Ứng dụng phương pháp pcr kỹ thuật số kết hợp tạo vi giọt (droplet digital pcr) trong phân tích đột biến gen phục vụ điều trị đích ung thư

GIẢI PHẪU BỆNH ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR KỸ THUẬT SỐ KẾT HỢP TẠO VI GIỌT (DROPLET DIGITAL PCR) TRONG PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN PHỤC VỤ ĐIỀU TRỊ ĐÍCH UNG THƯ TRẦN LÊ SƠN1,2, PHẠM THỊ HỒNG ANH1, TRẦN THANH TRƯỜNG1, TRẦN VŨ UYÊN1, ĐẶNG MAI ANH TUẤN3, ĐINH NGUYỄN THIÊN KIM4, PHAN VĂN HIẾU3, GIANG HOA1,2, NGUYỄN HOÀI NGHĨA5 TÓM TẮT Thuốc điều trị ung thư (UT) thuộc nhóm ức chế hoạt tính enzyme tyrosine kinase (tyrosine kinase inhibitor, TKI) cục quản lý thực phẩm dược phẩm Mỹ (FDA) phê duyệt cho điều trị UT phổi không tế bào nhỏ Nghiên cứu lâm sàng cho thấy bệnh nhân UT mang kiểu đột biến đặc trưng cho đáp ứng khác với hệ thuốc TKI khác sau thời gian điều trị biểu đột biến kháng thuốc Do đó, việc xác định kiểu đột biến đặc trưng quan trọng cho dự đoán đề liệu pháp điều trị trúng đích hiệu quả, đồng thời theo dõi đáp ứng bệnh nhân trình điều trị lâm sàng Sinh thiết mơ u phương pháp chuẩn vàng cho xác định đột biến gen Tuy nhiên, trở ngại lớn phương pháp xâm lấn khó tiến hành lấy mẫu nhiều lần nhiều trường hợp thu nhận đủ mơ u cho phân tích di truyền Gần phương pháp sinh thiết lỏng dựa việc phát DNA ngoại bào phóng thích từ tế bào ung thư (circulating tumor DNA, ctDNA) cho phép phân tích di truyền khối u Tuy nhiên tỉ lệ DNA phóng thích tế bào UT so với DNA loại tế bào khác thường thấp nên cần phương pháp có độ nhạy cao để phát đột biến với tần suất thấp Trong nghiên cứu này, xây dựng phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp với tạo vi giọt (digital droplet PCR, ddPCR) nhằm phân tích đột biến liên quan đến điều trị đích UT phổi gen EGFR từ mẫu sinh thiết lỏng (ctDNA) Phương pháp ddPCR xây dựng có ngưỡng phát đột biến tần suất 0.5-1% (nghĩa 5-10 phân tử DNA ung thư 10.000 phân tử DNA bình thường) Qui trình ddPCR sử dụng để phát đột biến mẫu sinh thiết lỏng mô u 43 bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ Phương pháp ddPCR cho kết tương đồng cao (87.5%) so sánh kết phân tích đột biến từ mẫu sinh thiết lỏng mô u tương ứng bệnh nhân Như vậy, ddPCR phương pháp có độ nhạy cao, đơn giản dễ dàng triển khai hỗ trợ trình điều trị UT lâm sàng ABSTRACT Detection of clinically actionable mutations in cancer liquid biopsies using droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) are a series of pharmaceutical drugs approved by the Food and Drug Administration (FDA) for treatment of many types of cancers including non-squamous cell lung cancer Clinical studies showed that patients with somatic mutations in certain cancer driver genes exhibit strong correlation with therapeutic efficacy to different types of TKIs and tend to acquire new mutations rendering resistance to previous TKI therapies Hence, the identification of such mutations is critically important for effective genotypedirected therapies and assessment of patients’ responses in clinical practice Tumor biopsy remains the gold standard for assessing genetic mutations in both lung and colorectal cancer However, it is not always feasible to obtain sufficient tumor tissue or perform repeat biopsy in these patients Recently, “liquid biopsy” which involves isolating cell free DNA released by cancer cells into the bloodstream (circulating tumor DNA, ctDNA) represents a noninvasive and potential technique for tumor genetic analysis Due to the relatively low Công ty giải pháp gene Viện di truyền Y học Trung tâm Pháp Y TP.HCM Bệnh viện Đa khoa Tân Hưng Đại học Y dược TP.HCM TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 229 GIẢI PHẪU BỆNH abundance of ctDNA in the peripheral circulation, a highly sensitive genotyping assay is required to detect such low frequency mutations In this study, we developed a novel digital droplet PCR (ddPCR) assays to identify clinically actionable mutations of a cancer driver gene, EGFR The limit of detection of our assays was 0.5-1% (5-10 target mutation DNA molecules in 10.000 wild type DNA molecules) These assays were further applied to evaluate the sensitivity and specificity for detection of mutations in both plasma and matched formalinfixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples of 43 non-small cell lung cancer patients Our results suggested that ddPCR based mutation detection assays are highly accurate and accessible platforms for directing and assisting targeted cancer therapy in clinical practice hay đột biến đoạn vùng exon19 (del19) gen mã hóa thụ thể tyrosine kinase EGFR cho đáp ứng tốt với nhóm TKI hệ I Iressa (Gefitinib) Tarceva (Erlotinib)[3] Tuy nhiên, sau thời gian điều trị (khoảng 1-2 năm), hầu hết bệnh nhân biểu đột biến kháng thuốc T790M gen EGFR[4] Nghiên cứu lâm sàng cho thấy trường hợp NSCLC mang đột biến T790M lại cho đáp ứng tốt với TKI hệ thứ ba AZD9291 (Osimertinib)[5] Như vậy, việc xác định đột biến UT có ý nghĩa quan trọng giúp dự đoán đáp ứng với thuốc đề phác đồ điều trị trúng đích thích hợp cho bệnh nhân ĐẶT VẤN ĐỀ Tyrosine kinase nhóm enzyme đóng vai trị quan trọng đường tín hiệu kiểm sốt chu trình phân bào chứng minh liên quan đến nhiều dạng ung thư[1] Hiện nay, nhóm gồm 37 chất ức chế hoạt tính enzyme (Tyrosine kinase inhibitor, TKI) FDA chấp thuận cho sử dụng cho điều trị UT lâm sàng[2] Tuy nhiên, hiệu điều trị nhóm thuốc định kiểu đột biến đặc trưng mà bệnh nhân biểu (Bảng 1) Chẳng hạn, nghiên cứu lâm sàng cho thấy bệnh nhân ung thư (UT) phổi không tế bào nhỏ (Non-small-cell lung carcinoma, NSCLC) mang đột biến thay amino acid thứ 858 (L858R) Bảng Các kiểu đột biến khảo sát tính đáp ứng với thuốc kháng UT Tính đáp ứng với thuốc Kí hiệu Kiểu đột biến TKI Thế Hệ I (erlotinib, gefitinib) del19 Mất đoạn Nucleotide thuộc vùng exon 19, gen EGFR + L858R Thay amino acid codon 858, exon 21, gen EGFR + T790M Thay amino acid codon 790, exon 20, gen EGFR - TKI Thế Hệ II (afatinib, dacomitinib, neratinib) TKI Thế Hệ III (Osimertinib) + + + (+): tăng đáp ứng với thuốc (-): giảm đáp ứng với thuốc Hiện sinh thiết mô u xem chuẩn vàng cho đánh giá di truyền phương pháp mang tính xâm lấn khó thực thu mẫu nhiều lần để theo dõi q trình điều trị[6] Ngồi ra, kết phân tích di truyền vị trí sinh thiết mơ u xác định khơng phản ảnh tính phức tạp đa dạng khối u, đặc biệt trường hợp u di căn[6] Gần đây, phương pháp sinh thiết lỏng thu nhận đoạn DNA tế bào UT phóng thích vào máu (ctDNA) trình chết theo chương trình tế bào (apoptosis) hoại tử (necrosis) phương pháp không xâm lấn chứng minh 230 hỗ trợ phân tích di truyền khối u[7] Tuy nhiên, để phát đột biến ctDNA cần phương pháp có độ nhạy cao hàm lượng ctDNA máu bệnh nhân tần suất đột biến thường thấp[8] Nhiều phương pháp phát triển để phát đột biến ctDNA phương pháp khuyếch đại chịu nhiệt (amplification refractory mutation system, ARMS), giải trình tự hệ (next-generation sequencing, NGS) PCR kỹ thuật số (digital PCR) Nhiều công bố gần cho thấy phương pháp ARMS NGS chưa đạt độ nhạy tốt việc phát đột biến có tần suất thấp [5,9] TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM GIẢI PHẪU BỆNH Phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp tạo vi giọt (droplet digital PCR, ddPCR) phát triển thương mại hoá từ năm 2011[8] Phương pháp cho phép phân tách phân tử DNA mẫu vào hàng chục nghìn giọt dầu phản ứng PCR diễn độc lập giọt riêng lẻ Kết xác định dựa tín hiệu phát huỳnh quang mẫu dò (probe) sau phản ứng PCR kết thúc [10] Nguyên lý cho phép ddPCR định lượng tuyệt đối xác đột biến có tần suất 1% [10] Ngoài ra, so với phương pháp giải trình tự hệ kế tiếp, ddPCR phát đột biến xác định với độ nhạy tốt có giá thành thấp hơn[10] Trong nghiên cứu xây dựng phản ứng ddPCR để phát đột biến gen EGFR xuất phổ biến trường hợp UT phổi có liên quan tính đáp ứng dạng UT với nhóm thuốc điều trị UT FDA cơng nhận Phương pháp đạt độ phát đột biến tần suất tối thiểu 0.5-0.1% (nghĩa 5-10 phân tử DNA ung thư 1,000 phân tử DNA bình thường) Đồng thời, hiệu phát đột biến phương pháp ưng dụng mẫu sinh thiết lỏng sinh thiết mô u đạt độ tương đồng cao 87.5% VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Máu sinh thiết mô u tương ứng 43 bệnh nhân UT phổi tế bào khơng nhỏ (kí hiệu LBL001LBL043) thu nhận bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Đại Học Y Dược Thủ Đức Các bệnh nhân chưa qua điều trị đồng ý tham gia nghiên cứu Mẫu sinh thiết mô u sau cố định formalin đúc nến paraffin (formalinfixed paraffin-embedded, FFPE) xác định đặc điểm mô bệnh học giai đoạn UT Trong số trường hợp mẫu sinh thiết nhỏ tiến hành tách DNA phân tích di truyền Máu ngoại biên (10ml) thu nhận ống EDTA Vacutainer (Becton Dickinson) giữ mát 4°C không trước tiến hành tách chiết DNA ngoại bào (cell free DNA, cfDNA) Phương pháp tách chiết DNA Từ mẫu máu: máu ly tâm li tâm đợt: 2.000 g 10 phút 16.000 g, 10 phút để tách huyết tương Bộ kit MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit (Thermo Fisher) sử dụng để tách cfDNA từ mẫu huyết tương Từ mẫu mô u FFPE: DNA gen tách chiết từ mẫu mô u cố định sử dụng kit TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN) theo