Luận văn thạc sĩ khoa học tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyano bacteria

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  TRẦN THI ̣HIỀN TÁCH CHIẾT VÀ CHUYỂN HÓA CHLOROPHYLL A TỪ VI KHUẨN CYANO BACTERIA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  TRẦN THI ̣HIỀN TÁCH CHIẾT VÀ CHUYỂN HÓA CHLOROPHYLL A TỪ VI KHUẨN CYANO BACTERIA Chuyên ngành: Hố hữu Mã sớ: 60 44 27 ḶN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Đoàn Duy Tiên Hà Nội - 2011 MỤC LỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ BẢNG HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG : TỔNG QUAN 1.1 Cấu tạo tính chất hệ quang hợp 1.1.1 Cấu tạo tính chất hệ quang hợp thực vật vi khuẩn 1.1.2 Chlorophyll 10 1.2 Giới thiệu ngành vi khuẩn lam ( ngành cyanobacteria) .14 1.2.1 Sơ lƣợc vi khuẩn lam 14 1.2.2 Cấu tạo tế bào 16 1.2.3 Phân loại 16 1.2.4 Ý nghĩa thực tiễn .17 1.3 Tình hình nghiên cứu chlorophyll a nƣớc quốc tế .18 1.4 Các dẫn xuất chlorophyll a .19 1.5 Sinh tổng hợp chlorophyll a 20 1.5.1 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic .20 1.5.2 Sinh tổng hợp pyrol (porphobilinogen) 21 1.5.3 Q trình đóng vòng vòng pyrol (tetrapyrol) .22 1.5.4 Đƣa ion Mg2+ vào hệ thống vòng 24 1.6 Tổng hợp toàn phần chlorophyll a theo Woodward .25 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 27 2.1 Mục tiêu thực nghiệm .27 2.2 Xác định tính chất vật lý 27 2.2.1 Sắc kí mỏng 27 2.2.2 Phổ hồng ngoại (IR) 27 2.2.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 27 2.2.4 Phổ khối (MS) 27 2.2.5 Phổ tử ngoại .27 2.3 Nội dung nghiên cứu .27 2.3.1 Nội dung .27 2.3.2 Nội dung .29 2.3.3 Nội dung .30 2.4 Xác định cấu trúc sản phẩm phổ hồng ngoại, tử ngại khả kiến, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân phổ khối 31 2.4.1 Cấu trúc pheophytin a .31 2.4.2 Cấu trúc metyl pheophobide a 32 2.4.3 Cấu trúc chlorin e6 – trimetylester 33 CHƢƠNG : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Tách chiết chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a 34 3.2 Thực phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a .38 3.3 Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin – e6 trimetylester 42 CHƢƠNG : KẾT LUẬN .47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN PS : Hệ thống quang hợp IR : Phổ hồng ngoại UV – VIS : Phổ tử ngoại khả kiến MS : Phổ khối lượng : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H MPP : Metyl pheophobide a PP : Pheophytin a ATP : Adenosin Triphotphat NADP : Nicotinamit Adenin Dinucleotitphotphat LHC : Phức hợp thu nhận ánh sáng H – NMR DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ BẢNG Bảng 1.1: Thành phần chlorophyll khác 11 Bảng 3.1: Bảng liệu phổ 1H-NMR pheophytin a 35 Bảng 3.2: Bảng liệu phổ 1H-NMR metyl pheophobide a 39 Bảng 3.3: Bảng liệu phổ 1H-NMR chlorin e6 - trimetylester 44 HÌNH Hình 1.1: Năng lượng xạ tổng hợp phân tử hữu Hình 1.2: Các hệ thống quang hợp Hình 1.3: Hệ thống ăng ten vi khuẩn tía …………………… Hình 4: Hấp thụ ánh sáng hệ thống ăng ten thực vật ……… Hình 1.5: Caroten hệ quang hợp………….……………………… .6 Hình 1.