Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở vườn quốc gia cúc phương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN …………………… Đào Thị Lương NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CỦA NẤM MEN SINH BÀO TỬ BẮN PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY Ở VƯỜN QUỐC GIA CÚC PHƯƠNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62.42.40.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Cơng trình hồn thành tại: - Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà Nhật –JCM, RIKEN, Nhật Bản NộiBản - 2008 - Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội - Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phạm Văn Ty GS.TS Nguyễn Lân Dũng Phản biện 1: GS TS Nguyễn Đình Quyến Phản biện 2: PGS TS Lê Gia Hy Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Xuân Thành Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp Nhà nước chấm luận án tiến sĩ họp Phòng 418, nhà T1, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Vào hồi 00 ngày 24 tháng năm 2008 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin- Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt iii Danh mục bảng iv Danh mục hình vẽ, đồ thị vi Mục lục viii MỞ ĐẦU Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Đa dạng sinh học đa dạng vi sinh vật 1.1.1 Đa dạng sinh học 1.1.2 Đa dạng vi sinh vật 1.1.3 Nghiên cứu đa dạng nấm men nấm men sinh bào tử bắn 1.1.3 Nghiên cứu nấm men Thái Lan 1.1.3.2 Nghiên cứu nấm men Indonesia 1.1.3.3 Nấm men rừng Đài Loan 1.1.3.4 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn Trung Quốc 1.1.3.5 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn Nhật Bản 1.1.3.6 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn số nước khác 1.1.3.7 Nghiên cứu nấm men Việt Nam 10 1.2 Đại cương nấm men 1.2.1 Định nghĩa nấm men 10 1.2.2 Hình thái cấu trúc nấm men 10 1.2.2.1 Hình thái tế bào nấm men 10 1.2.2.2 Cấu trúc tế bào 12 1.2.3 Phương thức sinh sản nấm men 15 1.2.3.1 Sinh sản vơ tính 15 1.2.3.2 Sinh sản hữu tính 18 22 1.2.4 Phân loại nấm men 1.2.4.1 Các nấm men túi 22 1.2.4.2 Các nấm men đảm 23 ix 1.3 ứng dụng nấm men đời sống 24 1.3.1 Nấm men lên men etylic 24 1.3.2 Các nấm men nhà sản xuất protein đơn bào 25 1.3.3 Các nấm men nguồn sản xuất sản phẩm công nghiệp 25 khác 1.3.4 Nấm men dùng làm tác nhân probiotic liệu pháp sinh 27 học trị liệu 1.3.5 Sử dụng nấm men để hạn chế bệnh sau thu hoạch trái 27 ngũ 1.3.6 Nấm men tác nhân phục hồi sinh học 27 1.3.7 Cải biến nấm men đột biến, lai thể nguyên sinh kĩ 28 thuật ADN tái tổ hợp 1.3.8 Dùng nấm men làm sinh vật biểu ADN tái tổ hợp 1.4 Các tiêu sử dụng phân loại nấm men 1.4.1 Các nghiên cứu dùng phân loại nấm men 28 29 29 1.4.1.1 Các đặc điểm hình thái ni cấy 29 1.4.1.2 Các đặc điểm sinh lý sinh hoá 29 1.4.1.3 Các đặc điểm hoá phân loại sinh học phân tử 30 30 1.4.2 Các bước định danh 1.4.2.1 Phương pháp phân loại thông thường 31 1.4.2.2 Phương pháp sử dụng số liệu trình tự ADNr 31 1.4.3 Các tiêu dùng phân loại đại 32 1.4.3.1 Hoá phân loại 32 1.4.3.2 Sinh học phân tử 33 1.5 Nấm men sinh bào tử bắn 39 1.5.1 Đặc điểm nấm men sinh bào tử bắn 39 1.5.2 Lịch sử nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn 40 1.5.3 Vị trí nấm men sinh bào tử bắn phả hệ 42 Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 48 48 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Mẫu thu thập 48 2.1.2 Vi sinh vật 48 x 2.1.2.1 Các vi sinh vật