NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 70 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 Nghiên cứu chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi gen PKD1 gây bệnh thận đa nang di truyền trội Nguyễn Thị Việt Hà, Triệu Tiến Sang, Nguyễn[.]
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Nghiên cứu chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi gen PKD1 gây bệnh thận đa nang di truyền trội Nguyễn Thị Việt Hà, Triệu Tiến Sang, Nguyễn Thị Thanh Nga Ngô Trường Giang, Trần Văn Tuấn, Trần Văn Khoa Bộ môn Sinh học Di truyền Y học, Học viện Quân y TÓM TẮT Bệnh thận đa nang di truyền trội (ADPKD) có triệu chứng chủ yếu hình thành nang làm giãn nở ống thận quan khác gan, lách, tuyến tụy nguyên nhân dẫn đến suy thận giai đoạn cuối Việc phát sớm ADPKD có ý nghĩa lớn với gia đình có người bị bệnh Nghiên cứu nhằm xây dựng áp dụng quy trình phát đột biến gen PKD1 mẫu máu ngoại vi mẫu phôi gia đình cụ thể có bệnh thận đa nang di truyền trội Nghiên cứu tiến hành số mẫu máu ngoại vi mẫu phôi ngày gia đình tình nguyện tham gia nghiên cứu Tiến hành sàng lọc phát đột biến từ thành viên bị bệnh kỹ thuật giải trình tự gen hệ mới- NGS (Next genezation sequencing) Hồn thiện quy trình ARMS-PCR Touchdown PCR để kiểm tra đột biến mẫu máu mẫu phơi Quy trình sử dụng ARMS-PCR Touchdown PCR cho kết xác việc xác định người mang gen đột biến gây bệnh, tốn so với NGS Có thể áp dụng quy trình cho gia đình mang đột biến tương tự Ngày nhận bài: 30/6/2020 Ngày phản biện: 12/8/2020 Ngày chấp nhận đăng: 17/8/2020 70 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 Từ khóa: Bệnh thận đa nang di truyền trội, chẩn đoán di truyền chuyển phôi, ARMS-PCR, Touchdown PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh thận đa nang di truyền theo gen trội nằm NST thường (Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease = ADPKD) rối loạn di truyền phổ biến thận Tỷ lệ ước tính khoảng 1/10001/500 nước phương tây [6] Theo đặc điểm giải phẫu bệnh, thận đa nang thường có nang hai bên Thận tăng kích thước dần, có nhiều nang lớn nhỏ khơng nhau, đường kính từ 0,3- 0,5 cm dẫn đến hậu cuối thường suy thận Nguyên nhân gây ADPKD đột biến gen PKD1, PKD2, 85% nguyên nhân đột biến gen PKD1 Đối với bệnh thận đa nang di truyền trội liên quan tới đột biến gen PKD1, PKD2 có đặc điểm gen trội gây bệnh bệnh thường khởi phát muộn người mang gen khoảng 30 tuổi Đối với bệnh nhân PKD1 (các bệnh nhân mang đột biến gen PKD1) chuyển sang suy thận NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG giai đoạn cuối có độ tuổi trung bình 54 tuổi, sớm khoảng 20 năm thường có biểu nguy hiểm so với bệnh nhân PKD2 [2], [3] Do vậy, việc chẩn đoán sớm bệnh cần thiết gia đình có người bị bệnh thận đa nang di truyền trội Việc chẩn đốn sớm bệnh có ý nghĩa việc thực tốt công tác tư vấn di truyền người mang gen bệnh chưa có triệu chứng biểu bệnh, giúp chuẩn bị tâm lý có biện pháp điều trị sớm ngăn biến chứng xảy ra, giúp trì hỗn việc khởi phát suy thận giai đoạn cuối Bện cạnh đó, việc chẩn đốn sớm khơng thể thiếu cá nhân tham gia thực hiến thận để cấy ghép, tránh trường hợp người tham gia hiến thận người mang gen gây bệnh làm cho thận ghép sớm bị suy Ngoài ra, việc thực chẩn đốn sớm trước chuyển phơi giúp cho cặp vợ chồng mang gen bệnh tiến hành thụ tinh nhân tạo có hội sinh em bé không mang gen trội gây bệnh Từ đó, giúp giảm việc phát tán lưu hành gen đột biến gây bệnh PKD1, PKD2 quần thể, giảm áp lực lên xã hội Với phát triển nhiều kỹ thuật nhằm xác định đột biến gen PKD1 PKD2, kết nghiên cứu cho thấy có nhiều đột biến hai gen, đặc biệt gen PKD1 có tới 970 đột biến gây bệnh [5] với nhiều dạng đột biến khác Tuy nhiên, nhiễm sắc thể 16, có vùng gen giả PKD1 có độ tương đồng cao (97,7%) với trình tự từ 5’UTR exon 32 [1], [4] Do tương đồng cao nên việc xác định đột biến gen PKD1 gặp nhiều khó khăn Hiện Việt Nam nghiên cứu di truyền bệnh thận đa nang di truyền trội đột biến gen PKD1 PKD2 đặc biệt nghiên cứu mẫu phôi chưa thực Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát sớm người mang gen chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi đột biến gen gây bệnh thận đa nang di truyền trội” Đề tài tiến hành với mục tiêu: Mục tiêu 1: Xây dựng quy trình phát đột biến gen PKD1 người bị bệnh thận đa nang di truyền trội Mục tiêu 2: Áp dụng quy trình hồn thiện để sàng lọc phát sớm bệnh thận đa nang di truyền trội phôi ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu để hồn thiện quy trình mẫu máu ngoại vi bệnh nhân Đoàn V T chẩn đoán bị bệnh thận đa nang di truyền trội xác định có đột biến c.9859-9861delCTC giải trình tự gen hệ mẫu máu ngoại vi đối tượng có quan hệ huyết thống với bệnh nhân Đối tượng áp dụng quy trình mẫu phơi gia đình người bệnh mẫu máu người cần chẩn đoán bệnh Hình Phả hệ gia đình bệnh nhân Đồn V T (III-5) Do dịng họ có nhiều người chẩn đoán mắc bệnh thận đa nang độ tuổi sớm, thân III-5 người bị bệnh Gia đình III-5 với III-6 mong muốn sinh người khỏe mạnh không mang bệnh giống III-5 Gia đình thực IVF có phơi muốn kiểm tra để có phơi tốt để thực chuyển phôi Đối với trường hợp gia đình bệnh nhân Đồn V.T., đột biến nằm exon 29 PKD1 nên nhóm nghiên cứu tiến hành thiết kế mồi nhân exon 29 tiến hành giải trình tự theo phương pháp TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 71 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Sanger, nhiên phương pháp không phát được đột biến mẫu máu bệnh nhân Chúng sử dụng kỹ thuật Long range PCR nhân đoạn gen dài từ exon đến exon 34 kết hợp với Nested PCR giải trình tự phát đột biến mẫu máu III-5 Tuy nhiên quy trình khơng thể áp dụng mẫu phôi đặc điểm sản phẩm nhân tồn hệ gen Do vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu với trường hợp gia đình Đồn V T sau: Hình Sơ đồ tiến hành nghiên cứu trường hợp gia đình Đồn V T Với trường hợp bệnh nhân Đồn V T Chúng tơi thiết kế mồi phản ứng ARMS-PCR để nhân sản phẩm: sản phẩm cho alen control (371bp); sản phẩm cho alen bình thường (227bp); sản phẩm cho gen đột biến (200bp) Bảng Trình tự mồi kỹ thuật ARMS-PCR Fm GTTGGCGCCCAGGAAGAGGCAGATACGA Rw TCGCATCCAGAGGGCCACCTGCTGATTC Fo CTGTGTCGACGCTCAGCGGGCTCAACCT Ro CCTGCAGTGCGGCCCTCCCTGCCTACTA Hình 3: Kích thước sản phẩm ARMS-PCR trường hợp Đoàn V T Song song với kỹ thuật ARMS-PCR nghiên cứu cịn hồn thêm kỹ thuật Touchdown PCR 72 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 Bảng Trình tự mồi Touchdown PCR Fw Fm Ro AGGAAGAGGCAGATAATG GTTGGCGCCCAGGAAGAGGAAGA CGTGGCTTCTTTCGAAG Với trình tự mồi trên, sản phẩm sau nhân lên gồm sản phẩm cho alen bình thường (116bp) sản phẩm cho alen đột biến (123bp) KẾT QUẢ Kết hoàn thiện quy trình phát bệnh mẫu máu ngoại vi với gia đình bệnh nhân Đồn V T Xây dựng phản ứng ARMS-PCR với gen PKD1 Qua trình thiết kế mồi kiểm tra hồn thiện quy trình nhóm nghiên cứu đưa trình tự mồi phản ứng ARMS-PCR PCR nhằm phát trường hợp đột biến nucleotid bệnh nhân Đoàn V T sau: Sau tiến hành chạy gradient với dải nhiệt độ gắn mồi khác tối ưu nhiệt độ phản ứng ARMS-PCR: 95oC phút; (95oC 45 giây, 60oC 45 giây, 72oC phút) 30 chu kỳ; 72oC phút Thể tích thành phần phản ứng PCR bao gồm 3µl ADN tổng số; 0,5µl mồi Fm; 0,25µl mồi Rw; 0,25µl mồi Fo; 0,5µl mồi Ro; 12,5µl Mastermix tổng thể tích phản ứng 25µl Sản phẩm nhân gen ARMS-PCR sau thực xong kiểm tra điện di gel agarose 3% Hình Kết điện di sản phẩm phản ứng ARMS-PCR Giếng 1: Chứng âm, Giếng 2: Mẫu III-5, Giếng 3: Mẫu II-6, Giếng 5: Mẫu II-5, Giếng 4: Marker 100bp NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Theo kết phản ứng ARMS-PCR cho thấy, mẫu III-5 II-5 lên băng với kích thước 200bp, 227bp 371bp Mẫu II-6 thấy xuất băng với kích thước 227bp 371bp Theo đặc điểm thiết kế mồi đưa chứng tỏ mẫu II-5 III-5 mang gen đột biến gây bệnh mẫu II-6 không mang gen gây bệnh Đối chiếu với thông tin thực tế thu thập từ bệnh nhân, nhận thấy kết chẩn đoán nhờ ARMS-PCR với thực tế biểu bệnh Xây dựng phản ứng Touchdown PCR với gen PKD1 Sau tiến hành chạy gradient với dải nhiệt độ gắn mồi khác tối ưu nhiệt độ phản ứng Touchdown PCR: 95oC phút; (95oC 10 giây, 66oC 45 giây, 72oC 30 giây) 10 chu kỳ với chu kỳ giảm 1oC giai đoạn gắn mồi; (95oC 10 giây, 56oC 45 giây, 72oC 30 giây) 25 chu kỳ; 72oC phút Thể tích thành phần phản ứng PCR đơn mồi bao gồm 3µl ADN tổng số; 0,25µl mồi Fm 0,25µl mồi Fm; 0,25µl mồi Ro; 12,5µl Mastermix tổng thể tích phản ứng 25µl Kiểm tra sản phẩm phản ứng chạy Touchdown PCR điện di gel agarose 2% Hình Kết điện di sản phẩm phản ứng Touchdown PCR Giếng 1, 6: chứng âm; Giếng 2, mẫu III-5; giếng 3, 8: mẫu II-6; giếng 4, 9: mẫu II-5; giếng 5: Marker 100bp Theo kết điện di nhận thấy với mẫu III-5 II-5 lên đoạn có kích thước 116bp 123bp chứng tỏ mẫu có mang gen đột biến gây bệnh Với mẫu II-6 lên băng có kích thước 116bp chứng tỏ mẫu không mang gen bệnh Đối chiếu với thông tin thực tế thu thập từ bệnh nhân, nhận thấy kết chẩn đoán nhờ ARMSPCR với thực tế biểu bệnh Kết chạy kiểm chứng ARMS-PCR Touchdown PCR mẫu máu người thân Sau hồn thiện quy trình phát đột biến hai phương pháp ARMS-PCR Touchdown PCR mẫu II-5, II-6 III-5, tiến hành chạy mẫu máu thu thập phả hệ bao gồm: II-11; III-1; III-2; III-3; III-4; III-9; III-11; III-12 Kết thu cho thấy kết chẩn đoán phương pháp trùng khớp với với thông tin thực tế biểu bệnh mà thu thập Như vậy, phương pháp đưa kết đáng tin cậy việc chẩn đoán đột biến nucleotid CTC gen PKD1 từ vị trí 9859 đến 9861 Kết cho thấy áp dụng phương pháp để chẩn đoán mẫu phơi gia đình III-5 với III-6 sở phát đột biến gen gây ADPKD III-5 Đối với gia đình khác mang đột biến giống III-5, sử dụng ln hai quy trình hồn thiện Áp dụng quy trình hồn thiện mẫu phơi gia đình III-5 với III-6 Kết phát đột biến mẫu phơi TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 73 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Hình Kết điện di sản phẩm phản ứng ARMS-PCR Giếng 1: Chứng âm; Giếng 2: Chứng dương (III5); Giếng 3: Mẫu P1; Giếng 4: Mẫu P2; Giếng 6: Mẫu P3; Giếng 7: Mẫu P4 Giếng 5: Marker 100bp Theo kết ARMS-PCR cho thấy có mẫu P1 xuất băng có băng gen đột biến (kích thước 200bp), cịn lại mẫu phơi P2, P3, P4 xuất băng (khơng có băng gen đột biến) Như vậy, mẫu phôi P1 mang gen đột biến gây bệnh thận đa nang di truyền trội giống III-5 Hình Kết điện di sản phẩm phản ứng Touchdown PCR Giếng 1, 8: chứng âm; Giếng 2, 9: chứng dương; Giếng 3, 10: mẫu P1; Giếng 4, 11: mẫu P2; Giếng 5, 12: Mẫu P3; Giếng 6,13: Mẫu P4; Giếng 7: Marker 100bp Kết Touchdown PCR có mẫu P1 xuất băng có kích thước 116bp gen bình thường 123bp gen đột biến, lại mẫu P2, P3, P4 xuất băng 116bp gen bình thường Vì vậy, chẩn đốn mẫu P1 mang gen PKD1 đột biến giống III-5 Bằng việc áp dụng quy trình hồn thiện mẫu máu ngoại vi, tiến hành kiểm tra di truyền mẫu phôi gia đình III-5 với III6 đưa chẩn đốn cho phơi gồm phơi P1 74 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 mang gen đột biến gây bệnh giống III-5 phôi P2, P3, P4 không mang gen đột biến BÀN LUẬN Kết hồn thiện quy trình phát bệnh mẫu máu ngoại vi với gia đình bệnh nhân Đồn V T Kết phát đột biến bệnh nhân Đoàn V T nucleotid CTC gen PKD1 từ vị trí 9859 đến 986 Đây đột biến xác định gây NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG bệnh Các tác giả trước sử dụng phương pháp Long range PCR giải trình tự gen hệ để phát đột biến, phương pháp không áp dụng mẫu phôi Với phương pháp ARMS-PCR Touchdown PCR nghiên cứu áp dụng để chẩn đốn mẫu máu ngoại vi mẫu phơi Tồn mồi hai phương pháp ARMSPCR Touchdown PCR nhóm nghiên cứu tìm hiểu tự thiết kế Sau chạy song song hai phương pháp mẫu máu ngoại vi, thấy sản phẩm tạo khơng có sản phẩm phụ, chạy điện di băng sáng, rõ nét kích thước đoạn cần nhân lên Điều quan trọng kết chẩn đoán hai phương pháp trùng khớp Dùng hai phương pháp phù hợp với liệu lâm sàng thực tế người mang gen bệnh người không mang gen bệnh Như kết chẩn đốn hai phương pháp hồn tồn đáng tin cậy Với hai phương pháp sử dụng hồn tồn sàng lọc cho bệnh nhân bị bệnh thận đa nang di truyền trội mang đột biến nucleotid CTC gen PKD1 từ vị trí 9859 đến 9861 giống trường hợp Đồn V T Với thành viên cịn lại gia hệ phát sớm bệnh thận đa nang di truyền trội mang gen bệnh Điều góp phần to lớn vào việc phát hạn chế phát triển bệnh Áp dụng quy trình hồn thiện mẫu phơi gia đình Đồn V T Vấn đề làm chẩn đoán di truyền trước chuyển phơi trở thành lĩnh vực khó vật liệu di truyền dùng để chẩn đoán ít, từ vài tế bào ngoại bì ni phơi.Vật liệu di truyền làm khả thất bại nhân gen chẩn đoán cao Hơn nữa, kĩ thuật thực lần không đánh giá ổn định không kết hợp nhiều phương pháp chẩn đoán làm giảm độ xác Nếu nhân gen trực tiếp từ tế bào dẫn tới sử dụng kĩ thuật chẩn đoán Để giải vấn đề này, giải pháp chúng tơi đưa nhân tồn gen mẫu phôi sinh thiết kĩ thuật khuếch đại toàn hệ gen (Whole genome amplification - WGA) Ta thấy từ nguồn vật liệu di truyền nhiều sau nhân toàn gen nên khác với tác giả giới, chúng tơi thực đồng thời nhiều kĩ thuật khác nhằm kiểm tra kết Bên cạnh đó, sàng lọc dạng đột biến nhờ giải trình tự gen từ đầu nên việc xác định trực tiếp đột biến gen trở nên rõ ràng Chúng áp dụng thành cơng quy trình chẩn đốn trước chuyển phơi cho phơi gia đình II-5 với III-6, phát thấy phơi mang đột biến đoạn giống bố, cịn lại phơi khơng mang gen bệnh Với cách thức tương tự hồn tồn áp dụng cho đột biến điểm khác gen PKD1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua nghiên cứu xây dựng quy trình mẫu máu ngoại vi ứng dụng quy trình phơi gia đình tự nguyện tham gia nghiên cứu chúng tơi rút số kết luận sau: - Đã xây dựng quy trình phát đột biến nucleotid CTC exon 29 gen PKD1 gia đình Đồn V T phương pháp ARMS-PCR Touchdown PCR - Ứng dụng thành cơng quy trình phát đột biến thành viên mẫu phôi gia đình bệnh nhân giúp chọn lọc trước chuyển phơi Kiến nghị - Tiếp tục áp dụng quy trình xây dựng gia đình