Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Việt Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalypt[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Việt Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Việt Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: TS Trần Hồ Quang Hƣớng dẫn 2: TS Lê Sơn Hà Nội - 2021 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan nội dung luận văn kết nghiên cứu thân dƣới hƣớng dẫn TS Trần Hồ Quang TS Lê Sơn Mọi kết nghiên cứu nhƣ ý tƣởng tác giả khác (nếu có) đƣợc trích dẫn cụ thể Đề tài luận văn chƣa đƣợc bảo vệ hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nhƣ chƣa đƣợc công bố phƣơng tiện Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Việt Hà Lời cảm ơn Tôi xin cảm ơn Học viện Khoa học Cơng nghệ, phịng Đào tạo, thầy giáo, cô giáo Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình học tập trƣờng Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Giống Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, tồn thể cán Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hƣớng dẫn, TS Trần Hồ Quang (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) TS Lê Sơn (Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Luận văn đƣợc sử dụng phần số liệu kết từ đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ (giai đoạn 2)” ThS Trần Đức Vƣợng làm chủ nhiệm, thuộc Chƣơng trình trọng điểm phát triển ứng dụng Công nghệ sinh học Nông nghiệp Phát triển nông thôn đến 2020 mà Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp đơn vị thực Xin chân thành cám ơn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên khích lệ tơi suốt thời gian học tập thực đề tài Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Việt Hà Danh mục ký hiệu chữ viết tắt STT Từ viết tắt Viết đầy đủ AS Acetosyringone BAP CNSH ĐC ĐHST Điều hòa sinh trƣởng ADN Acid Deoxyribonucleic IBA Indole-3-Butyric Acid IFTIB Km Kanamycin 10 LB Môi trƣờng nuôi cấy Luria and Betani 11 MS Môi trƣờng nuôi cấy Murashige & Skoog 12 NAA 13 OD Mật độ quang học (Optical Density) 14 PCR Phản ứng trùng hợp chuỗi (Polymerase Chain Reaction) 6-Benzyl Amino Purine Công nghệ sinh học Đối chứng Institute of Forest Tree Improvement and Biotechnology 1-Naphthyl Acetic Acid Danh mục bảng Bảng 1.1 Các lồi bạch đàn đƣợc nghiên cứu chuyển gen thơng qua vi khuẩn A tumefaciens 27 Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 40 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 40 Bảng 2.3 Chu trình phản ứng PCR 40 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin 42 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ Kanamycin đến khả rễ 44 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng tuổi vật liệu đến mẫu tạo mô sẹo 45 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 47 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn đến tỷ lệ chồi tái sinh 49 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ tạo mô sẹo 50 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 52 Bảng 3.8 Khả sống sót chồi chuyển gen sau lần chọn lọc 56 Bảng 3.9 Kết kiểm tra khả rễ chồi chuyển gen sau lần chọn lọc 59 Bảng 3.10 So sánh hình thái thân chuyển gen với đối chứng 60 Bảng 3.11 So sánh hình thái chuyển gen đối chứng 61 Bảng 3.12 Đánh giá sinh trƣởng chiều cao vƣờn ƣơm sau 1, tháng 63 Bảng 3.13 Tổng hợp kết đo kích thƣớc giai đoạn tháng tuổi 64 Bảng 3.14 Tổng hợp kết đo kích thƣớc giai đoạn tháng tuổi 65 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Tỷ lệ trồng biến đổi gen/tổng diện tích loại nƣớc trồng biến đổi gen lớn giới Hình 1.2 Tổng giá trị (USD) thu đƣợc từ trồng biến đổi gen toàn cầu Hình 1.3 Bạch đàn lai UP trồng khảo nghiệm Yên Bình – Yên Bái 21 Hình 1.4 Cây Bạch đàn lai UP phƣơng pháp nhân giống in vitro 23 Hình 2.1 Vật liệu Bạch đàn lai UP sử dụng chuyển gen 31 Hình 2.2 Cấu trúc vector pGWB2/35S/EcHB1 32 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tái sinh thông qua phôi soma cho Bạch đàn lai UP 34 Hình 2.4 Vị trí đƣợc chọn để đánh giá hình thái 38 Hình 3.1 Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Km đến chồi chƣa chuyển gen 43 Hình 3.2 Bạch đàn lai UP 15 ngày tuổi tạo mô sẹo mơi trƣờng chọn lọc 45 Hình 3.3 Mẫu bật chồi sau chuyển gen tiền nuôi cấy 48 48 Hình 3.4 Mẫu nhiễm khuẩn với thời gian lần lƣợt sau 10 phút, 15 phút, 20 phút 51 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP 54 Hình 3.6 Mẫu chuyển gen tái sinh mơi trƣờng chọn lọc 55 Hình 3.7 Bình nhân chồi dịng Bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1 55 Hình 3.8 Chồi chuyển gen EcHB1 mơi trƣờng chọn lọc 58 Hình 3.9 Hình thái thân dịng bạch đàn chuyển gen đối chứng 62 Hình 3.10 Cây bạch đàn chuyển gen đối chứng giai đoạn tháng tuổi 63 Hình 3.11 Hình thái kích thƣớc chuyển gen đối chứng giai đoạn tháng tuổi 64 Hình 3.12 Hình thái kích thƣớc chuyển gen đối chứng giai đoạn tháng tuổi 66 Hình 3.13 Bạch đàn chuyển gen rễ môi trƣờng chọn lọc vƣờn ƣơm 67 Hình 3.14 Cây chuyển gen EcHB1 trồng vƣờn ƣơm 67 Hình 3.15 Kết chạy điện di kiểm tra ADN số dòng Bạch đàn lai UP 68 Hình 3.16 Kết PCR 40 dòng bạch đàn chuyển gen EcHB1 69 Hình 3.17 Kết kiểm tra có mặt gen EcHB1 PCR 70 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1.1 Hiện trạng vai trò trồng biến đổi gen 1.1.1.1 Hiện trạng trồng biến đổi gen 1.1.1.2 Vai trò trồng biến đổi gen 1.1.1.3 Tình hình trồng biến đổi gen nước ta 1.1.2 Các phƣơng pháp chuyển gen 11 1.1.2.1 Chuyển gen trực tiếp 11 1.1.2.2 Chuyển gen gián tiếp 12 1.1.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen lâm nghiệp 13 1.1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 1.1.3.2 Các nghiên cứu nước 15 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP 17 1.2.1 Tổng quan bạch đàn Bạch đàn lai UP 17 1.2.1.1 Tổng quan bạch đàn 17 1.2.1.2 Nghiên cứu phát triển giống Bạch đàn lai UP Việt Nam 20 1.2.3 Các hƣớng cải thiện giống bạch đàn ứng dụng Công nghệ sinh học 22 1.2.3.1 Nhân giống vơ tính in vitro bạch đàn 22 1.2.3.2 Tái sinh in vitro thơng qua hình thành callus phơi soma 24 1.2.3.3 Nghiên cứu phát triển sử dụng thị phân tử chọn tạo lai giống 25 1.2.3.4 Chuyển gen cho loài bạch đàn 26 1.2.4 Gen EcHB1 ứng dụng cải thiện chiều dài sợi gỗ 28 1.2.4.1 Vai trò nhân tố phiên mã sinh trưởng thực vật 28 1.2.4.2 Nhân tố phiên mã gen EcHB1 30 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 31 2.1.1 Vật liệu thực vật 31 2.1.2 Vật liệu di truyền chủng vi khuẩn 31 2.1.3 Trang thiết bị hóa chất 32 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Nghiên cứu tái sinh in vitro dòng Bạch đàn UP 33 2.2.2 Xác định ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin 35 2.2.3 Xác định tuổi vật liệu đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 35 2.2.4 Xác định thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 36 2.2.5 Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A tumefaciens 36 2.2.6 Xác định thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 36 2.2.7 Xác định thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 37 2.2.8 Tái sinh từ mẫu biến nạp gen, nhân dòng biến nạp gen, rễ trồng chăm sóc bên ngồi vƣờn ƣơm 37 2.2.9 Phƣơng pháp đánh giá hình thái chuyển gen 37 2.2.10 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 38 2.2.11 Xác định có có mặt gen chuyển gen PCR 39 2.2.12 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm xử lý số liệu 41 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 QUY TRÌNH CHUYỀN GEN VÀO CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP THÔNG QUA A TUMEFACIENS 42 3.1.1 Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin 42 3.1.3 Ảnh hƣởng thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 46 3.1.4 Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A tumefaciens 48 3.1.5 Ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 49 3.1.6 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 51 3.1.8 Đánh giá khả sống sót chồi chuyển gen 56 3.1.9 Đánh giá khả rễ kiểm tra chồi chuyển gen 58 3.2 PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÌNH THÁI CỦA CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI CHUYỂN GEN 60 3.2.1 So sánh hình thái Bạch đàn lai UP chuyển gen đối chứng giai đoạn in vitro 60 3.2.2 So sánh hình thái chuyển gen đối chứng giai đoạn vƣờn ƣơm 62 3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG MANG GEN CỦA CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN TẠO ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR 66 3.3.1 Tách chiết DNA tổng số 66 3.3.2 Xác định có có mặt gen EcHB1 PCR 68 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 4.1 Kết luận 71 4.2 Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, công nghệ gen đƣợc ghi nhận giải pháp quan trọng hữu hiệu chọn tạo giống đặc biệt kỹ thuật chuyển gen Thông qua việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen cho phép tạo giống trồng đột phá suất, chất lƣợng nhƣ khả chống chịu sâu bệnh hại Không trồng tạo từ quy trình chuyển gen có nhiều đặc tính ƣu việt mà trồng hoang dại ban đầu khơng có Chuyển gen bạch đàn đƣợc thực từ năm 1990 cho nhiều loài bạch đàn nhƣ: Eucalyptus gunnii, E globulus, E camaldulensis, E nitens, [1] Chuyển gen cho bạch đàn chủ yếu tập trung vào tính trạng tăng sinh khối, thay đổi tính chất gỗ (thay đổi hàm lƣợng lignin, cellulose), chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn hán, lạnh, nhiễm mặn) chống sâu bệnh hại Việc chuyển gen bạch đàn đƣợc thực nƣớc Tetsu Kawazu cộng (2003) đƣợc cấp sáng chế quy trình chuyển gen gus vào loài bạch đàn E camaldulensis, E globulus, E grandis, E grandis x E.urophylla E urophylla mẫu cấy sinh dƣỡng lấy từ bạch đàn trƣởng thành; Cheng cộng (2006) đƣợc cấp sáng chế quy trình chuyển gen chọn lọc chuyển gen cho loài bạch đàn E urophylla Các kết nghiên cứu cho thấy sử dụng loài bạch đàn, dịng bạch đàn khác có quy trình chuyển gen khác nhƣ cho hiệu suất chuyển gen khác [2] Do để chuyển gen hiệu vào lồi bạch đàn dịng bạch đàn cụ thể cần có quy trình thích hợp Tetsuya Sonoda cộng (2009) phối hợp nghiên cứu với công ty giấy Oji thành công việc phân lập gen EcHB1 mã hóa nhân tố phiên mã loại II (HD-Zip class II transcription factor) liên quan đến việc hình thành phát triển sợi gỗ đƣợc phân lập từ nhóm gen nhân tố phiên mã bạch đàn E camaldulensis Sử dụng kỹ thuật microarray cho thấy bạch đàn E camaldulensis biến nạp gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1), biểu gen liên quan đến q trình sinh tổng hợp lignin nhƣ CCoAOMT, CAD, CCR C4H giảm [3] Tại Việt Nam, bạch đàn chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) đƣợc Trần Hồ Quang cộng thực khuôn khổ đề tài ”Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ” giai đoạn 20112015, kết xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UU (E urophylla x E urophylla) làm tăng chiều dài sợi gỗ chọn đƣợc dòng bạch đàn lai UU89 có sinh trƣởng nhanh (vƣợt trội chiều cao 25%, đƣờng kính 10% so với giống đại trà) Hiện nay, số dòng Bạch đàn lai UP giống lai Bạch đàn urophylla Bạch đàn pellita (E urophylla x E pellita) đƣợc đánh giá có ƣu lai, sinh trƣởng tốt so với loài bố mẹ nhiều dạng lập địa đƣợc công nhận giống quốc gia giống tiến kỹ thuật để phát triển rộng rãi sản xuất, nguồn vật liệu tiềm cho chuyển gen làm tăng chiều dài sợi gỗ Xuất phát từ sở đề tài ”Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x E pellita) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đƣợc tiến hành với mục tiêu xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen cho chiều dài sợi gỗ EcHB1 vào Bạch đàn lai UP từ chọn tạo đƣợc giống bạch đàn biến đổi gen có suất, chất lƣợng cao để phục vụ chƣơng trình trồng rừng gỗ lớn 6 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1.1 Hiện trạng vai trò trồng biến đổi gen 1.1.1.1 Hiện trạng trồng biến đổi gen Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crops – GM Crops) đƣợc thƣơng mại hóa từ năm 1996 Tổ chức Quốc tế Tiếp thu Ứng dụng Công nghệ sinh học Nông nghiệp (ISAAA) phát hành báo cáo thƣờng niên cập nhật tình hình ứng dụng trồng Công nghệ sinh học (CNSH) hay trồng biến đổi gen toàn cầu năm 2017; cho thấy diện tích canh tác trồng biến đổi gen tăng gấp 110 lần sau 21 năm thƣơng mại hoá - phát triển từ 1,7 triệu năm 1996 lên tới 185,1 triệu vào năm 2016 Báo cáo tiếp tục cho thấy lợi ích lâu dài trồng biến đổi gen nông dân, đồng thời nhấn mạnh tiềm phát triển lợi ích số giống đƣợc chấp thuận thƣơng mại hoá thời gian gần ngƣời tiêu dùng Tính đến năm 2017 có 67 quốc gia sử dụng trồng biến đổi gen (bao gồm 26 quốc gia trồng biến đổi gen), cấp phép thức nhập sử dụng trồng biến đổi gen với mục đích làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi chế biến Cụ thể, châu Âu, bốn quốc gia Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Séc Slovakia trồng 136.000 bắp biến đổi gen năm 2016, tăng 17% so với năm 2015 Ở châu Phi, Nam Phi Sudan liên tiếp mở rộng diện tích bắp, đậu nành biến đổi gen đạt 2,66 triệu năm 2016, năm 2015 có 2,29 triệu Cịn châu Mỹ, Brazil có diện tích canh tác bắp, đậu nành, hạt cải dầu GM Crops tăng 11%, nƣớc lớn thứ sau Mỹ diện tích trồng biến đổi gen Tại châu Á, Bangladesh nƣớc thứ 28 trồng Cà tím Bt vào tháng 10 năm 2013 Năm 2018, Châu Phi có quốc gia ứng dụng trồng biến đổi gen Nam Phi, Sudan, Vƣơng quốc Eswatini Trong năm 2019, châu lục có thêm quốc gia Malawi, Nigeria Ethiopia, định khai thác lợi ích trồng biến đổi gen Ngồi ra, Kenya cơng bố việc thƣơng mại hố bơng biến đổi gen vào cuối năm 2019, thức bắt đầu canh tác vào năm 2020 Với việc bổ sung thêm ba quốc gia châu Phi, số quốc gia trồng trồng biến đổi gen năm 2019 tăng lên thành 29 quốc gia Trong đó, quốc gia dẫn đầu với diện tích trồng biến đổi gen lớn Hoa Kỳ, Brazil, Argentina, Canada Ấn Độ (Hình 1.1) Với tỷ lệ ứng dụng cao trồng biến đổi gen quốc gia này, có khoảng 1,95 tỷ ngƣời, tƣơng đƣơng với 26% dân số giới, đƣợc hƣởng lợi từ CNSH vào năm 2019 [4] Hình 1.1 Tỷ lệ trồng biến đổi gen/tổng diện tích loại nƣớc trồng biến đổi gen lớn giới (Nguồn: ISAAA) Tính đến năm 2019, tổng cộng có 190,4 triệu trồng biến đổi gen đƣợc canh tác 29 quốc gia, góp phần quan trọng vào giải vấn đề an ninh lƣơng thực, tính bền vững, giảm thiểu biến đổi khí hậu nhƣ nâng cao đời sống 17 triệu nông dân ứng dụng CNSH gia đình họ tồn cầu Tốc độ tăng trƣởng diện tích vùng trồng biến đổi gen đạt đến hai số đƣợc ghi nhận quốc gia phát triển, đặc biệt Việt Nam, Philippines Colombia [4] 8 1.1.1.2 Vai trò trồng biến đổi gen Cây trồng biến đổi gen có đóng góp mặt kinh tế, xã hội môi trƣờng nhƣ sau: - Cây trồng biến đổi gen giúp nông dân nƣớc phát triển cải thiện thu nhập, góp phần vào xóa đói giảm nghèo Trong giai đoạn 1996 – 2016 diện tích canh tác trồng biến đổi gen tăng gấp 110 lần sau 21 năm thƣơng mại hóa, phát triển từ 1,7 triệu năm 1996 lên tới 185,1 triệu vào năm 2016 góp phần làm tăng giá trị sản xuất lên đến 186,1 tỷ đô la cho khoảng 17 triệu nơng dân tồn cầu [4] - Cung cấp nguồn lƣơng thực thiết yếu cho tƣơng lai với việc tạo trồng biến đổi gen mang tính trạng quý nhƣ kháng virus, kháng sâu bệnh, chịu mặn, suất cao Ngoài tăng cƣờng chất lƣợng thực phẩm đƣợc ứng dụng rộng rãi toàn giới nhƣ giống lúa giàu carotenoid (tiền vitamin A), khoai tây biến đổi gen với ⅓ lƣợng protein chất dinh dƣỡng thiết yếu có giá trị cao - Hoạt động nơng nghiệp truyền thống ngƣời có tác động lớn với môi trƣờng Cây trồng biến đổi gen với tính trạng kháng sâu, kháng virus chống chịu chất diệt cỏ góp phần làm giảm việc sử dụng hóa chất trồng trọt Giúp tiết kiệm 671 triệu kg thuốc trừ sâu (giai đoạn 1996 - 2016), 48,5 triệu kg riêng năm 2016; làm giảm EIQ (Environmental Impact Quotient) đến 18,4% giai đoạn 1996-2016, riêng năm 2016 đạt 18,3% - Cây trồng biến đổi gen giúp giải lo ngại lớn môi trƣờng, Giảm thiểu tác hại biến đổi khí hậu giảm lƣợng khí gây hiệu ứng nhà kính, giảm thiểu tác động thay đổi thời tiết Theo đánh giá năm 2016, trồng biến đổi gen làm giảm khoảng 27,1 tỷ kg tƣơng đƣơng với khí thải 16,7 triệu xe chạy đƣờng năm - Cây trồng biến đổi gen góp phần giúp xóa đói giảm nghèo tăng thu nhập cho ngƣời nông dân Giá trị thu nhập từ trồng biến đổi gen tăng lên từ 91 triệu USD (năm 1996 - năm bắt đầu trồng trồng biến đổi gen) lên đến 15,690 triệu USD năm 2014 (Hình 1.2) Tỷ lệ đóng góp số lồi trồng vào tổng giá trị trồng biến đổi gen năm 2014 gồm 8,6 tỷ USD từ ngô biến đổi gen, 5,2 tỷ USD từ đậu tƣơng biến đổi gen, 1,2 tỷ USD từ ngô biến đổi gen, 0,4 tỷ USD từ Canola biến đổi gen, tỷ USD từ củ cải đƣờng biến đổi gen phần lại từ loài trồng biến đổi gen khác Đến 2018, giá trị từ biến đổi gen giới đạt 18,15 tỷ USD Tổng giá trị trồng biến đổi gen đạt tới 27,9 tỷ USD vào năm 2020 đƣợc dự đốn đạt tới 45 tỷ USD vào năm 2027 [4] Hình 1.2 Tổng giá trị (USD) thu đƣợc từ trồng biến đổi gen tồn cầu 1.1.1.3 Tình hình trồng biến đổi gen nước ta Ở nƣớc ta, việc đầu tƣ khuyến khích nghiên cứu tạo giống trồng biến đổi gen thức đƣợc thực từ năm 2006, sau chƣơng trình trọng điểm phát triển ứng dụng Công nghệ Sinh học lĩnh vực Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn đến năm 2020 đƣợc phủ phê duyệt (theo Quyết định số 11/2006/QĐ-TTg Thủ tƣớng Chính phủ) Các đề tài nghiên cứu chuyển gen thực vật chủ yếu đƣợc tiến hành sở nghiên cứu khoa học lớn có đội ngũ cán có trình độ chun mơn cao có trang thiết bị đại Việt Nam phê chuẩn trồng cơng nghệ sinh học thƣơng mại hóa vào tháng năm 2014 cho loại ngô lai MON 89034 (kháng sâu), 10 NK603 (chống chịu chất diệt cỏ), Bt11 MIR162 (kháng côn trùng) Năm 2017, có 45.000 trồng ngơ biến đổi gen tỉnh thành khắp nƣớc, tăng 13 lần so với năm 2015 Ƣớc tính có khoảng 37.500 hộ nơng dân tham gia trồng loại Đến thời điểm tại, Việt Nam có 22 giống trồng biến đổi gen đƣợc thƣơng mại hóa gồm 14 giống ngơ giống đậu nành [4] Đối với nông nghiệp, giai đoạn 2006 - 2011 nhà khoa học Việt Nam tạo đƣợc số dòng bông, ngô, đậu tƣơng biến đổi gen mang gen kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ, số dòng cà chua chuyển gen kháng bệnh vi rút xoắn vàng lá, thuốc chuyển gen kháng bệnh khảm xoắn đọt Các dòng chuyển gen đƣợc đánh giá phạm vi nhà lƣới khả biểu gen chuyển hình thành dịng biến đổi gen tiến tới khảo nghiệm ứng dụng vào sản xuất Tuy nhiên, để đƣa giống trồng biến đổi gen vào sản xuất diện rộng gặp nhiều khó khăn [5], [6], [7], [8], [9] Đối với lâm nghiệp, việc nghiên cứu phát triển giống biến đổi gen có nhiều thuận lợi so với nông nghiệp sản phẩm từ lâm nghiệp nghiệp biến đổi gen không sử dụng trực tiếp làm thức ăn cho ngƣời động vật nên bị cản trở hay kiểm sốt quy định quản lý an toàn sinh vật biến đổi gen Vì vậy, nhiều nƣớc giới khuyến khích nhà khoa học nghiên cứu tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen Đến nay, Bộ Nông nghiệp & PTNT phê duyệt 04 nhiệm vụ nghiên cứu khoa học cấp nhà nƣớc tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen, đối tƣợng lâm nghiệp là: Xoan ta, thông bạch đàn Trong đó, Viện CNSH Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp triển khai 02 nhiệm vụ cấp nhà nƣớc tạo giống Xoan ta Bạch đàn urô biến đổi gen Đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta biến đổi gen” với mục tiêu tạo giống trồng có suất cao, chất lƣợng tốt Kết xây dựng thành cơng quy trình biến nạp gen vào đối tƣợng Xoan ta đạt hiệu cao, tạo đƣợc dòng Xoan ta chuyển gen sinh trƣởng nhanh dòng Xoan ta chuyển gen tăng chất lƣợng gỗ Đề tài “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) sinh 11 trƣởng nhanh công nghệ chuyển gen” triển khai năm (2012 2016) Nhóm nghiên cứu xây dựng đƣợc hệ thống tái sinh bạch đàn urô thông qua phôi soma với hiệu suất cao phục vụ biến nạp gen tạo số dòng bạch đàn chuyển gen phạm vi phòng thí nghiệm Sự thành cơng đề tài cho thấy nhà khoa học Việt Nam hồn tồn có khả tiếp cận làm chủ loại công nghệ Kết đề tài khẳng định hƣớng nghiên cứu lĩnh vực chọn tạo giống trồng lâm nghiệp công nghệ áp dụng đƣợc Việt Nam Trong tƣơng lai, nhà khoa học hy vọng hƣớng nghiên cứu tạo giống trồng đặc biệt đối tƣợng lâm nghiệp công nghệ chuyển gen tiếp tục đƣợc quan tâm phát triển Tuy nhiên, nghiên cứu tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen cần có nhiều thời gian Trƣớc tiên, cần xác định loài chủ lực để tập trung nghiên cứu phát triển, sau xây dựng chƣơng trình nghiên cứu tổng thể dài hạn cho loài cụ thể với mức đầu tƣ kinh phí thời gian nghiên cứu phù hợp (10 - 15 năm), giao nhiệm vụ cho sở nghiên cứu nhóm nhà khoa học đủ mạnh tập trung nghiên cứu để tạo đƣợc sản phẩm cuối (giống mới) đáp ứng mục tiêu ngƣời 1.1.2 Các phƣơng pháp chuyển gen Hiện có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để chuyển gen thực vật Căn vào cách thức đƣa gen vào tế bào thực vật mà ngƣời ta chia thành hai phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp chuyển gen gián tiếp 1.1.2.1 Chuyển gen trực tiếp Chuyển gen trực tiếp việc sử dụng biện pháp học, vật lý hóa học để chuyển trực tiếp gen vào tế bào thực vật Một số phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp bao gồm: - Phương pháp bắn gen: Là phƣơng pháp sử dụng hạt kim loại nặng (vàng, vonfram) có kích thƣớc cực nhỏ, đƣợc bọc bên ADN bắn trực tiếp vào tế bào thực vật Bằng phƣơng pháp biến nạp tất loại tế bào Tuy 12 nhiên, tần số biến nạp phƣơng pháp bắn gen thấp thƣờng xuyên nhận đƣợc biến nạp khảm [10] - Phương pháp xung điện: Là phƣơng pháp dùng tƣợng phóng điện để tạo lỗ màng tế bào, làm cho việc đƣa ADN vào tế bào dễ hơn, ADN tiếp giáp với màng tế bào Phƣơng pháp dễ dàng thực đối tƣợng mầm [11] - Phương pháp vi tiêm: Là phƣơng pháp sử dụng vi kim kính hiển vi đƣa ADN vào tế bào định Phƣơng pháp tạo dòng biến nạp từ proplast biến nạp khảm từ tế bào tiền phơi có nguồn gốc từ hạt phấn [10] Hạn chế phƣơng pháp cần dùng thiết bị có độ xác cao kỹ phức tạp từ ngƣời sử dụng [12] - Phương pháp chuyển gen qua ống phấn: Đây phƣơng pháp chuyển gen thông qua nuôi cấy in vitro, dựa nguyên tắc ADN ngoại lai chuyển vào theo đƣờng ống phấn chui vào bầu nhụy - Phương pháp siêu âm: Dùng chuyển gen vào tế bào trần protoplast - Phương pháp hóa học: Chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ chất hóa học nhƣ polyethylen-glycol 1.1.2.2 Chuyển gen gián tiếp - Phương pháp chuyển gen nhờ virus: Virus đối tƣợng đƣợc sử dụng chuyển gen vào thực vật có số ƣu điểm: virus có khả xâm nhiễm chuyển genome sang tế bào thực vật Nhƣng lây nhiễm virus thƣờng làm yếu tế bào thực vật, phƣơng pháp đƣợc sử dụng đến ... sản xuất, nguồn vật liệu tiềm cho chuyển gen làm tăng chiều dài sợi gỗ Xuất phát từ sở đề tài ? ?Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x E. .. TẠO VI? ??N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM HỌC VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Vi? ??t Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus. .. E pellita) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens? ?? đƣợc tiến hành với mục tiêu x? ?y dựng đƣợc quy trình chuyển gen cho chiều dài sợi gỗ EcHB1 vào Bạch đàn lai UP từ chọn tạo đƣợc giống bạch