Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai UP (eucalyptus urophylla x e pellita) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Việt Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Việt Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: TS Trần Hồ Quang Hƣớng dẫn 2: TS Lê Sơn Hà Nội - 2021 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan nội dung luận văn kết nghiên cứu thân dƣới hƣớng dẫn TS Trần Hồ Quang TS Lê Sơn Mọi kết nghiên cứu nhƣ ý tƣởng tác giả khác (nếu có) đƣợc trích dẫn cụ thể Đề tài luận văn chƣa đƣợc bảo vệ hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nhƣ chƣa đƣợc công bố phƣơng tiện Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Việt Hà Lời cảm ơn Tôi xin cảm ơn Học viện Khoa học Cơng nghệ, phịng Đào tạo, thầy giáo, cô giáo Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình học tập trƣờng Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Giống Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, tồn thể cán Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hƣớng dẫn, TS Trần Hồ Quang (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) TS Lê Sơn (Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Luận văn đƣợc sử dụng phần số liệu kết từ đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ (giai đoạn 2)” ThS Trần Đức Vƣợng làm chủ nhiệm, thuộc Chƣơng trình trọng điểm phát triển ứng dụng Công nghệ sinh học Nông nghiệp Phát triển nông thôn đến 2020 mà Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp đơn vị thực Xin chân thành cám ơn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên khích lệ tơi suốt thời gian học tập thực đề tài Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Việt Hà Danh mục ký hiệu chữ viết tắt STT CNSHCông nghệ sinh học 14 10 LBMôi trƣờng nuôi cấy Luria and Betani 11 MSMôi trƣờng nuôi cấy Murashige & Skoog 13 ODMật độ quang học (Optical Density) PCR Phản ứng trùng hợp chuỗi (Polymerase Chain Reaction) Danh mục bảng Bảng 1.1 Các loài bạch đàn đƣợc nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 27 Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 40 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 40 Bảng 2.3 Chu trình phản ứng PCR 40 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin 42 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ Kanamycin đến khả rễ 44 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng tuổi vật liệu đến mẫu tạo mô sẹo 45 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 47 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn đến tỷ lệ chồi tái sinh 49 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ tạo mô sẹo 50 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 52 Bảng 3.8 Khả sống sót chồi chuyển gen sau lần chọn lọc 56 Bảng 3.9 Kết kiểm tra khả rễ chồi chuyển gen sau lần chọn lọc 59 Bảng 3.10 So sánh hình thái thân chuyển gen với đối chứng 60 Bảng 3.11 So sánh hình thái chuyển gen đối chứng 61 Bảng 3.12 Đánh giá sinh trƣởng chiều cao vƣờn ƣơm sau 1, tháng 63 Bảng 3.13 Tổng hợp kết đo kích thƣớc giai đoạn tháng tuổi 64 Bảng 3.14 Tổng hợp kết đo kích thƣớc giai đoạn tháng tuổi 65 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Tỷ lệ trồng biến đổi gen/tổng diện tích loại nƣớc trồng biến đổi gen lớn giới Hình 1.2 Tổng giá trị (USD) thu đƣợc từ trồng biến đổi gen tồn cầu Hình 1.3 Bạch đàn lai UP trồng khảo nghiệm Yên Bình – Yên Bái .21 Hình 1.4 Cây Bạch đàn lai UP phƣơng pháp nhân giống in vitro 23 Hình 2.1 Vật liệu Bạch đàn lai UP sử dụng chuyển gen .31 Hình 2.2 Cấu trúc vector pGWB2/35S/EcHB1 32 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tái sinh thơng qua phơi soma cho Bạch đàn lai UP 34 Hình 2.4 Vị trí đƣợc chọn để đánh giá hình thái .38 Hình 3.1 Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Km đến chồi chƣa chuyển gen 43 Hình 3.2 Bạch đàn lai UP 15 ngày tuổi tạo mơ sẹo mơi trƣờng chọn lọc 45 Hình 3.3 Mẫu bật chồi sau chuyển gen tiền nuôi cấy 48 48 Hình 3.4 Mẫu nhiễm khuẩn với thời gian lần lƣợt sau 10 phút, 15 phút, 20 phút 51 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP 54 Hình 3.6 Mẫu chuyển gen tái sinh mơi trƣờng chọn lọc 55 Hình 3.7 Bình nhân chồi dịng Bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1 55 Hình 3.8 Chồi chuyển gen EcHB1 mơi trƣờng chọn lọc 58 Hình 3.9 Hình thái thân dịng bạch đàn chuyển gen đối chứng 62 Hình 3.10 Cây bạch đàn chuyển gen đối chứng giai đoạn tháng tuổi 63 Hình 3.11 Hình thái kích thƣớc chuyển gen đối chứng giai đoạn tháng tuổi 64 Hình 3.12 Hình thái kích thƣớc chuyển gen đối chứng giai đoạn tháng tuổi 66 Hình 3.13 Bạch đàn chuyển gen rễ môi trƣờng chọn lọc vƣờn ƣơm .67 Hình 3.14 Cây chuyển gen EcHB1 trồng vƣờn ƣơm 67 Hình 3.15 Kết chạy điện di kiểm tra ADN số dòng Bạch đàn lai UP 68 Hình 3.16 Kết PCR 40 dịng bạch đàn chuyển gen EcHB1 69 Hình 3.17 Kết kiểm tra có mặt gen EcHB1 PCR 70 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1.1 Hiện trạng vai trò trồng biến đổi gen 1.1.1.1 Hiện trạng trồng biến đổi gen 1.1.1.2 Vai trò trồng biến đổi gen 1.1.1.3 Tình hình trồng biến đổi gen nước ta 1.1.2.Các phƣơng pháp chuyển gen 1.1.2.1 Chuyển gen trực tiếp 1.1.2.2 Chuyển gen gián tiếp 1.1.