bệnh thận đa nang khác - Tiến hành sàng lọc phát đột biến gen gây bệnh thận đa nang người hiến thận chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi cho cặp vợ chồng có nguyện vọng TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 75 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG SUMMARY Study on pre-implantation genetic diagnosis of autosomal-dominant polycystic kidney disease Autosomal dominant polycystic kidney disease (APKD) is mainly characterized by progressive cystic dilatation of the renal tubules and other organs like liver, spleen, pancreas, and accounting for the endstage renal disease population Early detection and pre-implantation genetic diagnosis (PGD) of ADPKD have a great meaning for members in families of patient Our research aims to develop and apply a mutant detection process on PKD1 gene in peripheral blood samples and embryos in each specific family with polycystic kidney disease The research was conducted on a number of peripheral blood samples and embryos on the 5th day of voluntarily family One patient in this family was screened to detect exact mutations by using NGS The process of ARMS-PCR and Touchdown PCR were completed to check mutations in peripheral blood samples and embryos The process of using ARMS-PCR and Touchdown PCR has resulted in accurate identification of the carriers having the mutant gene This process is less expensive than NGS and we can be used for other ADPKD families with the same mutation Keywords: Autosomal-dominant polycystic kidney disease, pre-implantation genetic diagnosis, ARMS-PCR, Touchdown PCR TÀI LIỆU THAM KHẢO Loftus, Brendan J., et al (1999), “Genome duplications and other features in 12 Mb of DNA sequence from human chromosome 16p and 16q”, Genomics 60(3), pp 295-308 Ravine, David, et al (1992), “Phenotype and genotype heterogeneity in autosomal dominant polycystic kidney disease”, The Lancet 340(8831), pp 1330-1333 Rossetti, Sandro, et al (2012), “Identification of gene mutations in autosomal dominant polycystic kidney disease through targeted resequencing”, Journal of the American Society of Nephrology, p ASN 2011101032 Symmons, Orsolya, Váradi, András, and Arányi, Tamás (2008), “How segmental duplications shape our genome: recent evolution of ABCC6 and PKD1 Mendelian disease genes”, Molecular biology and evolution 25(12), pp 2601-2613 Tafti, Fatemeh Hajizadeh, et al (2017), “Linkage Analysis of Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease in Iranian Families through PKD1 and PKD2 DNA Microsatellite Markers”, Nephro-Urology Monthly 9(4) Torres, Vicente E., Harris, Peter C., and Pirson, Yves (2007), “Autosomal dominant polycystic kidney disease”, The Lancet 369(9569), pp 1287-1301 76 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 ... biến gen PKD1 người bị bệnh thận đa nang di truyền trội Mục tiêu 2: Áp dụng quy trình hồn thiện để sàng lọc phát sớm bệnh thận đa nang di truyền trội phôi ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối... nên việc xác định đột biến gen PKD1 gặp nhiều khó khăn Hiện Việt Nam nghiên cứu di truyền bệnh thận đa nang di truyền trội đột biến gen PKD1 PKD2 đặc biệt nghiên cứu mẫu phôi chưa thực Vì vậy, chúng... Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu phát sớm người mang gen chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi đột biến gen gây bệnh thận đa nang di truyền trội? ?? Đề tài tiến hành với mục tiêu: