợc 16 loài đợc quốc tế công nhận: 12 loài thuộc chi Bullera loài thuộc chi Kockovaella Đa địa danh Việt Nam vào danh mục loài giới - Công trình tìm hiểu khả sinh chất hoạt động sinh học nhóm nấm men Bố cục luận án: Luận án bao gồm phần mở đầu, tổng quan, đối tợng phơng pháp nghiên cứu, kết thảo luận, kết luận kiến nghị, danh mục công trình, tài liệu tham khảo, phụ lục Luận án có 22 bảng, 45 hình, 109 tài liệu tham khảo Nội dung luận án Chơng Tổng quan 1.1 Đa dạng sinh học đa dạng vi sinh vật 1.2 Đại cơng nấm men 1.3 Các tiêu đợc sử dụng phân loại nấm men 1.4 Nấm men sinh bào tử bắn Chơng Đối tợng v phơng pháp nghiên cøu Chđng nÊm men: C¸c chđng nÊm men sinh bào tử bắn đợc phân lập theo phơng pháp Nakase Takashima (1993) Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá: Chủ yếu theo mô tả Yarrow (1998) Khả đồng hoá nitơ đợc xác định theo phơng pháp Nakase Suzuki(1986) Vitamin đòi hỏi bắt buộc đợc xác định theo Komagata Nakase (1967) Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách chiết, tinh xác định ubiquinon theo phơng pháp Nakase Suzuki (1986) Xyloza tế bào đợc phân tích sắc ký lớp mỏng sắc ký lỏng cao áp theo Nakase cộng (1976) Phân tích trật tự xây dựng phát sinh: Trình tự ADNr 18S, ITS bao gồm 5,8S D1/D2 26S đợc xác định theo Takashima Nakase (1999), Kurtzman Robnnet (1997) Sử dụng chơng trình computer CLUSTAL X ver 1.83 cđa Thompson vµ céng sù (1994) Các trình tự tham khảo dùng nghiên cứu phát sinh chủng loại đợc lấy từ liệu DDBJ, EMBL Gen Bank Cây phát sinh đợc xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phơng pháp Saitou Nei (1987) Thí nghiệm lai ADN-ADN: Phân lập tinh ADN thực theo phơng pháp Takashima Nakase (2000) Các thí nghiệm lai ADN-ADN genom đợc thực theo phơng pháp huỳnh quang Ezaki cộng (1989) Xác định hoạt tính enzym ngoại bào khả sinh chất kháng sinh phơng pháp khuyếch tán thạch Xác định sinh khối phơng pháp cân trọng lợng khô (Nguyễn Lân Dũng đtg, 1972) Chơng Kết v thảo luận 3.1 Phân lập nấm men Từ 20 mẫu thu thËp ë V−ên Qc gia Cóc Ph−¬ng, sư dơng phơng pháp phân lập nấm men sinh bào tử bắn Nakase Takashima, đà phân lập đợc 151 chủng nÊm men ®ã cã 121 chđng nÊm men sinh bào tử bắn Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, hình thái màu sắc khuẩn lạc, chủng đợc ghép thành 85 nhóm, nhóm chọn chủng làm đại diện cho nghiên cứu 3.2 Phân loại nấm men sinh bào tử bắn 3.2.1 Phân loại đến chi Dựa tiêu chí phân loại nấm men sinh bào tử bắn bao gồm: hình thái bào tử bắn, tạo thành bào tử đính có cuống, tồn xyloza ubiquinon chủ yếu, 85 chủng nghiên cứu đà đợc xếp vào líp: Hymenomycetes, Urediniomycetes vµ Ustilaginomycetes Líp Hymenomycetes bao gåm chi lµ Bullera vµ Kockovaella Líp Urediniomycetes gåm chi lµ Bannoa vµ Sprobolomyces Líp Ustilaginomycetes gåm mét chi Tilletiopsis (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Sắp xếp chủng nấm men sinh bào tử bắn vào chi dựa đặc điểm hoá phân loại hình thái Hình Số Xyloza Ubiquinon dạng lợng chủ yếu bào tử chủng tế bào bắn 39 + + 34 - - - Q-10 §èi xøng Q-10 §èi xøng Không Q-10 đối xứng Không đối Q-10 (H2) xứng dài, Q-10 cong lỡi liềm Bào tử đính có cuống Chi - Bullera + Kockovaella - Sprobolomyces Líp Hymenomycetes Urediniomycetes - Bannoa - Tilletiopsis Ustilaginomycetes Cã 39 chủng nÊm men thuộc chi Bullera đợc c trng bi khun lc mu trng đến vàng, sinh sản bào tử bắn dạng đối xứng bào tử nảy chồi, chứa xyloza tế bào ubiquinon chủ yếu Q-10 Cã chủng có đặc điểm: chứa xyloza tế bào, Q-10 ubiquinon chủ yếu, sinh sản bào tử bắn dạng đối xứng, bào tử đính có cuống tế bào nảy chồi Đây đặc điểm ®Ỉc tr−ng cho chi Kockovaella Cã 34 chđng nÊm men đợc đặc trng khuẩn lạc có màu hồng, cam đến đỏ, sinh sản bào tử bắn dạng không đối xứng, không chứa xyloza tế bào có ubiquinon chủ yếu Q-10 chủng thuộc chi Sporobolomyces Có chủng nấm men đợc đặc trng khuẩn lạc có màu hồng, cam, sinh sản bào tử bắn dạng không đối xứng, không chứa xyloza tế bào có ubiquinon chủ yếu Q-10(H2) Những chđng nµy thc chi Bannoa Cã chđng nÊm men đợc đặc trng sinh sản bào tử bắn dạng dài cong lỡi liềm, không đối xứng, không chøa xyloza tÕ bµo vµ cã ubiquinon chđ u Q-10 Những chủng thuộc chi Tilletiopsis 3.2.2 Vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera Để xác định vị trí phân loại chủng nấm men phân lập, thuộc chi Bullera, tiến hành đọc trình tự ADNr 18S, vùng ITS, đoạn D1/D2 26S nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá chúng Một số nhóm cha xác định rõ vị trí phân loại đợc tiến hành lai ADN genom Trình tự đoạn ADNr 18S , ITS 26S (đoạn D1/D2) chủng nấm men đợc đọc trực tiếp máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant cđa h·ng Applied Biosystems (Mü) Tr×nh tù nucleotit chủng nấm men đợc so sánh với trình tự đà có GenBank sử dụng giao diện tìm kiếm nucleotide-nucleotide BLAST Trung tâm Tin- Công nghệ sinh häc Quèc gia (National Center for Biotechnology Information), Bethesda (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Cây phả hệ c xây dng da trình t ADNr 18S (450 bp) ca chng nghiên cứu so s¸nh với 38 lồi thuộc c¸c chi Bullera, Cryptococcus, Dioszegia, Kockovaella, Trimorphomyces Udeniomyces Kết hình 3.3 cho thÊy: 39 chđng nÊm men míi ph©n lËp thc chi Bullera gộp thành nhóm nằm rải rác dòng Bulleromyces Cryptococcus luteolus (hay Luteolus) lớp Hymenomycetes Nhãm A cã sè l−ỵng lín nhÊt gåm 27 chđng có quan hệ họ hàng gần với loài thuộc nhánh Bullera huiaensis B mrakii dòng (lineage) Cryptococcus luteolus Nhóm phân lập đợc 15/20 mẫu lá, chøng tá chóng rÊt phỉ biÕn ë V−ên qc gia Cúc Phơng Nhóm B gồm chủng nhánh với Cryptococcus podzolicus (không sinh bào tử bắn) Nhóm C gồm chủng nằm vị trí gần với B coprosmaensis, B sinensis vµ C luteolus Nhãm D gåm chđng có quan hệ họ hàng gần với nhóm B variabilis Nhóm E gồm chủng hợp thành nhóm với loµi B pseudoalba, B unica, C cellulolyticus vµ C laurentii dòng Bulleromyces Để xác định xác vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn đến loài tiến hành nghiên cứu kết hợp đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá so sánh trình tự ADNr ITS 26S (D1/D2) Berbee đtg (1995); Fell đtg (2000); James đtg (1996) đà sử dụng trình tự vùng ITS nh thớc đo phân loại hữu ích nhờ vùng có tỷ lệ sai khác cao hẳn so với vùng ADNr 18S 26S Fell ®tg (2000); Sugita vµ ®tg (1999) cịng ®· chøng minh r»ng tû lÖ nucleotit vïng ITS ë cïng mét loài thờng khác nhỏ 1% VY-143 0.02 VY-85 VY-23 50 VY-5 VY-69 VY-50 Bullera pseudohuiaensis (AF314994) Bullera mrakii (AF314993) 54 VY-3 52 VY-116 VY-51 VY-20 VY-144 VY-42 68 VY-21 VY-75 Nhãm A VY-91 54 VY-102 Bullera waltii (AB022929) 52 Bullera boninensis (AB022928) Bullera huiaensis (D78331) 56 VY-103 VY-65 VY-142 VY-55 54 Bullera anomala (AF453291) VY-86 91 VY-140 61 VY-60 VY-57 83 VY-145 VY-105 76 VY-45 Bullera pseudoschimicola (AF314997) 72 Bullera komagatae (AF314995) 79 VY-139 72 Bullera schimicola (AB022930) 77 Dioszegia hungarica (AB032638) Dioszegia changbaiensis (AY242817) 93 crocea (D31648) 73 Dioszegia aurantiaca (AB049615) Dioszegia 65 71 Bullera melastomae (AB118872) Bullera formosana (AB118873) 86 VY112 (AB261011) Nhãm B Cryptococcus podzolicus (AB032645) VY-104 89 96 88 VY-48 Bullera coprosmaensis 58 90 Bullera derxii (D78329) VY-77 Bullera sinensis (D78328) Nhãm C 85 VY-132 50 91 Bullera kunmingensis (AF325169) Cryptococcus luteolus (AB032641) 100 Bullera oryzae (D31652) 99 Bullera setariae (AB118875) VY 100 100 VY-128 Bullera pseudovariabilis (AF453290) Bullera variabilis (D31654) 89 100 100 Bullera panici (AY188386) Nhãm D Bullera begoniae (AB118874) 100 Bullera siamensis (AY188389) 100 VY-118 VY-63 54 100 Bullera penniseticola 58 Bullera hannae 78 VY-120 Bullera alba 56 Bullera unica Nhãm E Cryptococcus laurentii (AB032640) 58 51 55 62 Bullera pseudoalba (D31660) VY-68 (AB110694) Kockovaella thailandica 63 Trimorphomyces_papilionaceus (AB085808) Udeniomyces puniceus (D31658) 54 61 Hình 3.3 Vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera với loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr 18S Cả 39 chng nấm men thuộc chi Bullera c xác định trình t ADNr vùng ITS (480- 580 bp) Cây phả hệ c xây dng da trình t ADNr vùng ITS ca chng nghiên cứu so sánh vi 38 lồi thuộc c¸c chi Auriculibuller, Bullera, Bulleromyces, Calathella, Cryptococcus, Dioszegia Trên phả hệ, 39 chủng nấm men nghiên cứu nằm rải rác nhóm nh phả hệ ADNr 18S dòng Bulleromyces C luteolus cđa líp Hymenomycetes HiƯn nay, ngµy cµng cã nhiều liệu đoạn D1/D2 ADNr 26S nấm men đà đợc gửi vào GenBank có nhiều ngời sử dụng số liệu phân loại nấm men Fell đtg (2000); Kurtzman Robnett (1997, 1998); Sugita Nishikawa (2003) chứng minh chđng nÊm men cã tû lƯ nucleotit kh¸c lín 1% thuộc loài khác Tất 39 chủng nÊm men thuéc chi Bullera x¸c định trình t ADNr 26S đoạn D1/D2 (600 bp) Cây phả hệ c xây dng dựa trình tự 39 chng nghiên cứu so sánh vi 36 loi thuc chi Auriculibuller, Bullera, Bulleribasidium, Cryptococcus, Dioszegia, Kockovaella, Tremella, Trichosporon Trªn phả hệ dựa vào ADNr 26S đoạn D1/D2, 39 chđng nÊm men nghiªn cøu thc chi Bullera cịng n»m xen kẽ nhóm dòng Bulleromyces Cryptococcus luteolus lớp Hymenomycetes tơng tự nh phả hệ 18S ITS Sự sai khác trình tự ADNr vùng ITS D1/D2 chủng nấm men nghiên cứu với loài có quan hệ họ hàng gần đợc so sánh Nhóm A: gồm 27 chủng đợc chia thành nhóm nhỏ Nhóm nhỏ 1: có chủng VY-3, VT-20, VY-85, VY-91 VY-102 đợc xếp vào loài sai khác chúng mức độ ADNr - Chủng VY-77 sai khác víi B sinensis 0,6 % ADNr ë vïng ITS vµ tơng đồng đoạn D1/D2 Chủng không khác biệt nhiều so sánh đặc điểm sinh lý, sinh hoá với loài B sinensis VY-77 thuộc loài Bullera sinensis Nhãm D: gåm chđng chia lµm nhãm nhỏ Hai chủng VY-63 VY-118, sai khác trình tự ADNr vùng ITS D1/D2, sai kh¸c víi B panici 1,9 % ë vïng ITS 26S (D1/D2) 0,5 % Cần thực lai ADN genom để xác định rõ vị trí phân loại nhóm nhỏ Chủng VY-2 sai khác với B setariae 4,5 % ADNr ë vïng ITS vµ D1/D2 lµ % VY-2 thc loµi míi Chđng VY-128 cã mức độ sai khác đủ lớn để phân biệt loài khác ADNr vùng ITS với B variabilis B pseudovariabilis (4,75,3 %) đoạn D1/D2 với B pseudovariabilis, B variabilis vµ Bulleribasidium oberjochense (2,0-2,2 %) VY-128 thuéc loµi míi Nhãm E: gåm chđng chia lµm nhãm nhá Chđng VY-68 sai kh¸c víi B pseudoalba 3,6 % vùng ITS D1/D2 26S 0,7 % Cần lai ADN genom để xác định rõ vị trí phân loại nhóm nhỏ Chủng VY-120 sai khác với B japonica 0,3 % ADNr ë vïng ITS vµ D1/D2 lµ 0,2 % VY-120 thuéc loµi Bullera japonica Lai ADN genom Thí nghiệm lai ADN genom đợc thực chủng nấm men cha xác định rõ vị trí phân loại với chủng nghiên cứu với chủng chn cã quan hƯ gÇn nhÊt Nhãm A cã nhãm nhá A2, A3 vµ A7 Nhãm nhá A2 có hai chủng VY-42 VY-75 đợc chọn làm đại diện để thực lai ADN Kết ghi bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ bắt cặp ADN chóng rÊt cao (92-93 %), hai chđng VY-42 vµ VY75 thc cïng mét loµi Nhãm nhá A3, gåm chđng chia làm đôi VY-5, VY-23, VY103 VY-21, VY-69, chóng sai kh¸c 18-19 bp ë ADNr vïng ITS 4-5 bp đoạn D1/D2, tỷ lệ G+C khác 2,5 % Hai chủng VY-5 VY-69 đợc chän ®Ĩ lai cïng chđng chn Bullera nakasei JCM 13329 KÕt qu¶ ghi ë b¶ng 3.9 cho thÊy c¶ chủng có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp 16,3- 48,8 %, chúng thuộc loài khác VY-5 VY-69 loài khác Nhóm nhỏ A7 gồm chủng VY-55, VY-65 VY-142, khác với loài đà biết, nhng khác bp ADNr vùng ITS D1/D2 Kết lai cho thÊy chóng thc cïng mét loµi (tû lƯ bắt cặp ADN 72,3 - 93,1%) Bảng 3.9 Kết lai ADN genom cđa c¸c chđng nÊm men nghi ngê lµ loµi míi thc nhãm A chi Bullera Chđng VY-42 VY-75 VY-5 VY-69 JCM 13329 VY-55 VY-65 VY-142 Tû lÖ G+C (Mol%) 41,7 43,1 39,7 42,2 Nhãm A2 VY75 100 92 VY-5 VY69 JCM 13329 100 48,8 43,6 100 36,8 Nhãm A7 16,3 26,1 25,8 43.8 44.6 43.7 VY42 Tû lệ ADN bắt cặp (%) Nhóm A3 VY55 VY65 VY142 93 100 100 100 74.6 72.3 91.3 100 100 86.5 93.1 100 Nhãm C cã ba chđng VY-48, VY-104 vµ chủng chuẩn Cryptococcus luteolus JCM 3689 đợc tiến hành lai ADN genom víi KÕt qu¶ ghi ë b¶ng 3.10 cho thÊy hai chđng VY-48 vµ VY-104 cã tû lƯ ADN genom bắt cặp cao 95,2-100 %, giống nh kết tơng đồng trình tự ITS D1/D2 Trái lại chúng có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với Cryptococcus luteolus, loài không sinh bào tử bắn (24-35%) Có thể nhận định VY-48 VY-104 mét loµi vµ lµ loµi míi Nhãm D Lai ADN genom đợc thực chủng VY-63, VY118 chđng chn B panici JCM 11819 KÕt qu¶ lai cđa chủng khẳng định rõ VY-63 VY-118 loài khác hẳn với B panici có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp (13,1-16,5%) khác xa ë tû lƯ G+C (8,3 %) VY-63 vµ VY-118 lµ loài (bảng 3.10) Nhóm E Chủng VY-68 chủng chuẩn B pseudoalba JCM 5290 đợc lai ADN với Tỷ lệ bắt cặp ADN chúng thấp 12-14 % đà khẳng định VY-68 loài Bảng 3.10 Kết lai ADN genom chủng nấm men nghi ngờ loài nhóm C, D E thuộc chi Bullera Tỷ lệ ADN bắt cặp (%) Chđng Tû lƯ Nhãm C Nhãm D G+C (Mol%) VY48 VY104 JCM 3689 VY-48 59,1 100 95,2 24,6 VY-104 58,7 100 100 26,8 JCM 3689 59,5 35,8 32,5 100 VY-63 Nhãm E VY63 VY- JCM VY118 11819 68 JCM 5290 54,2 100 98,6 15,9 VY-118 54,7 100 100 16,5 JCM 11819 46,4 13,7 13,1 100 VY-68 54,0 100 14 JCM 5290 52,0 12 100 Mô tả loài Có 25/44 chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera đợc xếp vào 12 loài Đại diện cho 12 chđng chn lµ: VY-75, VY-5, VY-69, VY-50, VY-55, VY-86, VY-112, VY-48, VY-2, VY-118, VY-128 VY-68 Các chủng chuẩn đợc mô tả tiếng Latin tiếng Việt gồm đặc điểm hình thái, nuôi cấy: màu sắc, hình dạng, bề mặt khuẩn lạc; hình dạng, kích thớc tế bào sinh dỡng, bào tử chồi, bào tử bắn; tạo thành khuẩn ty thật khuẩn ty giả; đặc điểm sinh lý sinh hoá: khả lên men, khả đồng hoá 46 nguồn cacbon, khả đồng hoá nguồn nitơ, nhiệt độ giới hạn cao cho sinh trởng, vitamin bắt buộc, chất tạo thành giống tinh bột, phản ứng mầu với xanh Diazoni B, phân giải urê, tách axít béo, hoá lỏng gelatin, sinh trởng môi trờng chứa 50% glucoza; đặc điểm hoá phân loại nh thành phần C+G ADN, hệ thống ubiquinon chủ yếu tồn xyloza tế bào Tên chủng chuẩn, nguồn gốc mà số nơi lu giữ Việt Nam Nhật Bản 3.2.3 Vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Kockovaella Để xác định vị trí phân loại chủng phân lập thuộc chi Kockovaella, tiến hành đọc trình tự ADNr 18S, vùng ITS, 26S đoạn D1/D2 nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng nấm men Những chủng cha xác định rõ vị trí phân loại tiến hành lai ADN genom Có chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Kockovaella: VY-61, VY-67, VY-125, VY-127 VY-137 Trình t gần 1800 nucleotit cña ADNr 18S chủng nÊm men xác nh So sánh tng ng vi trình t c¸c lồi cã quan hệ họ hàng gần, chng trình Blast Cây phả hệ c xây dng da trình t ADNr 18S ca chng nghiên cøu với 26 lồi thuộc c¸c chi Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Fibulobasidium, Filobasidiell, Kockovaella Trimorphomyces (Hình 3.6) Quan sát phả hệ, chủng nghiên cứu nằm gần víi nhãm Fellomyces sichuanensis, F chinensis, F lichenicola vµ K schimae 0.01 Filobasidiella neoformans_ AF356652 VY-61 91 99 VY-67 86 VY-137 81 VY-127 97 VY-125 79 Fellomyces sichuanensis AB032662 Kockovaella schimae_AB005482 88 Fellomyces chinensis_AB032660 75 Fellomyces lichenicola_ AB032661 69 Fellomyces distylii_AB001036 59 Fellomyces ogasawarensis_ AB001035 Fellomyces thailandicus_ AB044804 83 Kockovaella phaffii_AB005481 Kockovaella machilophila_ AB005479 87 Kockovaella barringtoniae_ AB052631 Kockovaella thailandica_ AB052559 51 Kockovaella imperatae_AB005561 94 67 62 Kockovaella sacchari_AB052560 Fellomyces fuzhouensis_ AB001032 89 100 Fellomyces_polyborus_D64117 Fellomyces borneensis_AB032659 82 Fellomyces horovitziae_ AB001033 Fibulobasidium inconspicuum_D25367 Cryptococcus laurentii_ AB032640 53 50 Cryptococcus flavescens_ AB085797 99 93 Cryptococcus aureus_AB085795 Bullera globospora_D31650 100 Cryptococcus dimennae_AB032627 Cryptococcus carnescens_ AB085798 95 Cryptococcus peneaus_AB085799 Hình 3.6 Vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Kockovaella với loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr 18S Trình t ADNr vùng ITS (bao gồm vùng 5,8S) chủng nấm men nghiên cứu c xác nh (515- 525 bp) Cây phả hệ c xây dng da trình t ADNr vùng ITS ca chng nghiên cứu vi 25 loi thuc chi Auriculibuller, Bullera, Bulleromyces, Calathella, Cryptococcus, Fellomyces Kockovaella Năm chủng nghiên cứu tạo thành nhánh khác biệt với loài đà biết So sánh trình tự ADNr vùng ITS thể rõ: chủng nghiên cứu sai khác 5-12/571 bp (0,9-2,1 %) sai khác với loài gần nhÊt 35-54/571 bp (6,1-9,5 %) VY-61 sai kh¸c víi VY-67 VY- 125 bp (0,9 %), khác với VY-127 bp (1,4 %) khác với VY-137 lµ 10 bp (1,8 %) Hai chđng VY-67 vµ VY-125 có trình tự ITS tơng đồng, sai khác với VY-127 vµ VY-137 lµ bp (1,6 %) Chđng VY-127 sai khác với VY-137 12 bp (2,1 %) Từ kết xếp chủng nghiên cứu thuộc loài khác khác với loài đà biết Trình t ADNr 26S đoạn D1/D2 (600 bp) c xác nh Cây phả hệ c xây dng chng nghiên cứu vi 27 loi thuc chi Auriculibuller, Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella Sterigmatosporidium Quan sát phát sinh chủng loại cho thấy chủng nghiên cứu nằm gần tách hẳn nhánh Kockovaella schimae So sánh trình tự ADNr đoạn D1/D2 khẳng định điều này: chủng nghiên cứu sai kh¸c 2-5/591 bp (0,30,8 %), sai kh¸c víi Kockovaella schimae 3-5/591 bp (0,5-0,8 %) sai khác với loài có quan hệ gần khác 6-12/591 bp (1,0-2,0 %) Từ kết phân tích trình tự ADNr 18S, vïng ITS vµ D1/D2 26S cđa chđng nÊm men thuộc chi Kockovaella cha thể khẳng định đợc vị trí phân loại chúng Muốn biết chắn chúng có phải loài không cần phải thực lai ADN genom KÕt qu¶ ghi ë b¶ng 3.14 cho thấy chủng VY-61 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với chủng nghiên cứu khác (15-35 %) thấp với loài có quan hệ gần (2-22 %) Hai chủng VY-67 VY-125 có tỷ lệ bắt cặp với cao (84-93 %), nhng thấp với loài nghiên cứu khác 28-47 %, thấp với loài có quan hệ gần (3-30 %) Chủng VY-127 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với chủng nghiên cứu khác (15-47 %) thấp với loài cã quan hƯ gÇn (2-39 %) Chđng VY-137 cã tû lệ bắt cặp ADN thấp với chủng nghiên cứu khác (25-47 %) thấp với loài có quan hệ gần (21-26 %) Từ kết nghiên cứu đà khẳng định VY-67 VY-125 thuộc loài mới, VY-61, VY-127 VY-137 thuộc loài khác Bảng 3.14 Kết lai ADN genom chủng nghiên cứu thuộc chi Kockovaella với loài có quan hệ họ hàng gần Tỷ lệ ADN bắt cặp (%) JCM 9862 JCM10164 JCM10165 JCM10166 F sichuanensis JCM10051 F lichenicola VY-137 F chinensis VY-127 F distylii VY-125 K schimae VY-67 Kockovaella sp VY-61 53.2 100 ND 33 15 30 16 22 VY-67 Loµi VY-61 Mol % Chđng G+C 53.6 ND 100 84 ND ND ND ND ND ND ND 53.6 35 93 100 28 44 9 30 54.1 33 ND 47 100 30 10 12 39 53.5 31 ND 47 25 100 8 14 52.8 16 ND 17 10 26 100 14 46 50.2 ND 100 10 42 54.8 ND 11 16 100 78 74 53.3 ND 34 100 86 54.3 ND 2 100 VY125 VY127 VY137 JCM 10051 JCM 9862 JCM 10164 JCM 10165 JCM 10166 ND, số liệu Mô tả loµi míi thc chi Kockovaella Cã 5/5 chđng nÊm men sinh bào thử bắn thuộc chi Kockovaella đợc xếp vào loài Bốn chủng chuẩn đại diện cho loài là: VY-61, VY-125, VY-127 VY-137 Các chủng chuẩn đợc mô tả tiếng Latin tiếng Việt gồm đặc điểm hình thái, nuôi cấy; đặc điểm sinh lý sinh hoá; đặc điểm hoá phân loại; tên chủng chuẩn, nguồn gốc mà số nơi lu giữ Việt Nam Nhật Bản 3.3 đa dạng nấm men sinh bào tử bắn Vờn quốc gia cúc phơng Từ 20 mẫu thu thập Vờn Quốc gia Cúc Phơng, đà phân lập đợc 151 chủng nấm men, có 121 chủng sinh bào tử bắn Các chủng nấm men sinh bào tử bắn đợc phân lập 100% số mẫu thu thập chiếm 80,13 % số chủng phân lập Trong số 85 chủng đợc lựa chọn để nghiªn cøu, 44 chđng thc líp Hymenomycetes gåm chi Bullera (39 chđng) vµ Kockovaella (5 chđng) Cã 39 chđng thc líp Urediniomyces gåm chi Bannoa (5 chđng), Sporobolomyces (34 chủng) Hai chủng lại chi Tilletiopsis thuộc lớp Ustilaginomyces Trong luận án này, thực nghiên cứu sâu đợc 44 chủng thuộc lớp Hymenomycetes đà cho thấy đa dạng loài phong phú Vờn Quốc gia Cúc Phơng Số lợng chủng nấm men loài thuộc lớp Hymenomycetes mẫu thu thập Vờn Quốc gia Cúc Phơng phong phú, chiếm 70,4 % số lợng chủng nghiên cứu Điển hình Mù u, (Calophyllum membranaceum) 4/6 chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc loài mới, Bời lời (Litsea euosma) Thăng mộc núi (Anadendrum montanum) 3/4 chủng thuộc loài Lá Tình hoa đẹp (Eranthemum pulchellum) Shimastoglottis calyptrata chứa 3/3 chủng thuộc loài Chỉ có mẫu (15%) không tìm thấy nấm men thuộc lớp Hymenomycetes mẫu (15%) không tìm thấy loài Kết bảng 3.16 cho thấy số lợng loài đợc phát phong phú Trong số 44 chủng thuộc lớp Hymenomycetes đợc nghiên cứu, đà phân loại đợc 21 loài, loài thuộc loài đà biết (23,8 %), 16 loài thuộc loài (76,4%) Riêng chi Kockovaella có loài số chủng nghiên cứu Có loài đặt tên Bullera cuulongensis, B nhoquanica, B haininhensis, B ninhbinhensis, B hoabinhensis, Kockovaella litseae, K cucphuongensis, K vietnamensis, K calophilli đà đợc công bố, số lại đợc công bố thời gian tới Bảng 3.16 Số lợng loài nấm men sinh bào tử bắn thuộc lớp Hymenomycetes đợc phân lập Vờn Quốc gia Cúc Phơng TT Loài 10 11 Bullera mrakii Bullera sp 1* Bullera sp 2* Bullera sp 3* B cuulongensis** B.pseudoschimicola B nhoquanica** B haininhensis** B ninhbinhensis** B oryzae B sinensis Sè l−ỵng chđng 5 3 Tû lÖ (%) 11,4 11,4 6,8 4,5 2,3 11,4 6,8 6,8 2,3 4,5 2,3 TT 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Loµi Bullera sp 4* Bullera sp 5* Bullera sp 6* Bullera sp 7* Bullera japonica B hoabinhensis** K litseae** K cucphuongensis** K vietnamensis** K calophilli** Tæng céng Sè l−ỵng chđng 2 1 1 1 44 Tû lÖ (%) 4,5 2,3 4,5 2,3 2,3 2,3 2,3 4,5 2,3 2,3 100 *Loµi míi đợc công bố thời gian tới **Loài đà đợc công bố luận án 3.4 Hoạt tính sinh học chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera 3.4.1 Khả sinh enzym ngoại bào Ba mơi chín chủng nấm men sinh bào tử bắn đợc nuôi môi trờng YM dịch thể, pH 6, máy lắc 220 vòng/phút, 200C ngày Ly tâm thu dịch trong, nhỏ vào lỗ khoan môi trờng đà chứa chất (Tinh bột, CMC, cazein, kitin, Tween 80), đặt tủ ấm 300C Sau 24 giờ, xác định vòng phân giải chất Kết ghi hình 3.9 cho thấy khả phân giải chất 39 chủng nấm men khác Trên chất tinh bột kitin, số chủng có hoạt tính enzym mạnh chiếm 15%, tỷ lệ lớn nấm men chđ u chØ sư dơng ®−êng cho sinh tr−ëng, khả sinh enzym ngoại bào Với chất CMC, số chủng có hoạt tính enzym mạnh chiếm 8% Trong Tween 80 cazein, số lợng chủng không sinh enzym phân giải chất chiếm 13 33 %, chủng có hoạt tính enzym mạnh Đa số chủng có hoạt tính enzym trung bình, đờng kính vòng phân giải chất 10