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen lâm nghiệp 1.1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.1.3.2 Các nghiên cứu nước 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP 1.2.1 Tổng quan bạch đàn Bạch đàn lai UP 1.2.1.1 Tổng quan bạch đàn 1.2.1.2 Nghiên cứu phát triển giống Bạch đàn lai UP Việt Nam 1.2.3 Các hƣớng cải thiện giống bạch đàn ứng dụng Công nghệ sinh học 22 1.2.3.1 Nhân giống vơ tính in vitro 1.2.3.2 Tái sinh in vitro thông qua h 1.2.3.3 Nghiên cứu phát triển sử dụng thị phân tử chọn tạo lai giống 1.2.3.4 Chuyển gen cho loài bạch đàn 1.2.4 Gen EcHB1 ứng dụng cải thiện chiều dài sợi gỗ 1.2.4.1 Vai trò nhân tố phiên mã sinh trưởng thực vật 1.2.4.2 Nhân tố phiên mã gen EcHB1 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 31 2.1.1 Vật liệu thực vật 31 2.1.2 Vật liệu di truyền chủng vi khuẩn 31 2.1.3 Trang thiết bị hóa chất 32 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Nghiên cứu tái sinh in vitro dòng Bạch đàn UP 33 2.2.2 Xác định ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin 35 2.2.3 Xác định tuổi vật liệu đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 35 2.2.4 Xác định thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 36 2.2.5 Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A tumefaciens 36 2.2.6 Xác định thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 36 2.2.7 Xác định thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 37 2.2.8 Tái sinh từ mẫu biến nạp gen, nhân dòng biến nạp gen, rễ trồng chăm sóc bên ngồi vƣờn ƣơm 37 2.2.9 Phƣơng pháp đánh giá hình thái chuyển gen 37 2.2.10 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 38 2.2.11 Xác định có có mặt gen chuyển gen PCR .39 2.2.12 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm xử lý số liệu 41 Bảng Danh mục trang thiết bị cần thiết TT Máy móc, trang thiết bị, vật tƣ Máy lọc nƣớc Máy sản xuất nƣớc cất lần Nồi hấp vô trùng Tủ sấy vô trùng Cân phân tích Cân kỹ thuật Máy khuấy từ gia nhiệt Máy đo pH để bàn Tủ lạnh sâu -80 oC, Tủ lạnh sâu 20 oC; Tủ mát oC, Tủ ổn nhiệt có gắn máy lắc 10 11 Tủ an toàn sinh học cấp Bộ panh, kéo, dao cấy, que cấy khuẩn, đèn cồn 12 Ghế ngồi + Xe đẩy 13 Giàn nuôi phịng ni 14 Giá xếp mơi trƣờng 15 Giá úp chai lọ 16 Thiết bị kiểm tra nhiệt độ, độ ẩm PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU Ảnh hƣởng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin Trong chọn lọc chồi Sau tuần: Anova: Single Factor (Số mẫu sống sau tuần) SUMMARY Groups 10 50 75 100 150 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Sau tuần Anova: Single Factor (Số mẫu sống sau tuần) SUMMARY Groups 10 50 75 100 150 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Sau tuần Anova: Single Factor (Số mẫu sống sau tuần SUMMARY Groups 10 50 75 100 150 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Trong chọn lọc rễ Anova: Single Factor (Số chồi rễ sau tuần) SUMMARY Groups 10 50 75 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Anova: Single Factor (Số chồi rễ sau tuần) SUMMARY Groups 10 50 75 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Anova: Single Factor (Số chồi rễ sau tuần) SUMMARY Groups 10 50 75 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Ảnh hƣởng tuổi vật liệu đến khả biến nạp gen Đoạn thân Anova: Single Factor SUMMARY Groups 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Mảnh Anova: Single Factor SUMMARY Groups 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Ảnh hƣởng thời gian tiền nuôi cấy Đoạn thân Anova: Single Factor SUMMARY Groups 24 48 72 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Mảnh Anova: Single Factor SUMMARY Groups 24 48 72 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A tumefaciens Anova: Single Factor SUMMARY Groups 0,1 0,3 0,5 0,7 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn Đoạn thân Anova: Single Factor (Số mẫu tạo mô sẹo) SUMMARY Groups 10 15 20 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Mảnh Anova: Single Factor (Số mẫu tạo mô sẹo) SUMMARY Groups 10 15 20 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy Đoạn thân SUMMARY Groups 24 48 72 96 120 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Mảnh Anova: Single Factor (Số mẫu tạo mô sẹo) SUMMARY Groups 24 48 72 96 120 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Hình thái thân giai đoạn in vitro Số lóng trung bình Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row Row Row ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Chiều dài lóng trung bình Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row Row Row ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Chiều cao chồi Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row Row Row ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Chiều dài trung bình Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row Row Row ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Chiều rộng Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row Row Row ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Chỉ số Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row Row Row ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total ... sản xuất, nguồn vật liệu tiềm cho chuyển gen làm tăng chiều dài sợi gỗ Xuất phát từ sở đề tài ? ?Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x E. .. VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Vi? ??t Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium. .. - Chuyển gen làm tăng chiều dài sợi gỗ Bạch đàn chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) đƣợc Trần Hồ Quang cộng thực khuôn khổ đề tài ? ?Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn lai UU biến đổi gen cho chiều