kiểm định 48 2.1.2.2 Các chủng nấm men chuẩn dùng lai ADN genom 48 2.1.3 Thiết bị máy móc 48 2.1.4 Các loại môi trường 49 2.1.4.1 Môi trường phân lập nuôi nấm men sinh bào tử bắn 49 2.1.4.2 Môi trường phân loại 49 2.1.4.3 Môi trường nuôi vi sinh vật kiểm định 51 2.1.4.4 Mơi trường xác định hoạt tính enzym 51 2.1.4.5 Môi trường cho sinh tổng hợp enzym 51 51 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp phân lập 51 2.2.2 Phương pháp phân loại nấm men 52 2.2.2.1 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái 52 2.2.2.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hoá 52 2.2.2.3 Hoá phân loại 55 2.2.2.4 Phân loại dựa vào sinh học phân tử 59 2.2.3 Xác định hoạt tính enzym 65 2.2.4 Xác định hoạt tính kháng sinh 65 2.2.5 Xác định sinh khối 65 2.2.6 Xác định pH 66 2.2.7 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho q trình 66 sinh tổng hợp enzym dịch nuôi nấm men 2.2.7.1 Lựa chọn môi trường thích hợp 66 2.2.7.2 Lựa chọn pH ni cấy thích hợp 66 2.2.7.3 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 66 2.2.7.4 Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp 66 67 Chương Kết thảo luận 67 3.1 Phân lập nấm men 3.1.1 Địa điểm thu thập mẫu 67 3.1.2 Phân lập 67 3.2 Phân loại nấm men sinh bào tử bắn 69 69 3.2.1 Phân loại đến chi 3.2.1.1 Hệ thống ubiquinon chủ yếu xi 69 3.2.1.2 Xác định xyloza tế bào 70 3.2.1.3 Phân loại đến cấp độ chi 70 3.2.2 Vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc 72 chi Bullera 3.2.2.1 Xác định phân tích trình tự ADNr 18S 72 3.2.2.2 Xác định phân tích trình tự ADNr ITS 74 3.2.2.3 Xác định phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2 76 3.2.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng nấm men 84 sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera 3.2.2.5 Phân loại chủng nấm men thuộc chi Bullera đến loài 90 3.2.2.6 Mơ tả lồi 96 3.2.3 Vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc 97 chi Kockovaella 3.2.3.1 Xác định phân tích trình tự ADNr 18S 97 3.2.3.2 Xác định phân tích trình tự ADNr vùng ITS 98 3.2.3.3 Xác định phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2 100 3.2.3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng nấm men sinh 102 bào tử bắn thuộc chi Kockovaella 3.2.3.5 Phân loại chủng nấm men thuộc chi Kockovaella đến 105 lồi 3.2.3.6 Mơ tả lồi 106 3.3 Sự đa dạng nấm men sinh bào tử bắn Vườn quốc gia Cúc 107 Phương 3.4 Hoạt tính sinh học chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera 115 3.4.1 Khả sinh enzym ngoại bào 115 3.4.2 Khả đối kháng với vi sinh vật khiểm định 116 chủng nấm men 3.4.3 Các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp enzym ngoại 117 bào 3.4.3.1 Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp 117 3.4.3.2 Lựa chọn pH ni cấy thích hợp 118 3.4.3.3 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 119 xii 3.4.3.4 Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 121 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN 123 QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO 125 PHẦN PHỤ LỤC 137 Phụ lục Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử chủng 137 nấm men phân lập Phơ lơc HƯ thống ubiquinon chủng nấm 148 men nghiên cứu Phụ lục Mơ tả lồi chi Bullera 151 Phụ lục Mô tả loài cđa chi 189 Kockovaella Phụ lục Một số hình ảnh minh họa xiii 201 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Nấm men sinh bào tử bắn nhóm nấm men lớn, tồn tự nhiên, chiếm 14/90 chi nấm men với số lượng loài chiếm 1/10 tổng số loài nấm men biết (khoảng 80 lồi) Đây nhóm vi sinh vật phong phú, hữu thiên nhiên từ trước đến biết đến Là nhóm nấm men có tiềm sinh hàng loạt enzym nên cần phải nghiên cứu để phát enzym có tính Đây miền đất trống, nghiên cứu có khả phát nhiều lồi cho khoa học, góp phần bổ sung vào danh mục lồi giới Việt Nam nằm khu vực có khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Việt Nam đánh giá quốc gia có đa dạng sinh học phong phú Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng vi sinh vật thực bắt đầu, để góp phần vào cơng tìm kiếm nguồn gen mới, tiến hành thẩm định, tìm cách ứng dụng lưu giữ chúng cho hệ sau, thực đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ Vườn Quốc gia Cúc Phương” Mục đích đề tài - Tìm hiểu nấm men sinh bào tử bắn- nhóm vi sinh vật phong phú cư trú nhiều loại mà từ trước đến chưa biết đến Việt Nam- khởi nguồn cho nhánh nghiên cứu đa dạng sinh học - Tìm kiếm phát loài cho khoa học, bổ sung vào danh mục lồi giới - Bước đầu tìm hiểu khả sinh chất hoạt động sinh học (các loại enzym ngoại bào) nhóm nấm men Những đóng góp luận án: - Là cơng trình nghiên cứu đa dạng sinh học nấm men sinh bào tử bắn Việt Nam - Đã phát 16 loài quốc tế cơng nhận: 12 lồi thuộc chi Bullera loài thuộc chi Kockovaella Đưa địa danh Việt Nam vào danh mục lồi giới - Cơng trình tìm hiểu khả sinh chất hoạt động sinh học nhóm nấm men Bố cục luận án: Luận án bao gồm phần mở đầu, tổng quan, đối tượng phương pháp nghiên cứu, kết thảo luận, kết luận kiến nghị, danh mục công trình, tài liệu tham khảo, phụ lục Luận án có 25 bảng, 46 hình, 108 tài liệu tham khảo NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương TỔNG QUAN 1.1 Đa dạng sinh học đa dạng vi sinh vật 1.2 Đại cương nấm men 1.3 Ứng dụng nấm men đời sống 1.4 Các tiêu sử dụng phân loại nấm men 1.5 Nấm men sinh bào tử bắn Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng nấm men: Các chủng nấm men sinh bào tử bắn phân lập theo phương pháp Nakase Takashima (1993) Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố: Chủ yếu theo mơ tả Yarrow (1998) Khả đồng hoá nitơ xác định theo phương pháp Nakase Suzuki(1986) Vitamin đòi hỏi bắt buộc xác định theo Komagata Nakase (1967) Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách chiết, tinh xác định ubiquinon theo phương pháp Nakase Suzuki (1986) Xyloza tế bào phân tích sắc ký lớp mỏng sắc ký lỏng cao áp theo Nakase cộng (1976) Phân tích trật tự xây dựng phát sinh: Trình tự ADNr 18S, ITS bao gồm 5,8S D1/D2 26S xác định theo Takashima Nakase (1999), Kurtzman Robnnet (1997) Sử dụng chương trình computer CLUSTAL X ver 1.83 Thompson cộng (1994) Các trình tự tham khảo dùng nghiên cứu phát sinh chủng loại lấy từ liệu DDBJ, EMBL Gen Bank Cây phát sinh xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương pháp Saitou Nei (1987) Thí nghiệm lai ADN-ADN: Phân lập tinh ADN thực theo phương pháp Takashima Nakase (2000) Các thí nghiệm lai ADN-ADN genom thực theo phương pháp huỳnh quang Ezaki cộng (1989) VY-55 VY-65 VY-142 43.8 44.6 43.7 100 74.6 72.3 91.3 100 100 86.5 93.1 100 Nhóm C có ba chủng VY-48, VY-104 chủng chuẩn Cryptococcus luteolus JCM 3689 tiến hành lai ADN genom với Kết ghi bảng 3.10 cho thấy hai chủng VY-48 VY-104 có tỷ lệ ADN genom bắt cặp cao 95,2-100 %, giống kết tương đồng trình tự ITS D1/D2 Trái lại chúng có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với Cryptococcus luteolus, lồi khơng sinh bào tử bắn (24-35%) Có thể nhận định VY-48 VY-104 loài lồi Nhóm D Lai ADN genom thực chủng VY-63, VY118 chủng chuẩn B panici JCM 11819 Kết lai chủng khẳng định rõ VY-63 VY-118 loài khác hẳn với B panici có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp (13,1-16,5%) khác xa tỷ lệ G+C (8,3 %) VY-63 VY-118 loài (bảng 3.10) Nhóm E Chủng VY-68 chủng chuẩn B pseudoalba JCM 5290 lai ADN với Tỷ lệ bắt cặp ADN chúng thấp 12-14 % khẳng định VY-68 loài Bảng 3.10 Kết lai ADN genom chủng nấm men nghi ngờ lồi nhóm C, D E thuộc chi Bullera Tỷ lệ ADN bắt cặp (%) Chủng Tỷ lệ Nhóm C Nhóm D G+C (Mol%) VY48 VY104 JCM 3689 VY-48 59,1 100 95,2 24,6 VY-104 58,7 100 100 26,8 JCM 3689 59,5 35,8 32,5 100 VY-63 54,2 Nhóm E VY63 VY- JCM VY118 11819 68 100 98,6 15,9 JCM 5290 VY-118 54,7 100 100 16,5 JCM 11819 46,4 13,7 13,1 100 VY-68 54,0 100 14 JCM 5290 52,0 12 100 Mơ tả lồi Có 25/44 chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera xếp vào 12 loài Đại diện cho 12 chủng chuẩn là: VY-75, VY-5, VY-69, VY-50, VY-55, VY-86, VY-112, VY-48, VY-2, VY118, VY-128 VY-68 Các chủng chuẩn mô tả tiếng Latin tiếng Việt gồm đặc điểm hình thái, ni cấy: màu sắc, hình dạng, bề mặt khuẩn lạc; hình dạng, kích thước tế bào sinh dưỡng, bào tử chồi, bào tử bắn; tạo thành khuẩn ty thật khuẩn ty giả; đặc điểm sinh lý sinh hoá: khả lên men, khả đồng hoá 46 nguồn cacbon, khả đồng hoá nguồn nitơ, nhiệt độ giới hạn cao cho sinh trưởng, vitamin bắt buộc, chất tạo thành giống tinh bột, phản ứng mầu với xanh Diazoni B, phân giải urê, tách axít béo, hố lỏng gelatin, sinh trưởng mơi trường chứa 50% glucoza; đặc điểm hoá phân loại thành phần C+G ADN, hệ thống ubiquinon chủ yếu tồn xyloza tế bào Tên chủng chuẩn, nguồn gốc mã số nơi lưu giữ Việt Nam Nhật Bản 3.2.3 Vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Kockovaella Để xác định vị trí phân loại chủng phân lập thuộc chi Kockovaella, chúng tơi tiến hành đọc trình tự ADNr 18S, vùng ITS, 26S đoạn D1/D2 nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng nấm men Những chủng chưa xác định rõ vị trí phân loại tiến hành lai ADN genom Có chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Kockovaella: VY-61, VY-67, VY-125, VY-127 VY-137 Trình tự gần 1800 nucleotit ADNr 18S chủng nấm men xác định So sánh độ tương đồng với trình tự lồi có quan hệ họ hàng gần, chương trình Blast Cây phả hệ xây dựng dựa trình tự ADNr 18S chủng nghiên cứu với 26 loài thuộc chi Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Fibulobasidium, Filobasidiell, Kockovaella Trimorphomyces (Hình 3.6) Quan sát phả hệ, chủng nghiên cứu nằm gần với nhóm Fellomyces sichuanensis, F chinensis, F lichenicola K schimae 0.01 Filobasidiella neoformans_ AF356652 91 VY-61 99 VY-67 86 VY-137 81 VY-127 97 VY-125 79 Fellomyces sichuanensis_ AB032662 Kockovaella schimae_AB005482 88 Fellomyces chinensis_AB032660 75 Fellomyces lichenicola_ AB032661 69 Fellomyces distylii_AB001036 59 Fellomyces ogasawarensis_ AB001035 Fellomyces thailandicus_ AB044804 83 Kockovaella phaffii_AB005481 Kockovaella machilophila_ AB005479 87 Kockovaella barringtoniae_ AB052631 Kockovaella thailandica_ AB052559 51 Kockovaella imperatae_AB005561 94 67 62 Kockovaella sacchari_AB052560 Fellomyces fuzhouensis_ AB001032 89 100 Fellomyces_polyborus_D64117 Fellomyces borneensis_AB032659 82 Fellomyces horovitziae_ AB001033 Fibulobasidium inconspicuum_D25367 Cryptococcus laurentii_ AB032640 53 50 Cryptococcus flavescens_ AB085797 99 93 Cryptococcus aureus_AB085795 Bullera globospora_D31650 100 Cryptococcus dimennae_AB032627 Cryptococcus carnescens_ AB085798 95 Cryptococcus peneaus_AB085799 Hình 3.6 Vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Kockovaella với lồi có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr 18S Trình tự ADNr vùng ITS (bao gồm vùng 5,8S) chủng nấm men nghiên cứu xác định (515- 525 bp) Cây phả hệ xây dựng dựa trình tự ADNr vùng ITS chủng nghiên cứu với 25 loài thuộc chi Auriculibuller, Bullera, Bulleromyces, Calathella, Cryptococcus, Fellomyces Kockovaella Năm chủng nghiên cứu tạo thành nhánh khác biệt với loài biết So sánh trình tự ADNr vùng ITS thể rõ: chủng nghiên cứu sai khác 5-12/571 bp (0,9-2,1 %) sai khác với loài gần 35-54/571 bp (6,1-9,5 %) VY-61 sai khác với VY-67 VY- 125 bp (0,9 %), khác với VY-127 bp (1,4 %) khác với VY-137 10 bp (1,8 %) Hai chủng VY-67 VY-125 có trình tự ITS tương đồng, sai khác với VY-127 VY-137 bp (1,6 %) Chủng VY-127 sai khác với VY-137 12 bp (2,1 %) Từ kết xếp chủng nghiên cứu thuộc loài khác khác với loài biết Trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2 (600 bp) xác định Cây phả hệ xây dựng chủng nghiên cứu với 27 loài thuộc chi Auriculibuller, Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella Sterigmatosporidium Quan sát phát sinh chủng loại cho thấy chủng nghiên cứu nằm gần tách hẳn nhánh Kockovaella schimae So sánh trình tự ADNr đoạn D1/D2 khẳng định điều này: chủng nghiên cứu sai khác 2-5/591 bp (0,30,8 %), sai khác với Kockovaella schimae 3-5/591 bp (0,5-0,8 %) sai khác với lồi có quan hệ gần khác 6-12/591 bp (1,0-2,0 %) Từ kết phân tích trình tự ADNr 18S, vùng ITS D1/D2 26S chủng nấm men thuộc chi Kockovaella chưa thể khẳng định vị trí phân loại chúng Muốn biết chắn chúng có phải lồi khơng cần phải thực lai ADN genom Kết ghi bảng 3.14 cho thấy chủng VY-61 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với chủng nghiên cứu khác (15-35 %) thấp với lồi có quan hệ gần (2-22 %) Hai chủng VY-67 VY-125 có tỷ lệ bắt cặp với cao (84-93 %), thấp với loài nghiên cứu khác 28-47 %, thấp với lồi có quan hệ gần (3-30 %) Chủng VY-127 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với chủng nghiên cứu khác (15-47 %) thấp với lồi có quan hệ gần (2-39 %) Chủng VY-137 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với chủng nghiên cứu khác (25-47 %) thấp với lồi có quan hệ gần (21-26 %) Từ kết nghiên cứu khẳng định VY-67 VY-125 thuộc loài mới, VY-61, VY-127 VY-137 thuộc loài khác Bảng 3.14 Kết lai ADN genom chủng nghiên cứu thuộc chi Kockovaella với lồi có quan hệ họ hàng gần Loài Chủng VY-61 VY-67 VY-125 VY-127 VY-137 JCM10051 JCM 9862 JCM10164 JCM10165 JCM10166 Tỷ lệ ADN bắt cặp (%) Mol  G+C Kockovaella sp VY-61 53.2 100 ND 33 15 30 16 22 VY-67 53.6 ND 100 84 ND ND ND ND ND ND ND 53.6 35 93 100 28 44 9 30 54.1 33 ND 47 100 30 10 12 39 53.5 31 ND 47 25 100 8 14 52.8 16 ND 17 10 26 100 14 46 50.2 ND 100 10 42 54.8 ND 11 16 100 78 74 53.3 ND 34 100 86 54.3 ND 2 100 K schimae F distylii F chinensis F lichenicola F sichuanensis VY125 VY127 VY137 JCM 10051 JCM 9862 JCM 10164 JCM 10165 JCM 10166 ND, kh«ng cã sè liƯu Mơ tả lồi thuộc chi Kockovaella Có 5/5 chủng nấm men sinh bào thử bắn thuộc chi Kockovaella xếp vào loài Bốn chủng chuẩn đại diện cho loài là: VY-61, VY-125, VY-127 VY-137 Các chủng chuẩn mô tả tiếng La tinh tiếng Việt gồm đặc điểm hình thái, ni cấy; đặc điểm sinh lý sinh hoá; đặc điểm hoá phân loại; tên chủng chuẩn, nguồn gốc mã số nơi lưu giữ Việt Nam Nhật Bản 3.3 SỰ ĐA DẠNG CỦA NẤM MEN SINH BÀO TỬ BẮN Ở VƯỜN QUỐC GIA CÚC PHƯƠNG Từ 20 mẫu thu thập Vườn Quốc gia Cúc Phương, phân lập 151 chủng nấm men, có 121 chủng sinh bào tử bắn Các chủng nấm men sinh bào tử bắn phân lập 100% số mẫu thu thập chiếm 80,13 % số chủng phân lập Trong số 85 chủng lựa chọn để nghiên cứu, 44 chủng thuộc lớp Hymenomycetes gồm chi Bullera (39 chủng) Kockovaella (5 chủng) Có 39 chủng thuộc lớp Urediniomyces gồm chi Bannoa (5 chủng), Sporobolomyces (34 chủng) Hai chủng lại chi Tilletiopsis thuộc lớp Ustilaginomyces Trong luận án này, thực nghiên cứu sâu 44 chủng thuộc lớp Hymenomycetes cho thấy đa dạng loài phong phú Vườn Quốc gia Cúc Phương Số lượng chủng nấm men loài thuộc lớp Hymenomycetes mẫu thu thập Vườn Quốc gia Cúc Phương phong phú, chiếm 70,4 % số lượng chủng nghiên cứu Điển hình Mù u, (Calophyllum membranaceum) 4/6 chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc loài mới, Bời lời (Litsea euosma) Thăng mộc núi (Anadendrum montanum) 3/4 chủng thuộc lồi Lá Tình hoa đẹp (Eranthemum pulchellum) Shimastoglottis calyptrata chứa 3/3 chủng thuộc lồi Chỉ có mẫu (15%) khơng tìm thấy nấm men thuộc lớp Hymenomycetes mẫu (15%) khơng tìm thấy lồi Kết bảng 3.16 cho thấy số lượng loài phát phong phú Trong số 44 chủng thuộc lớp Hymenomycetes nghiên cứu, phân loại 21 loài, loài thuộc loài biết (23,8 %), cịn 16 lồi thuộc lồi (76,4%) Riêng chi Kockovaella có lồi số chủng nghiên cứu Có lồi đặt tên Bullera cuulongensis, B nhoquanica, B haininhensis, B ninhbinhensis, B hoabinhensis, Kockovaella litseae, K cucphuongensis, K vietnamensis, K calophilli công bố, số cịn lại cơng bố thời gian tới Bảng 3.16 Số lượng loài nấm men sinh bào tử bắn thuộc lớp Hymenomycetes phân lập Vườn Quốc gia Cúc Phương TT Loài 10 11 Bullera mrakii Bullera sp 1* Bullera sp 2* Bullera sp 3* B cuulongensis** B.pseudoschimicola B nhoquanica** B haininhensis** B ninhbinhensis** B oryzae B sinensis Số lượng chủng 5 3 Tỷ lệ (%) 11,4 11,4 6,8 4,5 2,3 11,4 6,8 6,8 2,3 4,5 2,3 TT 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Loài Bullera sp 4* Bullera sp 5* Bullera sp 6* Bullera sp 7* Bullera japonica B hoabinhensis** K litseae** K cucphuongensis** K vietnamensis** K calophilli** Tổng cộng Số lượng chủng 2 1 1 1 44 Tỷ lệ (%) 4,5 2,3 4,5 2,3 2,3 2,3 2,3 4,5 2,3 2,3 100 *Loài cơng bố thời gian tới **Lồi công bố luận án 3.4 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM MEN SINH BÀO TỬ BẮN THUỘC CHI BULLERA 3.4.1 Khả sinh enzym ngoại bào Ba mươi chín chủng nấm men sinh bào tử bắn nuôi môi trường YM dịch thể, pH 6, máy lắc 220 vòng/phút, 200C ngày Ly tâm thu dịch trong, nhỏ vào lỗ khoan môi trường chứa chất (Tinh bột, CMC, cazein, kitin, Tween 80), đặt tủ ấm 300C Sau 24 giờ, xác định vòng phân giải chất Kết ghi hình 3.9 cho thấy khả phân giải chất 39 chủng nấm men khác Trên chất tinh bột kitin, số chủng có hoạt tính enzym mạnh chiếm 15%, tỷ lệ lớn nấm men chủ yếu sử dụng đường cho sinh trưởng, khả sinh enzym ngoại bào Với chất CMC, số chủng có hoạt tính enzym mạnh chiếm 8% Trong Tween 80 cazein, số lượng chủng không sinh enzym phân giải chất chiếm 13 33 %, khơng có chủng có hoạt tính enzym mạnh Đa số chủng có hoạt tính enzym trung bình, đường kính vịng phân giải chất 10