hướng dẫn nhà sản xuất Phương pháp phân mảnh tạo DNA chứng dương Mẫu DNA chuẩn mang đột biến khảo sát với tần suất đột biến (MAF) xác định cung cấp Horizon Discovery (Bảng 2) Các mẫu chuẩn mang đột biến mẫu không mang đột biến (WT) phân mảnh ngẫu nhiên kit NEBNext® dsDNA Fragmentase® (New England BioLabs) nhằm tạo đoạn DNA kích thước tương tự cfDNA (~160bp) DNA sau phân mảnh có kích thước từ 100bp- 450bp chọn lọc hạt từ Kapa Pure Beads (Roche) Sau đó, DNA chuẩn DNA WT định lượng QuantiFluor® dsDNA System (Promega) trộn với để tạo mẫu DNA chứng dương có tần suất biến xác định Tổng lượng DNA đầu vào sử dụng tương tự hàm lượng trung bình DNA ngoại bào tách chiết từ bệnh nhân ung thư: 1.6ng Bảng Mẫu chuẩn mang đột biến Genomic DNA chuẩn (Horizon Discovery) Gene Đột biến Tần suất đột biến (%) Structural Control EGFR Del19: ΔE746 - A750 5.3 Tru- Q1 EGFR T790M 4.2 Tru- Q2 EGFR L858R 4.2 Phương pháp droplet digital PCR (ddPCR) Phương pháp ddPCR thực theo hướng dẫn hãng Bio-rad gồm giai đoạn chính[11]: Chuẩn bị mẫu: phản ứng PCR có tổng thể tích 20l gồm thành phần sau: DNA mẫu định lượng phương pháp Quantus (Promega), 900nM mồi 250nM mẫu dò, 2X supermix (Bio-rad) Đối với DNA tách chiết từ mẫu FFPE, phản ứng PCR bổ sung enzym cắt (2 units) giới hạn HindIII UDG (Uracil DNA glycosylase) (2 units), ủ 370C 20 phút Mồi mẫu dò cho phản ứng phát đột biến EGFR del19 cung cấp hãng Bio-rad Với đột biến EGFR T790M L858R, mồi mẫu thiết kế Tạo vi giọt: 20.000 vi giọt tạo hệ thống QX200 droplet genenator (Bio-rad) Phản ứng PCR: Vi giọt chuyển lên đĩa 96 giếng Phản ứng PCR tiến hành với chu trình nhiệt: 95°C 10 phút, 94°C 30 giây 231 GIẢI PHẪU BỆNH Đọc phân tích kết quả: Sau PCR, kết nhân vi giọt đọc hệ thống QX200 Droplet reader (Bio-Rad) đọc đồng thời màu huỳnh quang khác (FAM VIC HEX) Dữ liệu ddPCR phân tích phần mềm phân tích QuantaSoft (Bio-Rad) KẾT QUẢ Kết xác định ngưỡng phát đột biến (Limit of Detection, LOD) Các vị trí đột biến lựa chọn nghiên cứu đột biến xuất phổ biến gen gây UT EGFR có liên quan đến tính đáp ứng thuốc tế bào UT Để phát đột biến này, thiết kế phản ứng multiplex PCR: (1) phản ứng duplex với mẫu dò huỳnh quang khác đặc hiệu cho vị trí đột biến thay amino acid T790M (FAM) L858R (HEX); (2) phản ứng duplex (Bio-rad) với mẫu dò huỳnh quang (FAM) phát 15 kiểu đột biến đoạn vùng exon 19 (del19) mẫu dò huỳnh quang (HEX) đặc hiệu cho trình tự khơng mang đột biến (WT) L L MT 500 300 200 500 Sau thu hồi đoạn có kích thước tương tự ctDNA, chúng tơi tiến hành pha lỗng mẫu MT với mẫu WT để thu mẫu có phổ tần suất đột biến khác Các mẫu chạy với mẫu chứng âm mẫu có DNA WT (WT) mẫu khơng có DNA mẫu (No template control, NTC) Chứng âm sử dụng để kiểm soát khả ngoại nhiễm tính đặc hiệu mồi mẫu dò phản ứng ddPCR Kết phân tích tín hiệu huỳnh quang 10.000 vi giọt mẫu chứng âm (WT NTC) (Hình 2) khơng thấy xuất vi giọt có tín hiệu huỳnh quang mẫu dị đặc hiệu cho trình tự đột biến Ngược lại, tín hiệu huỳnh quang mẫu dò đột biến xuất mẫu chuẩn mang đột biến khảo sát có số lượng vi giọt dương tính giảm dần tần suất đột biến giảm Kết chứng tỏ mồi mẫu dò sử dụng phản ứng ddPCR đặc hiệu cho vị trí đột biến khảo sát Ở vị trí đột biến T790M, tần suất tối thiểu mà ddPCR phát vi giọt dương tính 1% (Hình 2a) Trong khi, phản ứng ddPCR phát vị trí đột biến cịn lại gồm L858R (Hình 2b) Del19 (Hình 2c) đạt tần suất tối thiểu 0.5% Như vậy, phản ứng ddPCR nghiên cứu đạt LOD 0.5-1%, nghĩa phát 5-10 DNA mang đột biến tổng số 1000 DNA phân tích a b EGFR T790M 75 4% 1% 0.5% EGFR L858R WT 300 200 75 Trước tiên, tiến hành xác định ngưỡng phát đột biến (LOD) phản ứng PCR LOD giá trị tần suất đột biến thấp mà phương pháp ddPCR cho phép phân biệt mẫu mang đột biến (Mutant, MT) với mẫu không mang đột biến (wild type, WT) Thông số cho phép đánh giá hiệu hoạt động mồi (primers), mẫu dò (probe) phản ứng ddPCR LOD xác định dựa mẫu chuẩn thương mại (Horizon) mang đột biến khảo sát có tần suất xác định (Bảng 2) Các mẫu chuẩn tiến hành phân mảnh để tạo đoạn DNA có kích thước tương tự ctDNA Kết điện di 232 1% 0.5% WT NTC Event number Event number c EGFR Del19 1% 0.5% WT 0.1% NTC EGFR Del19 Amplitude Hình Kết xử lý phân mảnh mẫu DNA không mang đột biến (WT) mẫu chuẩn DNA mang đột biến (MT) L: thang DNA 4% NTC EGFR T790M Amplitude WT (Hình 1) cho thấy sau xử lý phân mảnh, mẫu không mang đột biến (WT) mẫu chuẩn mang đột biến (MT) xuất vệt “smear” đoạn DNA bị đứt gãy, có đoạn có kích thước khoảng 160 bp, tương tự cfDNA EGFR L858R Amplitude 55°C 60 giây lặp lại 40 chu kỳ, 98°C 10 phút Event number Hình Kết xác định LOD phản ứng ddPCR đặc hiệu cho vị trí đột biến gen EGFR Sau xử lý phân mảnh, mẫu DNA chuẩn mang đột biến khảo sát gồm T790M (a), L858R (b) del19 (c) gen EGFR pha loãng với mẫu DNA không mang đột biến (WT) để đạt phổ tần suất đột biến 4%, 1%, 0,5% 0,1% 1,6ng DNA mẫu chuẩn sử dụng để xác định LOD Mẫu DNA WT mẫu DNA mẫu (NTC) sử dụng làm chứng âm Điểm bắt TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM GIẢI PHẪU BỆNH đầu phát tín hiệu huỳnh quang mẫu dò đột biến (Threshold, đường màu hồng) xác định phần mềm QuantaSoft (Bio-Rad) LOD tần suất đột biến thấp mà phản ứng ddPCR phát vi giọt mang tín hiệu huỳnh quang mẫu dị đột biến Kết ứng dụng ddPCR phát đột biến gen EGFR bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ Sau xác lập giá trị LOD phản ứng ddPCR, ứng dụng phương pháp để phân tích đột biến cfDNA thu từ mẫu sinh thiết lỏng 43 bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ Mẫu kết luận dương tính với đột biến khảo sát ddPCR xuất vi giọt có tín hiệu huỳnh quang mẫu dị đột biến có tần suất đột biến (MAF, mutation allelic frequency) lớn giá trị LOD xác định Trong số 43 mẫu, phát trường hợp (16.33%) mang đột biến khảo sát gen EGFR Trong đó, trường hợp mang đột biến L858R trường hợp mang đột biến del19 đột biến có đáp ứng tốt với TKI khơng có trường hợp mang đột biến kháng thuốc T790M phát Bảng Kết phát đột biến gen EGFR từ mẫu cfDNA DNA mô u (FFPE) phương pháp ddPCR MT: trình tự đột biến N/A: bệnh nhân không thu mẫu DNA mô u TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 233 GIẢI PHẪU BỆNH Ngồi ra, chúng tơi tiến hành thu nhận DNA từ mẫu mô u cố định paraffin (FFPE) bệnh nhận thực ddPCR để so sánh với kết phát đột biến mẫu sinh thiết lỏng Tuy nhiên, điều kiện bệnh lý bệnh nhân nên số trường hợp thu đủ mẫu sinh thiết mơ u cho phân tích di truyền Do đó, tiến hành so sánh kết 32 trường hợp có mẫu cfDNA DNA mơ u Bảng cho thấy ddPCR cho kết phát đột biến gen EGFR có mức tương đồng cao 87.5% (28/32) cfDNA thu từ máu mẫu DNA thu nhận từ mô u tương ứng bệnh nhân Trong đó, đột biến L858R phát cfDNA DNA mô u bệnh nhân LBL015 LBL017 Đặc biệt, mẫu LBL015 mang đột biến L858R tần suất cao cfDNA DNA mô u 46.25% 38.99% Kết cho thấy bệnh nhân mang đột biến L858R dạng đột biến di truyền (germline mutation) Trong trường hợp có kết không tương quan (LBL021, LBL026, LBL030 LBL033), ddPCR phát đột biến del19 DNA mô u cho kết âm tính mẫu cfDNA tương ứng bệnh nhân Tóm lại, phản ứng ddPCR chúng tơi xây dựng xác định kiểu đột biến gen EGFR có liên quan đến đáp ứng thuốc bệnh nhân ung thư phổi từ nguồn mẫu sinh thiết lỏng đạt độ tương đồng cao (87.5%) so sánh với kết mẫu sinh thiết mô u KẾT LUẬN VÀ BIỆN LUẬN Đột biến gen EGFR xuất phổ biến bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ (35%) liên quan đến tính đáp ứng bệnh nhân với thuốc điều trị UT công nhận FDA[2] Hiện nay, việc xác định đột biến tiến hành chủ yếu nguồn DNA thu nhận phương pháp sinh thiết mô u Phương pháp mang tính xâm lấn nên khơng thể tiến hành lấy mẫu lặp lại để theo dõi đáp ứng bệnh nhân trước sau điều trị nhiều trường hợp khơng đủ mẫu để phân tích di truyền [6] Hơn việc lấy mẫu sinh thiết vị trí xác định khơng phản ảnh tính đa dạng phức tạp khối u[6] Trong nghiên cứu này, phát triển phương pháp ddPCR có độ nhạy phát đột biến tần suất tối thiểu 0.5% (ngoại trừ đột biến T790M phát LOD 1%) Hiện nay, thử nghiệm thương mại Cobas (Roche) FDA công nhận cho lưu hành dựa nguyên lý phản ứng PCR thơng thường phát đột biến del19 L858R LOD 5%[6] Như vậy, so với 234 kit phương pháp ddPCR phát triển có độ nhạy 10 lần Đồng thời, nghiên cứu này, chứng minh phương pháp ddPCR ứng dụng lâm sàng để phát đột biến ctDNA từ mẫu sinh thiết lỏng bệnh nhân UT phổi với độ tương đồng cao (87.5%) so sánh với kết phát đột biến mẫu DNA mô u Các trường hợp cho kết không tương quan ctDNA DNA mơ u 1) tế bào ung thư phóng thích ctDNA khối u vị trí mà DNA ngoại bào khó phóng thích vào máu ngoại vị tỉ lệ ctDNA mang đột biến thấp ngưỡng phát phương pháp 2) sinh thiết mơ u vị trí khơng có dịng tế bào UT mang đột biến Những nghiên cứu lâm sàng với số lượng mẫu lớn trước (AURA AURA3) cho thấy với mẫu cfDNA có tần suất đột biến >1% phương pháp ddPCR đạt độ nhạy phát 97% mức âm tính giả chấp nhận 3%[12] Vì vậy, Hiệp Hội Ung Thư Hoa Kỳ (ASCO) khuyến cáo kết phát đột biến cfDNA dương tính cho phép kết luận bệnh nhân mang đột biến khảo sát Tuy nhiên, giới hạn độ nhạy phương pháp sử dụng nên trường hợp kết âm tính cfDNA thi ASCO khuyến cáo cần phải tiến hành phân tích đột biến mẫu mơ u để đưa kết luận xác[12] Tóm lại, với độ nhạy tốt việc phân tích kết khơng q phức tạp, ddPCR phương pháp triển khai phát số đột biến gen xác định nhằm hỗ trợ điều trị ung thư lâm sàng Đặc biệt, phương pháp có ý nghĩa lớn trường hợp bệnh nhân ung thư di qua phẫu thuật mà sinh thiết mô u thực TÀI LIỆU THAM KHẢO Schlessinger J Cell signaling by receptor tyrosine kinases Cell 2000; 103: 211-25 Bhullar KS, Lagaron NO, McGowan EM, Parmar I, Jha A, Hubbard BP, et al Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions Molecular cancer 2018; 17: 48 Douillard JY, Ostoros G, Cobo M, Ciuleanu T, McCormack R, Webster A, et al First-line gefitinib in Caucasian EGFR mutation-positive NSCLC patients: a phase-IV, open-label, singlearm study British journal of cancer 2014; 110: 55-62 Yu HA, Arcila ME, Rekhtman N, Sima CS, Zakowski MF, Pao W, et al Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFRmutant lung cancers Clinical cancer research: TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM GIẢI PHẪU BỆNH an official journal of the American Association for Cancer Research 2013; 19: 2240-7 throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number Analytical chemistry 2011; 83: 8604-10 Gu J, Zang W, Liu B, Li L, Huang L, Li S, et al Evaluation of digital PCR for detecting low-level EGFR mutations in advanced lung adenocarcinoma patients: a cross-platform comparison study Oncotarget 2017; 8: 6781020 Feng WN, Gu WQ, Zhao N, Pan YM, Luo W, Zhang H, et al Comparison of the SuperARMS and Droplet Digital PCR for Detecting EGFR Mutation in ctDNA From NSCLC Patients Translational oncology 2018; 11: 542-5 Kim SS, Choi HJ, Kim JJ, Kim MS, Lee IS, Byun B, et al Droplet digital PCR-based EGFR mutation detection with an internal quality control index to determine the quality of DNA Scientific reports 2018; 8: 543 10 Taylor SC, Laperriere G, Germain H Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data Scientific reports 2017; 7: 2409 Crowley E, Di Nicolantonio F, Loupakis F, Bardelli A Liquid biopsy: monitoring cancergenetics in the blood Nature reviews Clinical oncology 2013; 10: 472-84 11 Bio-Rad Laboratories I Rare Mutation Detection Best Practices Guidelines 12 Meador C, Hu Y, Yang JC-H, Mok T, Laus G, Hovey T, et al Hindson BJ, Ness KD, Masquelier DA, Belgrader P, Heredia NJ, Makarewicz AJ, et al High- TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 235 ... Phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp tạo vi giọt (droplet digital PCR, ddPCR) phát triển thư? ?ng mại hoá từ năm 2011[8] Phương pháp cho phép phân tách phân tử DNA mẫu vào hàng chục nghìn giọt dầu... phân tích đột biến mẫu mơ u để đưa kết luận xác[12] Tóm lại, với độ nhạy tốt vi? ??c phân tích kết khơng q phức tạp, ddPCR phương pháp triển khai phát số đột biến gen xác định nhằm hỗ trợ điều trị. .. trường hợp (16.33%) mang đột biến khảo sát gen EGFR Trong đó, trường hợp mang đột biến L858R trường hợp mang đột biến del19 đột biến có đáp ứng tốt với TKI khơng có trường hợp mang đột biến kháng