XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯƠNG THỊ VÂN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯƠNG THỊ VÂN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ : 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh - Bộ mơn Hóa phân tích - Trường đại học Dược Hà Nội, người tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tới DS Lê Xuân Kỳ, cán Phòng phân tích kiểm nghiệm - Viện cơng nghệ dược phẩm quốc gia, thầy cô cán kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa phân tích- Trường đại học Dược Hà Nội, người giúp đỡ để tơi tiến hành đề tài với kết xác, kịp thời Tơi xin chân thành cảm ơn Quỹ phát triển khoa học công nghệ Quốc gia Bộ Khoa học Công nghệ tài trợ giúp tơi hồn thành luận văn khn khổ đề tài số 105.08-2014.24 theo định số 122/QĐ-HĐQL-NAFOSTED Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội tạo điều kiện cho tham gia học tập hoàn thành luận văn thời hạn quy định Tơi xin gửi lòng biết ơn tới toàn thể anh chị em đồng nghiệp Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội động viên, giúp đỡ chia sẻ với khó khăn cơng việc Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ động viên tơi suốt q trình học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 31 tháng năm 2015 Học viên Dương Thị Vân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………… Chƣơng 1: TỔNG QUAN…………………………………………………….3 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu……………………………………3 1.1.1 Công thức cấu tạo, phân loại phổ tác dụng…………………… 1.1.2 Đặc tính β-lactam nghiên cứu…………………………….5 1.2 Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu……………………………… 1.2.1 Phương pháp chiết pha rắn (SPE)…………………………………7 1.2.2 Sắc ký lỏng khối phổ……………………………………………….9 1.3 Một số nghiên cứu dƣ lƣợng thuốc kháng sinh có nƣớc Việt Nam giới……………………………………………………….14 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 18 2.1 Đối tƣợng phƣơng tiện nghiên cứu……………………………… 18 2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn…………………………………………….18 2.1.2 Máy móc - trang thiết bị………………………………………… 19 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu…………………………………………….20 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………… 20 2.2.1 Phương pháp thu thập xử lý mẫu thô trước tiến hành chiết tách……………………………………………………………………….20 2.2.2 Phương pháp chiết tách β-lactam từ nước thải………………….20 2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng LCMS/MS……………20 2.2.4 Thẩm định quy trình phân tích xây dựng…………………… 21 2.2.5 Lấy mẫu, phân tích số β-lactam thực tế……………… 21 2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu……………………………………………22 i Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………… 23 3.1 Xây dựng phƣơng pháp phân tích đồng thời kháng sinh β-lactam nƣớc thải công nghiệp dƣợc…………………………………………23 3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện khối phổ…………………….23 3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện xử lý mẫu…………………………33 3.2 Thẩm định quy trình phân tích kháng sinh β-lactam nƣớc thải nhà máy dƣợc phẩm………………………………………………….38 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống………………………………………… 38 3.2.2 Độ đặc hiệu…………………………………………………… 39 3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng……………………… 41 3.2.4 Độ tuyến tính khoảng xác định……………………………… 43 3.2.5 Độ độ lặp lại…………………………………………….45 3.3 Áp dụng quy trình xây dựng đƣợc để xác định dƣ lƣợng kháng sinh β-lactam nghiên cứu mẫu nƣớc thải từ sở sản xuất dƣợc……… 46 Chƣơng 4: BÀN LUẬN…………………………………………………… 49 4.1 Về lựa chọn kháng sinh nghiên cứu…………………………………49 4.2 Về phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ…………… 49 4.3 Về kết thẩm định phƣơng pháp…………………………………51 4.4 Về dƣ lƣợng kháng sinh nƣớc thải nhà máy sản xuất dƣợc phẩm……………………………………………………………………….52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A6AP Acid 6-amino penicillanic A7AC Acid 7-aminocephalosporanic AOAC Hiệp hội nhà hóa phân tích thống (Association of Official Analytical Chemists) APCI Ion hóa hóa học áp suất khí CE Năng lƣợng bắn phá (Collision energy) CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử ESI Ion hóa phun điện tử HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) IS Chất chuẩn nội (internal standard) KS Kháng sinh LCMS/MS Sắc ký lỏng khối phổ khối phổ (Liquid chromatography-mass spectrometry) MRM/SRM Chế độ thu tín hiệu chọn lọc ion hai lần MS/MS Khối phổ hai lần MW Khối lƣợng phân tử SCAN Chế độ thu tín hiệu tồn phổ SIM Chế độ thu tín hiệu chọn lọc ion SPE Chiết pha rắn (Solid phase extraction) tR Thời gian lƣu Spic Diện tích pic iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phổ tác dụng β-lactam nghiên cứu Bảng 1.2 Đặc tính β-lactam nghiên cứu Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng nghiên cứu Bảng 3.1 Các điều kiện khối phổ để phân tích kháng sinh nghiên cứu Bảng 3.2 Các thơng số hoạt động nguồn ion hóa Bảng 3.3 Điều kiện khảo sát pha động kết Bảng 3.4 Hiệu suất chiết SPE kháng sinh Bảng 3.5 Tổng hợp điều kiện phân tích xử lý mẫu kháng sinh nghiên cứu Bảng 3.6 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống LCMS/MS Bảng 3.7 Kết xác định LOD LOQ kháng sinh Bảng 3.8 Kết đánh giá độ tuyến tính kháng sinh nghiên cứu Bảng 3.9 Kết đánh giá độ phƣơng pháp Bảng 3.10 Kết phân tích xác định nồng độ kháng sinh mẫu thử iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức chung Penicilin Hình 1.2 Cơng thức chung cephalosporin Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Hình 3.1 Phổ đồ kháng sinh điều kiện nghiên cứu Hình 3.2 Sắc ký đồ kháng sinh β-lactam khảo sát cột Hình 3.3 Sắc ký đồ kháng sinh β-lactam khảo sát chƣơng trình pha động Hình 3.4 Sắc ký đồ kháng sinh β-lactam khảo sát tốc độ dòng pha động Hình 3.5 Sắc ký đồ kháng sinh β-lactam khảo sát thể tích tiêm Hình 3.6 Độ thu hồi kháng sinh β-lactam sử dụng với dung mơi rửa giải khác Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu tự tạo thể tích 100ml (a) 200ml (b) Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn mẫu chuẩn kháng sinh nghiên cứu Hình 3.9 Sắc ký đồ kháng sinh phân tích nồng độ LOQ v ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng kháng sinh vấn đề đƣợc nhiều ngƣời quan tâm thực trạng mà xã hội phải đối mặt Có nhiều nguyên nhân gây tình trạng lý tồn dƣ kháng sinh chất chuyển hóa chúng mơi trƣờng Vì lƣợng nhỏ kháng sinh có mặt mơi trƣờng sống giúp vi khuẩn sinh gen kháng thuốc Hƣớng nghiên cứu dƣ lƣợng thuốc kháng sinh chất chuyển hoá nhƣ tác động chúng môi trƣờng đƣợc năm cuối thập kỉ 90 kỷ 20 đƣợc quan tâm nƣớc phát triển Nhiều nghiên cứu cho thấy tồn kháng sinh đề kháng kháng sinh môi trƣờng nƣớc trở nên phổ biến [8], [28] Cùng với việc kiểm soát sử dụng kháng sinh hợp lý, vấn đề kiểm soát nồng độ kháng sinh thải môi trƣờng sở sản xuất dƣợc phẩm cần đƣợc quan tâm Hiện nƣớc có khoảng gần 200 doanh nghiệp có sản xuất dƣợc phẩm với nhiều sản phẩm thuốc với đủ chủng loại: kháng sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ vitamin… Trong đó, kháng sinh nhóm β-lactam đa dạng có phổ kháng khuẩn rộng vi khuẩn Gram (-) Gram (+), đƣợc định rộng rãi việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn nƣớc ta Theo thống kê Cục quản lý dƣợc, từ tháng năm 2010 đến tháng năm 2015, nƣớc có khoảng 1000 số đăng ký kháng sinh β-lactam với khoảng 50 nhà máy sản xuất [7] Các chế phẩm kháng sinh β-lactam đƣợc sản xuất nƣớc ta có nhiều dạng bào chế khác nhƣ: thuốc tiêm, viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch uống… Có thể nói, nhóm kháng sinh đƣợc sản xuất với số lƣợng đa dạng nƣớc ta Các nhà máy sản xuất kháng sinh đạt tiêu chuẩn GMP có quy trình, hệ thống xử lý nƣớc thải Kết phân tích mẫu thu thập cho thấy có mặt hầu hết kháng sinh mà sở có sản xuất nƣớc thải nhà máy Nồng độ kháng sinh dao động khoảng rộng từ 0,1 đến 8,0 µg/L mẫu nƣớc thải sau xử lý Nhƣ vậy, qua q trình xử lý trƣớc thải mơi trƣờng nhƣng thấy tồn lƣợng định kháng sinh nƣớc thải sau xử lý Nồng độ kháng sinh phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: sản lƣợng nhà máy, quy trình xử lý nƣớc thải sau sản xuất độ bền kháng sinh mơi trƣờng Vì vậy, việc xử lý kiểm soát nồng độ kháng sinh nƣớc thải vấn đề nên đƣợc quan tâm Do số lƣợng mẫu phân tích chƣa nhiều, chƣa thể tổng hợp đƣợc khoảng nồng độ toàn kháng sinh nghiên cứu mẫu nƣớc thải nhà máy sản xuất dƣợc phẩm Việt Nam Chúng tiến hành bổ sung lƣợng mẫu đủ để thống kê nghiên cứu Theo số tài liệu tham khảo, môi trƣờng nƣớc tránh ánh sáng, nửa đời phân hủy β-lactam dao động khoảng 2,7 – 18,7 ngày Tuy nhiên, thời gian giảm đáng kể có tác động ánh sáng: từ 2,2 – 5,0 ngày [18] Vì vậy, có mặt nồng độ kháng sinh nghiên cứu phụ thuộc nhiều vào tính chất kháng sinh thời điểm lấy mẫu 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua trình thực đề tài, thu đƣợc kết luận nhƣ sau: Đã xây dựng đƣợc quy trình định lƣợng đồng thời kháng sinh nhóm β-lactam nƣớc thải nhà máy sản xuất dƣợc LC-MSMS Cụ thể là: - Chuẩn nội đƣợc lựa chọn đồng vị Trimethoprim 13C3 Chuẩn nội đảo bảo tính đặc hiệu khơng bị ảnh hƣởng mẫu Các mảnh ion IS: 294,0 m/z → 233,1 m/z - Đã khảo sát xây dựng đƣợc qui trình xử lý mẫu chiết pha rắn SPE sử dung cột Oasis HLB cụ thể nhƣ sau: Hoạt hóa cột ml MeOH ml dung dịch hỗn hợp methanol - nƣớc (1 : 1), ml nƣớc acid hóa đến pH 2, dùng 100ml mẫu ban đầu đƣa lên cột chiết, rửa ml nƣớc rửa giải 10 ml MeOH Qui trình xử lý có hiệu suất thu hồi cao (từ 40,0% - 116,0%) - Đã xác định đƣợc điều kiện sắc ký lỏng pha đảo sử dụng cột Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (150mm x 3mm; 3,5 µm), pha động theo chƣơng trình gradient với hai kênh acid formic 0,1% acetonitril acid formic 0,1% nƣớc, tốc độ dòng 0,5ml/phút thể tích tiêm 10 µl để phân tách kháng sinh nghiên cứu Tổng thời gian phân tích phút - Đã xác định đƣợc điều kiện MS phù hợp để phân tích đồng thời kháng sinh cefotaxim, cephalexin, cefixim, cefaclor, cefadroxil amoxicilin với 54 kỹ thuật ESI chế độ ion dƣơng, kháng sinh đƣợc xác định ion mẹ hai ion (IP = 4) - Các kháng sinh nghiên cứu đƣợc định tính thời gian lƣu có mặt ion mẹ hai ion đƣợc định lƣợng dựa tín hiệu diện tích ion lớn ổn định (ion 1) Các ion đƣợc lựa chọn chất nhƣ sau: Ion mẹ (m/z) Ion (m/z) Ion (m/z) Cefotaxim 456,1 Cefixim Cefaclor 454,0 368,1 Amoxicilin Cefadroxil 366,1 364,1 Cephalexin 348,0 167,1 284,9 174,0 113,8 113,9 157,9 396,2 125,9 191,0 348,9 207,9 139,9 Đã thẩm định đƣợc phƣơng pháp xác định kháng sinh nhóm βlactam nƣớc thải nhà máy sản xuất dƣợc LC-MSMS Kết cho thấy phƣơng pháp chọn có độ đặc hiệu cao; định tính định lƣợng đƣợc đồng thời kháng sinh nhóm β-lactam nƣớc thải với LOD thấp (từ 0,1 đến 1,5 ng/ml); có tƣơng quan tuyến tính tín hiệu nồng độ chất phân tích với r ≥ 0,997 Phƣơng pháp xây dựng có độ lặp lại cao (RSD < 9%) độ thu hồi từ 80% đến 110% mức nồng độ, đáp ứng yêu cầu Châu Âu Đã bƣớc đầu phát có mặt xác định nồng độ kháng sinh nghiên cứu mẫu nƣớc thải số nhà máy sản xuất dƣợc địa bàn Hà Nội Kết có mặt kháng sinh phù hợp với tình hình sản suất thực tế sở thu thập mẫu Có 6/9 mẫu xác định đƣợc kháng sinh nghiên cứu Khoảng nồng độ kháng sinh nghiên cứu có mẫu dao động khoảng rộng (từ 0,1 đến 8,0 µg/L nƣớc thải sau qua hệ thống xử lý sở sản xuất) 55 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục tiến hành phân tích mẫu thực tế với số lƣợng lớn để đánh giá đƣợc tồn diện nồng độ kháng sinh tồn dƣ nƣớc thải nhà máy dƣợc phẩm - Nghiên cứu mở rộng phạm vi áp dụng phƣơng pháp mẫu nƣớc thải có nguy tồn dƣ kháng sinh khác nhƣ: nƣớc thải nhà máy sản xuất thuốc thú y, nƣớc thải nuôi trồng, nƣớc thải bệnh viện… 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất y học, Tr 84-110 Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất y học Dương Hồng Anh (2006), Phân tích đánh giá có mặt kháng sinh họ floquinilon nước thải bệnh viện, Đề tài nghiên cứu khoa học Trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội Bộ tài nguyên môi trường (2011), Thông tư quy định quy chuẩn kỹ thuật quốc gia môi trường Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, nhà xuất Y học Bộ y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, nhà xuất Y học Cục quản lý Dược (2015), Danh mục thuốc cấp số đăng ký từ tháng năm 2010 đến tháng năm 2015 GARP - Việt Nam (2010), Phân tích thực trạng: sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam Trần Đức Hậu (2007), Hóa dược tập 2, nhà xuất Y học, tr 118-133 10.Trần Thị Thanh Huế (2013), Xây dựng phương pháp xác định dư lượng Cefixim có nước thải từ sở sản xuất Dược HPLC, luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội 11.Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lí học tập 2, NXB Y học, tr 142-153 12.Nguyễn Văn Thuận (2014), Nghiên cứu xác định dư lượng số Cephalosporin nước thải nhà máy dược phẩm phương pháp LC-MS/MS, luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội Tiếng Anh 13 AOAC International (2012), Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements, Official Method of Analysis of AOAC International, 19th edition, AOAC, USA 14 British pharmacopoeia 2013 15 Martindale - The Complete Drug Reference (36th Edition) P 223, p227 16 Chryssa Bouki, Danae Venieri, Evan Diamadopoulos (2013), Detection and fate of antibiotic resistant bacteria in wastewater treatment plants: A review, Ecotoxicology and Environmental Safety, Volume 91, p 1-9 17 Carolina Quesada-Molina, Monsalud del Olmo-Iruelaand Ana M García-Campa (2012), Analysis of cephalosporin residues in environmental waters by capillary zone electrophoresis with off-line and on-line preconcentration, Analytical Methods, p 2341-2347 18 Chuanwu Xi1,Yongli Zhang1,Carl F Marrs, Wen Ye, Carl Simon, Betsy Foxman, Jerome Nriagu (2009), Prevalence of Antibiotic Resistance in Drinking Water Treatment and Distribution Systems, Applied and Environmental Microbiology, p 5714-5718 19 Dennis McQuillan, Scott Hopkins (2002), Drug Residues in Ambient Water: Initial Surveillance in NewMexico, USA, Presented at the 7th Annual New Mexico Environmental Health Conference 20 EPA Method 1694 (2007), Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water, Soil, Sediment, and Biosolids by HPLC/MS/MS, Washington, USA 21 European Union (2002), Commission decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results 22 Hoang Thi Thanh Thuy, Tuan Dinh Nguyen (2013), The potential environmental risks of pharmaceuticals in Vietnamese aquatic systems: case study of antibiotics and synthetic hormones, Environ Sci Pollut Res, 20 p 8132 - 8140 23 J.M Cha, S Yang, K.H Carlson (2006), Trace determination of βlactam antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1115 46–57 24 Megha Sharma, Bo Eriksson, Gaetano Marrone, Surya Prakash Dhaneria and Cecilia Stålsby Lundborg (2012), Antibiotic prescribing in two private sector hospitals; one teaching and one non-teaching: A cross-sectional study in Ujjain, India, Sharma et al BMC Infectious Diseases 2012, 12:155 25 Tran Thi Hue, Doan Cao Sơn, Nguyen Thi Lan Anh, Nguyen Thi Kieu Anh (2014), A simple and Rapid Method to Measure Residue of Cefixim - a Cephalosporin Antibiotic in the Wastewater of Pharmaceutical Production Plant, J Fac Agr, Kyushu Univ, 59, p 169 - 175 26 Tu Binh Minh, Ho Wing Leung, I Ha Loi, Wing Hei Chan, Man Ka So, J.Q Mao, David Choi, James C.W Lam, Gene Zheng, Michael Martin, Joseph H.W Lee, Paul K.S Lam, Bruce J Richardson (2009), Antibiotics in the Hong Kong metropolitan area: Ubiquitous distribution and fate in Victoria Harbour, Marine Pollution Bulletin 58 1052–1062 27 Vishal Diwan, Ashok J Tamhankar, Rakesh K Khandal, Shanta Sen, Manjeet Aggarwal, Yogyata Marothi, Rama V Iyer, Karin SundbladTonderski, Cecilia Stålsby- Lundborg (2010), Antibiotics and antibiotic-resistant bacteria in waters associated with a hospital in Ujjain, India, BMC Public Health, doi: 10.1186/1471-2458-10-414 28 WHO (2014), Antimicrobial resistance: global report on surveillance, France 29 Xu Haomin Ph.D (2010), Photochemical Fate of Pharmaceuticals in Natural Waters, University of California, Irvine 30 United States pharmacopoeia 34 - NF 29 Phụ lục Sắc ký đồ cefotaxim va cefixim với thời gian rửa giải gần Cefotaxim cC Cefixim IS Phụ lục Sắc ký đồ dung dịch thêm chuẩn nồng độ ng/ml Phụ lục Sắc ký đồ độ nồng độ 15ng/ml Cefotaxim cC Cefixim cC Cefaclor cC Amoxicilin cC Cefadroxil cC Cephalexin cC IS cC Phụ lục Sắc ký đồ số mẫu nước thải Mẫu 2S Mẫu 4T1 Mẫu 5S2 Mẫu 3S ... nhiên, việc sử dụng chuẩn nội Terbutalin có nhƣợc điểm dẫn tới sai số chất chuẩn nội tồn mẫu thực (khi sở sản xuất hoạt chất này) [12] Một nghiên cứu Dennis McQuellan cộng (2002) New Mexico phát... hydrocloric AR Trung Quốc 13 Triethylamin PA Merck - Đức 15 Natri edetat PA Merck - Đức 16 Nƣớc cất Tinh khi t 2.1.2 Máy móc - trang thiết bị - Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Triple Quad LC/MS 6460 (Mỹ)