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển màng thylakoid Hình 1.8: Cố định Cacbon C6 theo chu trình Calvin-Benson Hình 1.9: Cố định cacbon theo chu trình C4 10 Hình 1.10: Cơng thức cấu tạo chlorophyll a 11 Hình 1.11 Tế bào dị hình (*) Tảo Annabaena 15 Hình 1.12: Các hợp chất chlorophyll phổ biến tự nhiên 18 Hình 1.13: Các hoạt chất sử dụng để chữa trị ung thư liệu pháp quang 20 Hình 1.14: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glyxin sucxinyl-CoA 21 Hình 1.15: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic 21 Hình 1.16: Quá trình tổng hợp vòng pyrol 22 Hình 1.17: Sự tạo thành tetrapyrol 22 Hình 1.18: Quá trình đóng vịng tetrepyrol 23 Hình 1.19: Quá trình tạo thành protophyrin IX 23 Hình 1.20: Quá trình hình thành phân tử chlorophyll a[10,30,33] 24 Hình 1.21: Tổng hợp chlorophyll a theo Woodward 25 Hình 2.1: Chuyển hố chlorophyll a thành pheophytin a 28 Hình 2.2: Chuyển hố chlorophyll a thành metyl pheophobide a 29 Hình 2.3: Chuyển hoá trực tiếp thành metyl pheophobide a từ vi khuẩn lam 30 Hình 2.4: Chuyển hố metyl pheophobide a thành chlorin e6- trimetylester 31 Hình 3.1: Phổ hồng ngoại pheophytin a 36 Hình 3.2: Phổ UV – VIS Pheophytin a 36 Hình 3.3: Phổ khối pheophytin a 37 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR pheophytin a 37 Hình 3.5: Phổ hồng ngoại metyl pheophobide a 40 Hình 3.6: Phổ UV – VIS metyl pheophobide a 40 Hình 3.7: Phổ khối metyl pheophobide a 41 Hình 3.8: Phổ 1H – NMR pheophobide a 41 Hình 3.9: Phổ UV – VIS chlorin e6 - trimetylester 45 Hình 3.10: Phổ hồng ngoại chlorin e6- trimetylester 45 Hình 3.11: Phổ khối chlorin e6 – trimetylester 46 Hình 3.12: Phổ 1H – NMR chlorin e6 - trimetylester 46 MỞ ĐẦU Từ lâu nhà khoa học quan tâm tới việc chiết tách sắc tố từ xanh thực vật bậc cao Cách 100 năm nhà hóa học tách chất màu xanh từ gọi chúng Chlorophyll Vào năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học người Đức tất lượng sống nhờ mặt trời xanh có cách để hấp thụ lượng Tới năm 1919, ơng giải thích chức hợp chất hấp thụ lượng mặt trời Chlorophyll Thực vật bậc cao có xanh tự hấp thụ lượng xạ chuyển hóa thành lượng dự trữ thể Chlorophyll giữ vai trị vơ quan trọng trình quang hợp, chất hấp thụ lượng ánh sáng hệ quang hợp Chlorophyll chuyển lượng ánh sáng thành lượng hóa học phân tử ATP, trình xảy phản ứng chuyển dịch electron (phản ứng oxy hóa khử) Chlorophyll dẫn xuất chúng đối tượng nghiên cứu hấp dẫn trở thành lĩnh vực phát triển rộng lớn nhà khoa học quan tâm bao gồm nghiên cứu hệ thơm, khả hấp thụ ánh sáng, chuyển dời điện tích, tính chất phổ, sinh tổng hợp nghiên cứu y dược Chlorophyll dẫn xuất chúng có nhiều ứng dụng khác y học công nghiệp Trong y học, chlorophyll dùng thành phần phần ăn kiêng thuốc chữa bệnh Chẳng hạn, Cu-chlorophyllin phòng chống ung thư từ thức ăn bị thiu mốc chứa hydrocacbon mạch vòng, aflatoxin Chlorophyll dẫn xuất sử dụng chất nhạy sáng để tiêu diệt tế bào ung thư chống virus, chất chữa vết thương khử mùi hôi Chlorophyll ức chế phát triển vi khuẩn, kích thích việc phục hồi mơ bị hư hại ngăn cản tác hại chất gây ung thư Chlorophyll cịn có lợi cho hệ tiêu hóa có tác dụng dưỡng da Một số dẫn xuất chlorophyll có hoạt tính sinh học q tiêu diệt tế bào ung thư tủy, virus leukemia, u ác tính (malignant melanoma) theo chế quang trị liệu Chlorophyll cịn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis), chữa trị u xơ, giảm mùi hôi, giảm đường máu người bệnh cao tuổi Chlorophyll nhóm hợp chất đa dạng bao gồm chlorophyll (a, b, c, d,…), chlorophyll a phổ biến tự nhiên, chlorophyll hệ quang hợp thực vật bậc cao, tảo biển vi khuẩn quang hợp Trong thực vật bậc cao hệ thống quang hợp có cấu tạo phức tạp chứa nhiều loại chlorophyll khác Quá trình tách chlorophyll khỏi khó khăn phức tạp Trong loại vi khuẩn quang hợp vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn giản nên việc phân lập dễ dàng Vì tơi lựa chọn “ Tách chiết chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyano bacteria” làm đề tài cho luận văn cao học Mục tiêu luận văn tìm qui trình tách chiết chlorophyll a cách hiệu qui mơ phịng thí nghiệm chuyển hóa chúng để thu hợp chất làm trung gian cho trình tổng hợp hoạt chất chữa trị ung thư liệu pháp quang, chất màu thực phẩm, tổng hợp hợp chất hấp thụ ánh sáng sử dụng cho pin mặt trời sensor CHƢƠNG : TỔNG QUAN 1.1 Cấu tạo tính chất hệ quang hợp 1.1.1 Cấu tạo tính chất hệ quang hợp thực vật vi khuẩn Quang hợp sở lượng sống trái đất Chlorophyll hấp thụ ánh sáng mặt trời chuyển quang thành hóa trung tâm phản ứng hệ quang hợp vi khuẩn thực vật dạng NADPH ATP sử dụng để tổng hợp cacbohydrat (hình 1.1) Hình 1.1: Năng lượng xạ tổng hợp phân tử hữu Các chlorophyll hấp thụ biến quang thành hoá với hiệu suất cao Các hệ thống quang hợp (PS) (hình 1.2) phân loại theo cấu trúc trung tâm phản ứng chia thành PSI vi khuẩn lam, PSII thực vật bậc cao PS vi khuẩn tía bao gồm bốn thành phần ăng-ten thu sáng, trung tâm phản ứng, trung tâm chuyển điện tử máy cố định cacbon [3,5] Hình 1.2: Các hệ thống quang hợp.[28] Trung tâm phản ứng vi khuẩn tía gồm tiểu đơn vị protein L M liên kết với sắc tố hoạt động có đối xứng bậc hai Trung tâm phản ứng bao quanh hệ thống ăng ten thu sáng (LH1) Các electron chuyển vào trung tâm phản ứng heme-binding cytochrome (cyt) Trong PSII gồm protein D1 D2 có cấu trúc chức tương đồng với tiểu đơn vị L M trung tâm phản ứng vi khuẩn Năng lượng ánh sáng hấp thụ LHCII chuyển vào trung tâm phản ứng protein-chlorophyll CP43 CP47 Q trình chuyển dời điện tích thực phức hợp mangan để ơxi hóa nước giải phóng oxi vào khí Trong PS I, protein PsaA PsaB tạo thành heterodimer giống PSII Mỗi PsaA PsaB bao gồm trung tâm phản ứng tương đương với D1 D2 ăng ten tương đương với CP43 CP47 Điện tử lấy từ plastocyanin (PC) bên lumen chuyển đến sắt sunfua (FeS) phía stroma để khử NADP+ thành NADPH [28] Hệ thống ăng ten (hình 1.3 hình 1.4) tổ chức để thu nhận lượng chuyển electron từ trạng thái sang trạng thái kích thích chuyển tới trung tâm phản ứng nơi phản ứng quang hoá diễn Cấu tạo ăng ten LH1 bao gồm heterodimer chuỗi peptit hai phân tử chlorophyll a b LH2 bao gồm heterodimer chuỗi peptit ba phân tử chlorophyll a b Các sắc tố khác caroten (hình 1.5) khơng hoạt động hố học có chức ăng ten Hình 1.3 : Hệ thống ăng ten vi khuẩn tía.[29] Hệ thống ăng ten tăng hiệu hấp thụ photon cách tăng số lượng sắc tố để hấp thụ dải sóng từ 400nm-800nm Nếu cường độ ánh sáng mặt trời thấp, phân tử chlorophyll hấp thụ vài photon giây Bằng cách kết hợp nhiều chất màu để hấp thụ ánh sáng hiệu suất quang có giá trị cao nhất.[1,4,7,12,15,26,27,29] Hình 4: Hấp thụ ánh sáng hệ thống ăng ten thực vật [15] ß-Carotene OH Zeaxanthin HO OH O O Violaxanthin HO OH Lutein HO Hình 1.5: Caroten hệ quang hợp Trung tâm phản ứng hệ quang hợp bao gồm hàng trăm chlorophyll cặp chlorophyll có tổ chức đặc biệt, nhờ cấu tạo mà chuyển dời điện tích xảy để thực phản ứng khử NAD+ thành NADPH Phản ứng trung tâm phản ứng loại I khơng có tạo thành oxy trung tâm phản ứng loại II oxy tạo thành Trung tâm phản ứng vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis bao gồm bốn tiểu đơn vị protein (hình 1.6) nhóm hoạt động bao gồm chlorophyll dime có tổ chức đặc biệt, hai phân tử pheophytin, phân tử quinon QA, phân tử quinon QB ion sắt (Fe) Chuỗi chuyển dời điện tích Chlorophyll monome phía bên trái qua chlorophyll dime sang pheophytin đến Chlorophyll monome phía bên phải qua pheophytin phía bên phải tới Quinon A sang Fe chuyển pheophytin phía bên trái trở Chlorophyll monome ban đầu Năng lượng kích thích electron sử dụng để tổng hợp ATP cao từ ADP Đó sở chất q trình quang hợp Hình 1.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng hệ quang hợp vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis [6] Chuỗi vận chuyển điện tử hệ thống protein enzyme thơng qua electron di chuyển từ mức lượng cao mức độ lượng thấp cách điều hòa để nâng cao hiệu sử dụng lượng (hình 1.7) Trong chuỗi vận chuyển điện tử màng thylakoid bao gồm enzym khử sắt, plastoquinon oxidoreductase enzym ATP syntase Dòng electron tách từ phân tử nước tới NADP tác dụng PS Chuỗi vận chuyển proton thực qua màng thylakoid sử dụng để tổng hợp ATP Khi electron di chuyển vào chuỗi vận chuyển, protein luân phiên bị oxi hoá giải phóng proton vào màng thylakoid Nếu khơng có chuỗi vận chuyển điện tử từ trạng thái lượng cao đến trạng thái lượng thấp mát lượng xảy nhanh dẫn đến tế bào sử dụng lượng ánh sáng với hiệu suất thấp Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển màng thylakoid Cacbohydrat tổng hợp từ khí cacbonic nước pha tối máy cố định cacbon cách sử dụng xúc tác enzyme lượng từ ATP NADPH theo chu trình Calvin-Benson C6 (hình 1.8) chu trình C4 (hình 1.9) Hình 1.8: Cố định Cacbon C6 theo chu trình Calvin-Benson Cố định Cacbon dioxit theo chu trình Calvin-Benson C6 xảy stroma lục lạp gồm chuỗi phản ứng khác Pha đầu phản ứng dẫn xuất đường ribulose-1,5-bisphotphat với CO2 phân cắt dẫn xuất đường thành hai phân tử 3-photphoglyxerat Pha hai q trình tái tạo chất ribulose-5-photphat cịn pha ba phản ứng ribulose-5-photphat với ATP tạo thành ribulose-1,5bisphotphat Quá trình cố định CO2 xúc tác enzym ribulose-1,5-bisphosphat cacboxylase oxygenase (RuBisCO), phản ứng RuBisCO với O2 CO2 phụ thuộc vào nồng độ tương đối chúng Trong tất sinh vật, CO2 chất ưu tiên, nồng độ CO2 trở nên thấp nhiều so với nồng độ oxy hô hấp xảy mức độ đáng kể Hình 1.9: Cố định cacbon theo chu trình C4 Ở số loại thực vật, chất cho trình cố định CO2 phosphoenolpyruvate (PEP) theo chu trình C4 Tỷ lệ sử dụng ATP cho cố định CO2 thực vật theo chu trình C4 cao so với chu trình C6 1.1.2 Chlorophyll 1.1.2.1 Cấu tạo tính chất chlorophyll 1.1.2.1.1 Cấu tạo Có loại chlorophyll bao gồm chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c, chlorophyll d, chlorophyll e Ở thực vật bậc cao có loại chlorophyll a b; chlorophyll c, d, e có vi sinh vật, rong, tảo, vi khuẩn 10 Về công thức cấu tạo, phân tử chlorophyll a chia hai phần: nhân chlorophyll đuôi phân tử chlorophyll N N Mg N N MeOOC O O phytyl O chlorophyll a phytyl = E R R Hình 1.10: Công thức cấu tạo chlorophyll a Chlorophyll a Chlorophyll b Chlorophyll c1 Chlorophyll c2 Chlorophyll d Công thức C55H72O5N4Mg C55H70O6N4Mg C35H30O5N4Mg C35H28O5N4Mg C54H70O6N4Mg phân tử Nhóm C3 Nhóm C7 Nhóm C8 Nhóm C17 -CH=CH2 -CH3 -CH2CH3 -CH=CH2 -CHO -CH2CH3 -CH=CH2 -CH3 -CH2CH3 -CH=CH2 -CH3 -CH=CH2 -CHO -CH3 -CH2CH3 -CH2CH2COO- -CH2CH2COO-CH2CH2COO -CH=CHCOOH -CH=CHCOOH Phytyl Phytyl Phytyl Liên kết C17-C18 Đơn Đơn Kép Đơn Kép Tần suất Phổ biến Đa số thực vật Các loại tảo khác Các loại tảo khác Vi khuẩn lam (cyanobacteria) Bảng 1.1: Thành phần chlorophyll khác Nhân chlorophyll phần quan trọng phân tử diệp lục, gồm nguyên tử Mg trung tâm liên kết với nguyên tử N vịng pyrol có 11 liên kết phối trí Phần nhân chlorophyll bao gồm vòng pyrol liên kết với qua liên kết metylen, có mạch liên hợp dài, phân tử chlorophyll có khả hấp thụ ánh sáng mạnh Đi phân tử chlorophyll gốc rượu phytol có 20 nguyên tử cacbon Đi chlorophyll có tính ưa lipit nên có vai trò định vị phân tử chlorophyll màng quang hợp thilakoit có tính lipit 1.1.2.1.2 Tính chất chlorophyll  Bản chất hố học chlorophyll Chlorophyll khơng tan nước, tan dung môi hữu Khi muốn chiết xuất chlorophyll khỏi xanh phải dùng dung môi este, axeton, rượu, benzen Chlorophyll este axit chlorophyllic với hai rượu phytol metanol nên chúng có phản ứng đặc trưng este phản ứng xà phịng hố tác dụng với kiềm để tạo nên muối chlorophylat có màu xanh N N N Mg N MeOOC COO Phytyl +2NaOH N O N + CH3OH Mg N NaOOC COONa N O + C20H39OH Chlorophyll a Chlorophyll tác dụng với axit để tạo nên hợp chất pheophytin có kết tủa màu nâu, nhân Mg bị thay bới 2H Pheophytin không hoạt động huỳnh quang diệp lục Điều chứng tỏ nguyên tử Mg có vai trị quan trọng định tính chất quang hóa diệp lục 12 N NH N Mg N MeOOC COO Phytyl N +2H+ N N O MeOOC COO Phytyl Chlorophyll a + Mg2+ HN O Pheophytin a Pheophytin tác dụng với kim loại khác kim loại đẩy 2H để thay vào vị trí Mg phân tử chlorophyll tạo nên hợp chất có màu xanh bền Trong mơi trường axit mạnh, đun nóng, pheophytin bị thủy phân liên kết este với rượu phytol tạo thành hợp chất pheophorbide Sự màu diệp lục: Chlorophyll tế bào khó bị màu nằm phức hệ với protein lipit Trong dung dịch, có ánh sáng O2, chlorophyll màu phản ứng quang oxi hố  Tính quang học diệp lục Tính huỳnh quang: Khi quan sát ánh sáng phản xạ từ dung dịch chlorophyll thấy dung dịch có màu huyết dụ, tắt nguồn sáng thấy dung dịch có màu xanh cũ Tính lân quang: gần tương tự huỳnh quang khác tắt nguồn sáng ánh sáng màu huyết dụ cịn lưu lại thời gian ngắn 1.1.2.1.3 Vai trò chlorophyll hệ quang hợp Hấp thu lượng ánh sáng mặt trời: nhờ cấu trúc đặc trưng phân tử chlorophyll mà hấp thụ lượng ánh sáng với hiệu suất cao Vận chuyển lượng vào trung tâm phản ứng: từ phân tử chlorophyll hấp thu ánh sáng trung tâm phản ứng quang hợp phải qua hệ thống cấu trúc màng thilakoid gồm nhiều phân tử chlorophyll khác Năng lượng ánh sáng phải truyền qua phân tử chlorophyll để đến trung tâm phản ứng Tham gia biến đổi lượng ánh sáng thành lượng hoá học trung tâm phản ứng 13 ... loại vi khuẩn quang hợp vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn giản nên vi? ??c phân lập dễ dàng Vì tơi l? ?a chọn “ Tách chiết chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyano bacteria? ?? làm đề tài cho luận. .. MỞ ĐẦU Từ lâu nhà khoa học quan tâm tới vi? ??c chiết tách sắc tố từ xanh thực vật bậc cao Cách 100 năm nhà h? ?a học tách chất màu xanh từ gọi chúng Chlorophyll Vào năm 1913, Richard Willstatter,...? ?A? ?I HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ? ?A? ?I HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  TRẦN THI ̣HIỀN TÁCH CHIẾT VÀ CHUYỂN HO? ?A CHLOROPHYLL A TỪ VI KHUẨN CYANO BACTERIA Chuyên ngành: Hố hữu Mã sớ: