Luận văn thạc sĩ khoa học lâm nghiệp nghiên cứu các loài nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn và thông tại đại lải – vĩnh phúc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP  ĐẶNG NHƯ QUỲNH NGHIÊN CỨU CÁC LOÀI NẤM NGOẠI CỘNG SINH VỚI BẠCH ĐÀN VÀ THÔNG TẠI ĐẠI LẢI – VĨNH PHÚC LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP HÀ TÂY, 2007 ĐẶT VẤN ĐỀ Rừng tài nguyên vô quý giá quốc gia - rừng nơi sản sinh, dự trữ tái tạo vật chất Rừng Việt nam đa dạng phong phú, nguồn tài nguyên bị khai thác không hợp lý dẫn đến hậu nguy hại lũ lụt, hạn hán, xói mịn, rửa trơi…Để giảm thiểu tác hại việc trồng rừng phủ xanh đất trống đồi núi trọc, nâng cao chất lượng rừng có cơng việc quan trọng Đảng nhà nước ta có chủ trương ln khuyến khích, quan tâm đầu tư xây dựng chương trình dự án trồng rừng, cải tạo tái sinh phục hồi rừng nhằm phục hồi lại tài nguyên rừng bị suy thoái trầm trọng Theo thống kê Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, nước ta có khoảng 21 triệu đất canh tác nơng - lâm nghiệp Trong phần lớn đất có hàm lượng dinh dưỡng thấp, đặc biệt có tới 9,34 triệu đất hoang hố, có khoảng 7,85 triệu chịu tác động mạnh sa mạc hoá, chủ yếu đất trống, đồi núi trọc, bạc màu [1] Trong canh tác, việc bón phân vơ cho trồng vùng lập địa khô cằn nghèo chất dinh dưỡng làm cho đất ngày bị suy kiệt thoái hoá, trồng suy giảm suất, chất lượng sản phẩm thấp Đặc biệt rừng trồng thường trồng lập địa có pH thấp, vi sinh vật có lợi nghèo, ngược lại vi sinh vật gây bệnh cho trồng lại nhiều Bạch đàn thơng hai lồi chọn trồng loài phổ biến nước ta, chủ lực trồng rừng phủ xanh đất trống đồi núi trọc trồng rừng nguyên liệu Thông lồi đa tác dụng, ngồi việc lấy gỗ thơng cịn cho nhựa, mặt sinh thái mơi trường thơng có hình dáng tán đẹp nên thích hợp trồng vùng du lịch sinh thái, khu di tích, đền chùa….Chính diện tích trồng thơng chiếm tỷ lệ cao tổng diện tích rừng trồng nước ta [1] Bạch đàn loài mọc nhanh, ưa sáng có chu kỳ kinh doanh ngắn thích hợp cung cấp nguyên liệu gỗ nhỏ lấy tinh dầu Trong điều kiện khí hậu nóng ẩm nước ta dịch bệnh thông bạch đàn lan rộng hầu hết tỉnh, thêm vào chúng lại trồng loài lập địa nghèo thối hóa, tạo điều kiện cho sâu bệnh phát triển Vì việc chăm sóc bảo vệ rừng thơng bạch đàn đặc biệt quan tâm, nhằm tìm biện pháp phịng trừ có hiệu đảm bảo mặt kinh tế sinh thái Sử dụng nấm ngoại cộng sinh để tạo có chất lượng cao cho trồng rừng nấm cộng sinh giúp sinh trưởng phát triển tốt, phân giải chất khó tiêu thành dễ tiêu, khơng ảnh hưởng đến mơi trường sinh thái mà cịn làm tăng tính đa dạng quần thể sinh vật Từ trước đến chưa có tài liệu điều tra đầy đủ nấm ngoại cộng sinh cho bạch đàn thông Do việc điều tra thành phần loài nấm cộng sinh cho bạch đàn thông, phân lập khiết số loài nấm ngoại cộng sinh để tuyển chọn lồi, chủng có hiệu lực cộng sinh cao ứng dụng chúng sản xuất trồng rừng lập địa thối hóa nghèo chất dinh dưỡng cần thiết Từ lý tác giả tiến hành đề tài “Nghiên cứu loài nấm ngoại cộng sinh với Bạch đàn Thông Đại Lải – Vĩnh Phúc” để đưa danh lục loài nấm ngoại cộng sinh danh lục lồi cộng sinh phân lập ni cấy môi trường nhân tạo, nhằm đáp ứng nhu cầu tạo chất lượng cao cho công tác trồng rừng 3 Chương TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Trên giới Trên giới có nhiều nước quan tâm nghiên cứu ứng dụng nấm ngoại cộng sinh vào sản xuất nông lâm nghiệp Theo kết nghiên cứu cho thấy vai trò ý nghĩa nấm ngoại cộng sinh sinh trưởng phát triển điều kiện có khác Ở Mỹ, từ hai thập kỷ qua, nhà khoa học Nông - Lâm thuộc Viện Nghiên cứu phát triển nấm (IRMD) tiến hành nghiên cứu xác định vai trò ý nghĩa nấm ngoại cộng sinh với sinh trưởng phát triển điều kiện khác Hầu hết cơng trình tập trung nghiên cứu nấm Pisolithus tinctorius lẽ tính thích ứng với nhiều vùng sinh thái, nhiều lồi chủ, có khả chống chịu tốt với điều kiện bất lợi môi trường hệ sợi dễ ni cấy mơi trường nhân tạo (Schramm, 1966; Marx, 1980, 1981; Marx cộng 1984)[32] Chế phẩm nấm cộng sinh Pt sản xuất theo cơng thức thương mại hóa việc nhiễm chế phẩm cho sử dụng quy mơ lớn Các cơng trình nghiên cứu khẳng định loại chế phẩm có khả cộng sinh cao làm tăng sinh trưởng trồng Theo Marx cộng năm 1989: Bào tử nấm Pt thu từ thể nấm nhiều vùng sinh thái khác nhau, cộng sinh với nhiều loài chủ tạo cho chế phẩm bào tử có tính đa dạng mặt sinh học chế phẩm hệ sợi [33] Năm 1989 triệu nhiễm chế phẩm hệ sợi nhiều triệu nhiễm chế phẩm bào tử Ở Pháp tiến hành nhiễm nấm ngoại cộng sinh cho vườn ươm nhằm mục đích: tăng sinh trưởng cây, nâng cao hiệu việc trồng rừng nâng cao khả sản xuất nấm ăn (Le Tacon cộng năm 1986)[29] Quy trình sản xuất chế phẩm nhiễm nấm cho tương tự Mỹ Từ năm 1973 nhiễm nấm cộng sinh phục vụ cho việc trồng rừng sản xuất vườn ươm quy mô lớn mang tính thương mại Quy trình lên men cơng nghiệp áp dụng thành công việc sản xuất chế phẩm hệ sợi Các kết thí nghiệm nhiễm nấm cộng sinh cho loài vườm ươm Le Tacon cộng tổng kết năm 1985 [30] Hầu hết cơng trình nghiên cứu tập trung vào số loài đặc biệt loài kim Các loài nấm cộng sinh ý nhiều Pisolithus tinctorius, Laccaria laccata Laccaria bicolor Ở Canađa cơng trình nghiên cứu sản xuất chế phẩm nhiễm chế phẩm cho vườn ươm tập trung vào loài kim với loài nấm Pisolithus tinctorius; Laccaria laccata Laccaria bicolor Từ năm 1992 Canađa xây dựng kế hoạch lớn sản xuất đủ chế phẩm nấm cộng sinh để cung cấp cho sở sản xuất phạm vi toàn quốc Ở Philippin, De La Cruz cộng sản xuất chế phẩm nấm cộng sinh dạng viên nén bào tử loại nấm Pisolithus tinctorius Scleroderma spp để nhiễm cho loài kim loài bạch đàn Sau tháng nấm rễ thiết lập mối quan hệ cộng sinh với tỷ lệ lớn Đặc biệt với trồng loại đất nghèo chất dinh dưỡng có hàm lượng nhơm tự cao Cây 16-18 tháng tuổi nhiễm chế phẩm có đường kính tăng so với đối chứng 75%[16] Hiện chế phẩm viên nén dùng phổ biến Philippin Trong năm 1970, Venezuela người ta sử dụng lớp đất mặt rừng trồng khép tán trộn với đất vườn ươm để tạo ruột bầu sản xuất Nguồn nấm cộng sinh chủ yếu Thelephora terrestric có tự nhiên Từ đầu năm 1980, bào tử nấm Pisolithus tinctorius đưa từ bang Georgia Mỹ sử dụng để nhiễm cho vườn ươm Hiện thể nấm P.tinctorius thu hái vườn ươm đủ để sản xuất năm 100 triệu phục vụ cho chương trình trồng rừng quốc gia Thơng thường có ba dạng chế phẩm nấm cộng sinh: - Chế phẩm từ đất rừng (soil inoculum): nguồn nấm cộng sinh hoàn toàn từ tự nhiên, tồn lớp đất mặt rừng, người ta thu lớp đất mặt trộn với đất vườn ươm tạo ruột bầu để gieo Hình thức tạo chế phẩm đơn giản, tốn song có hiệu định; nhiên có nhiều bất lợi kể đến như: phá vỡ hệ sinh thái tầng đất mặt, nguồn nấm cộng sinh không tuyển chọn, hiệu lực thấp mang theo nguồn bệnh từ rừng vườn ươm - Chế phẩm bào tử (spore inoculum): Những năm 80 đầu năm 90 nước Mỹ, Canađa sử dụng bào tử hữu tính nấm cộng sinh trộn với chất mang tạo thành chế phẩm; chế phẩm có hiệu cao việc tăng sinh trưởng cho trồng Những năm sau bào tử nấm trộn với chất mang đất sét dập thành viên nén Chế phẩm dạng viên nén làm tăng tỷ lệ nhiễm nấm cộng sinh với chủ viên nén có tác dụng trì đảm bảo cho bào tử nấm cộng sinh tồn đất lâu gặp điều kiện khô hạn - Chế phẩm hệ sợi (mycelial inoculum): Các nước tiên tiến áp dụng chế phẩm hệ sợi nấm cộng sinh Hệ sợi nấm cộng sinh nuôi cấy môi trường rắn than bùn, vermiculite làm ẩm môi trường dinh dưỡng MMN Chế phẩm có nhiều ưu điểm có khă sản xuất lớn, hiệu cộng sinh cao, có nhược điểm dễ bị sinh vật hoại sinh cơng chế phẩm bón cho trồng để sử dụng nguồn dinh dưỡng thừa nuôi cấy hệ sợi dẫn đến sợi nấm dễ bị chết trước hình thành mối quan hệ cộng sinh với chủ Một dạng khác chế phẩm hệ sợi chế phẩm sợi nước (mycelial sluries) Dạng chế phẩm sản xuất quy mô công nghiệp nuôi cấy sợi nấm môi trường dinh dưỡng lỏng định kỳ lắc máy lắc để cắt ngắn sợi nấm Tuy nhiên giống chế phẩm dạng rắn dinh dưỡng trình nhân sinh khối hệ sợi cịn sinh vật hoại sinh dễ công giết chết sợi nấm Một dạng khác hệ sợi chế phẩm dạng nang (alginate beads) Nuôi cấy sợi nấm môi trường dinh dưỡng lỏng thu hệ sợi, xay nhỏ trộn với dung dịch sodium alginate cố định viên CaCl2 Sợi nấm bao bọc thể dạng keo hoàn toàn tránh bất lợi dạng chế phẩm rắn lỏng Dạng chế phẩm nang áp dụng nhiều nước giới a Rễ nấm bạch đàn Căn vào thống kê chưa đầy đủ bạch đàn có 700 lồi, phân bố chủ yếu nhiều nơi Úc, Indonesia, Philippin, Châu Á, Nam Phi Vào khoảng năm 1900 nước ta nhập giống bạch đàn Ngày bạch đàn trồng khắp đất nước với nhiều lồi dịng khác Năm 1917 người ta phát bạch đàn có nấm rễ, đến thập kỷ 50 ý (Malajczuk, 1994) [37][38] Cây bạch đàn rễ nấm mà cịn có loại nấm ngoại cộng sinh, nấm nội cộng sinh rễ nấm hỗn hợp Pryor (1956) phát lấy đất tầng mặt để chăm sóc bạch đàn dùng bột bào tử nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma flavidum Ell.Et.) rắc lên luống xúc tiến sinh trưởng Sau Redell (1984)[40]; Garbaye (1988)[24]; Malajczuk (1993) Bougher (1994) [12] tiến hành nghiên cứu chứng minh tồn kiểu rễ nấm chứng minh tác dụng xúc tiến sinh trưởng rễ nấm bạch đàn Trung Quốc nghiên cứu rễ nấm bạch đàn vào năm 1985, 1986, 1989, 1991, 1994 (Gong, 1998) Gong nghiên cứu rễ nấm ngoại cộng sinh, nấm nội cộng sinh, phân lập giống nấm, công nghệ cấy nấm chế tạo chế phẩm, thí nghiệm vườn ươm ứng dụng đồng ruộng thu kết định Theo nghiên cứu Malajzuk (1993) nấm rễ bạch đàn có 400 lồi thuộc 81 chi vùng nguyên sản Úc, có nhiều lồi Ở Irac có thơng báo nghiên cứu Ở Thái Lan phát rừng trồng bạch đàn nấm rễ ngoại cộng sinh có 19 lồi, 10 chi, họ, chủ yếu nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma) nấm mỡ đỏ (Russula), loại khác Tylopilus rubrobrunneus; Thelephora ramarioides; Amanita sp Theo điều tra Gong (1994) tỉnh phía nam Trung Quốc có 22 lồi nấm ngoại cộng sinh Trong loài Pisolithus tinctorius, Scleroderma polyrhizum, Scleroderma cepa, Cantharellus minor Laccaria amethystea, thường thấy Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam thường có Rhizopogon luteolus Pisolithus microcarpus Garbaye (1988) [24] dùng loài nấm rễ nhiễm cho bạch đàn, sau năm lượng sinh trưởng tăng 26-30% Bougher (1990) [11] cho biết điều kiện đất thiếu P bạch đàn sau bón nấm mỡ sáp (Laccaria laccafae) trọng lượng khơ tăng 21 lần Gong (1995) cho biết dùng bột bào tử nấm cổ ngựa đậu màu (Pisolithus tinctorius) bón cho bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla sau năm rừng trồng cao đối chứng 14,3%, đường kính tăng 13,7%, rừng tăng lên 3,12m3 so với đối chứng b Rễ nấm thông Căn vào thống kê lồi cây: thơng ngựa, thơng Caribaea, thơng eliotii, thơng có 168 lồi nấm rễ Trong chi nấm đỏ (Russula); nấm sữa (Lactarius); nấm gan bò (Boletus); nấm gan bò sữa (Suillus); nấm màng sợi (Cortinarius) loài nấm mọc rễ thông 8 Ngày việc nghiên cứu nấm cộng sinh Thơng caribaea tiến hành, chủ yếu có loài nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma cepa); nấm cổ ngựa vỏ cứng nứt hình (S polyrhizum); nấm bụng đen bóng (Rhizopogon piceus) Trên thơng (Pinus kesiya) có nấm nhung thơng (Tricholoma matsutake); nấm trải (Thelephora ganbajun); nấm hồng (Russula virescens) loài thuộc chi Lactarius; Amanita; Cantharellus; Rhizopogon 1.2 Ở Việt Nam Ở Việt Nam có nhiều cơng trình nghiên cứu nấm cộng sinh Nguyễn Sỹ Giao đồng nghiệp giai đoạn 1970 đến 1985 thực nghiên cứu chủ yếu thành phần loài nấm cộng sinh với lồi thơng, nghiên cứu phân lập bước đầu nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm cộng sinh để nhiễm cho vườn ươm chống bệnh vàng còi [2] Từ năm 1996 đến 2004, Phạm Quang Thu cộng tiếp tục nghiên cứu nấm cộng sinh cho thông bạch đàn, đề tài vào nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm ngoại cộng sinh xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm nấm ngoại cộng sinh dạng bột chứa bào tử hữu tính nấm Pisolithus tinctorius số vi sinh vật chức khác Chế phẩm dạng số sở sản xuất mua sử dụng nhiễm cho bạch đàn PN2 gây trồng lập địa thoái hoá, nghèo chất dinh dưỡng, cho kết sinh trưởng đường kính chiều cao khác biệt rõ rệt với cơng thức đối chứng Hiện có khoảng 1000 bạch đàn nhiễm chế phẩm nấm cộng sinh trồng số khu vực thuộc công ty Lâm nghiệp Đông Bắc tỉnh Bắc Giang Lạng Sơn [5] Về vấn đề vai trò nấm cộng sinh trồng quan tâm ý từ lâu Quy trình kỹ thuật gieo ươm thơng Bộ Lâm Nghiệp Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn ban hành năm 1983 quy định tiêu chuẩn, chất lượng thông xuất vườn phải có nấm rễ Việc ứng dụng nấm cộng sinh sản xuất thông vườn ươm sở sản xuất sử dụng lớp đất mặt rừng trồng thông khép tán trộn với đất đóng bầu nhằm lây nhiễm nguồn nấm cộng sinh có tự nhiên Cách thức đơn giản song gây khơng điểm bất lợi như: đào bới lớp đất mặt ảnh hưởng đến môi trường sống rừng trồng khép tán, mang theo khơng nguồn bệnh sẵn có tự nhiên; nguồn nấm cộng sinh khơng tuyển chọn, hiệu không cao [5] Chế phẩm nấm cộng sinh thử nghiệm vườn ươm cho thông, bạch đàn, keo, phi lao vườn ươm cho bạch đàn rừng trồng bước đầu có kết tốt Sinh trưởng chiều cao trọng lượng tươi, khô vườn ươm cơng thức thí nghiệm lớn so với công thức đối chứng; rừng trồng sinh trưởng có khác biệt cơng thức thí nghiệm công thức đối chứng thể rõ lập địa nghèo chất dinh dưỡng Rễ nấm bạch đàn Chế phẩm nấm rễ sản xuất dạng dịch thể phương pháp thủ công phịng nấm trung tâm mơi trường phát triển lâm nghiệp bền vững, trường Đại học Lâm Nghiệp, bón cho thơng bạch đàn Trong năm nghiên cứu bước đầu thấy hiệu tăng lên trung bình 1,5 lần sau tháng thí nghiệm Các loài nấm sử dụng nấm cổ ngựa vỏ cứng nhiều rễ (Scleroderma polyrhizium) nấm cổ ngựa đậu màu (Pisolithus tinctorius) nấm mỡ sáp tím (Laccaria amethystea) Các loài nấm mọc phổ biến rừng thông bạch đàn nước ta Điều hy vọng rằng, dùng nấm cộng sinh địa phương tạo chế phẩm bón cho vườm ươm làm tăng sinh trưởng trồng, phát huy tác dụng chống chịu bệnh chống chịu khô hạn điều kiện Việt Nam 10 Rõ ràng nấm cộng sinh có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng có tiền đề phát triển, nhiều vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu, công nghiệp rễ nấm cộng sinh bạch đàn nước ta phát huy tác dụng thực tiễn sản xuất Tóm lại: Nấm cộng sinh ứng dụng rộng rãi lâm nghiệp ngành trồng trọt khác Hiệu chúng nghiên cứu nhiều nước giới Bạch đàn thông hai loài chủ đạo lựa chọn nhiều chương trình dự án trồng rừng Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu mang lại kết cao công tác ứng dụng nấm cộng sinh vào trồng rừng tạo chế phẩm nấm cộng sinh phát triển Ở Việt Nam có số tác giả nghiên cứu nấm ngoại cộng sinh có nhiều kết nghiên cứu khả quan Nhưng việc điều tra chưa sâu phạm vi điều tra chưa rộng Chưa tìm nhiều lồi nấm ngoại cộng sinh Các cơng trình nghiên cứu có kết cần áp dụng rộng rãi trồng rừng Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích thu thập lưu trữ nguồn nấm ngoại cộng sinh cho việc sản xuất chế phẩm sau 11 Chương MỤC TIÊU - ĐỐI TƯỢNG - ĐỊA ĐIỂM - THỜI GIAN NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu - đối tượng - thời gian địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu - Lập khóa phân loại lên danh mục nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn thông - Bước đầu tìm hiểu hình thành rễ nấm số loài nấm phân lập với chủ bạch đàn - Tuyển chọn loài nấm ngoại cộng sinh có hiệu lực với bạch đàn 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu loài nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn thông (loài bạch đàn nghiên cứu bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla); lồi thơng nghiên cứu thông mã vĩ (Pinus massoniana) thông nhựa (Pinus merkusii)) 2.1.3 Giới hạn phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu - Điều tra nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn thông Đại Lải – Vĩnh Phúc - Địa điểm nghiên cứu: Thu thập mẫu Đại Lải – Vĩnh Phúc Những mẫu thu thập mang Phịng thí nghiệm Nghiên cứu bảo vệ thực vật rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam phân lập, giám định, tuyển chọn lưu trữ - Thời gian nghiên cứu thực từ 01/12/2006 đến 15/9/2007 2.2 Nội dung nghiên cứu - Điều tra thành phần loài nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn thông - Một số đặc điểm hình thái, giải phẫu nấm ngoại cộng sinh - Phân lập nuôi cấy nấm ngoại cộng sinh khiết phịng thí nghiệm mơi trường MMN PDA 12 - Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi lồi nấm cộng sinh ni cấy khiết - Đặc điểm hình thành rễ nấm số loài nấm phân lập chủ bạch đàn thí nghiệm invitro 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Điều tra thu mẫu 2.3.1.1 Điều tra chung Điều tra chung phương pháp áp dụng tài liệu khơng nhiều, tình hình thành phần lồi nấm cộng sinh khơng rõ u cầu điều tra khơng cần xác, tính ngẫu nhiên lớn, diện điều tra phải rộng, có tính đại diện tương đối Lồi điều tra kết hợp với điều tra tài nguyên rừng, tài nguyên thực vật, điều tra đất Thời gian điều tra nên chọn vào đầu mùa mưa, mùa hình thành nhiều thể quả, để thu nhiều thể nấm Nội dung điều tra bao gồm lồi nấm, độ nhiều tình hình nhiễm nấm rễ cây, số liệu liên quan điều kiện lập địa, địa mạo, địa chất, thực bì rừng, lồi chủ phải ghi đầy đủ, lúc cần phải thu mẫu nấm ghi vào biểu điều tra (phụ biểu 2.1) Điều tra chung mang tính khái quát giúp cho việc chọn điểm để điều tra có tư liệu cụ thể thu số mẫu 2.3.1.2 Điều tra trọng điểm Trên sở điều tra chung tiến hành điều tra trọng điểm, điều tra trọng điểm cần thiết lập ô tiêu chuẩn, độ lớn tiêu chuẩn tuỳ theo diện tích rừng; diện tích rừng 5ha nên thiết kế dạng 2x2m Nói chung tổng diện tích dạng không nhỏ ô tiêu chuẩn 1% Cách xếp dạng ngẫu nhiên, bàn cờ hay kiểu hoa mai, ô dạng đánh số thứ tự Điều tra trọng điểm tiến hành định kỳ, theo mùa nói chung mùa khơng mưa 15-20 ngày quan sát lấy mẫu lần, mùa mưa rút ngắn 5-10 ngày 13 lần Bởi thể nấm thường xuất vào mùa mưa, biến đổi chủng loại lớn, thời gian tồn đất ngắn, thời gian giãn cách dài ảnh hưởng đến kết Nội dung điều tra thành phần lồi cần điều tra chủng loại thể quả, tập tính sinh trưởng sinh thái, độ nhiều quan hệ với rễ, loài chủ, tuổi nội dung quan trọng, việc xác lập quan hệ rễ nấm quan trọng; thể nấm rừng khơng thiết nấm cộng sinh, có hoại sinh ký sinh, muốn xác định quan hệ rễ nấm phải tiến hành kiểm tra dấu vết bó sợi, phải đào từ gốc thể bỏ đất cát, vào bó sợi đào tiếp phát chúng nối liền với rễ chứng minh bước đầu có quan hệ cộng sinh Cũng có nấm khơng hình thành bó sợi có hình thành bó sợi khó phát mắt thường, phải tiến hành giải phẫu rễ để quan sát, mẫu nấm thu hái cần phải ghi chép mục phụ biểu 2.2 Tần suất xuất loài nấm cộng sinh chia làm cấp: phổ biến (ký hiệu +++) có 50% số lần điều tra thu mẫu, phổ biến (ký hiệu ++) có từ 30 đến 50% số lần điều tra thu mẫu nấm phổ biến (ký hiệu +) có 30% số lần điều tra thu mẫu nấm loài Nội dung điều tra mô tả đặc điểm nhận biết nấm, đặc điểm phân bố, loài chủ, tuổi quan trọng, việc xác lập quan hệ nấm với chủ thơng qua kiểm tra dấu vết bó sợi 2.3.2 Giám định mẫu Quan sát kính hiển vi kính soi mơ tả đặc điểm hình dạng, màu sắc, kích thước bào tử, sợi nấm, sẹo, thể sợi nấm đối chiếu với mô tả tác giả Mark Brundrett, Neale Bougher, Bernie Dell, Tim Grove Nick Malajczuk, năm 1996, [13] để định danh lồi nấm ngoại cộng sinh Lập khóa phân loại lên danh lục dựa theo cách phân loại tác giả Kendrick (1992) [26]và Hawksworth et al (1995) [25] 14 2.3.3 Nghiên cứu hình thái, giải phẫu nấm ngoại cộng sinh Dưới kính soi tiến hành chụp ảnh, mơ tả đặc điểm hình thái bên ngồi mầu sắc tán nấm, phiến nấm, cuống nấm, dấu hiệu vòng nấm, bao nấm, tàn dư tán nấm, theo Largent et al 1977 [28] Sử dụng dụng cụ kính hiển vi, lam kính, lamen, dung dịch shear để soi bào tử, chụp ảnh mô tả bào tử nấm 2.3.4 Phân lập nấm ngoại cộng sinh - Môi trường phân lập nấm ngoại cộng sinh môi trường MMN, PDA Môi trường MMN (Modified Melin Norkans medium) (Marx 1969)[35] Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) (Difco Laboratories 1953) [17] - Máy móc để phân lập: Tủ cấy nấm Sanyo, tủ định ôn Sanyo, tủ lạnh Sanyo, tủ sấy, bếp điện, nồi hấp Hyrayama, máy ảnh Olympus 3.3, kính hiển vi soi Olympus SZ-PT, kính hiển vi olympus BX50 - Dụng cụ để phân lập: Đèn cồn, que cấy nấm, hộp petri, ống nghiệm, bông, băng hộp petri, dao, bút ghi thủy tinh… - Môi trường cần thiết để phân lập dựa hai môi trường MMN môi trường PDA Với môi trường sau pha xong hấp khử trùng 121oC thời gian 20 phút sau đổ vào hộp lồng vô trùng Phân lập từ thể nấm ngoại cộng sinh: Chọn mô nấm thường nối cuống tán, chọn tươi mới, non chưa xoè tán, không bị sâu bệnh (Zak&Bryan 1963)[43]; Chu-Chou 1979 [15]; Erland & SưderstrƯm1990a [19] Sau thể thu hái phân lập ngay, mẫu khơng làm có điều kiện phân lập phải gói mẫu bảo quản tủ định ôn nhiệt độ 10oC, không để 2-3 ngày phân lập không thành công Khi cấy dùng 70% cồn rửa bề mặt trước lúc cấy, dụng cụ cấy phải khử trùng, trình cấy phải thực đèn cồn tủ vô trùng Sau cấy xong cất giữ mẫu tủ 15 định ôn nhiệt độ 25oC (Marx & Kenney 1982) [36]; Marx 1991[34]; Castellano 1994 [14]; Kuek 1994 [27] Nuôi cấy môi trường khiết: Sau phân lập sợi nấm mọc nhanh chậm tuỳ theo loài nấm Khả bị nhiễm khuẩn cao nên cấy, phải dùng cồn khử trùng tay, vô trùng dụng cụ tủ cấy Khi sợi nấm mọc tách để tránh nấm tạp, vi khuẩn… Sau tách sợi nấm 2- lần, sợi nấm không bị nhiễm khuẩn, nấm tạp, sợi nấm mọc đồng lúc sợi nấm khiết (Fries 1987, 1983a 1983b, 1978) [20][21][22][23] Tiến hành theo dõi chụp ảnh, mô tả đặc điểm hệ sợi đo tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm, tiến hành đo lần sau ngày bắt đầu cấy, tiếp sau đo sau 10 ngày đo sau 20 ngày Độ dầy hệ sợi đánh giá theo Schwantes năm 1971[41] 2.3.5 Nghiên cứu hình thành rễ nấm với bạch đàn phịng thí nghiệm Lựa chọn lồi nấm ngoại cộng sinh bạch đàn cách thí nghiệm: - Tiến hành thí nghiệm mơi trường nhân tạo để kiểm tra khả cộng sinh nấm rễ Sử dụng đĩa Petri (140x20cm); ống nghiệm bình tam giác Mơi trường sử dụng để kiểm tra có chứa đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển nitơ, photpho, canxi, magie, sufat, kali, bo, kẽm, mangan, đồng, mo… sử dụng 0,8% agar để làm đơng mơi trường, 0,01% glucose nấm phát triển - Xử lý hạt số hóa chất: theo Normand & Fortin (1982) [39] sử dụng 30% H2O2; sử dụng cồn 70% NaOCl 5% Để đạt hiệu cao tiến hành khử trùng bề mặt phương pháp kép, lần đầu sử lý hạt H2O2 30% từ 5-30 phút sau dùng HgCl2 1% khử trùng phút 16 Rửa lại nước cất 2-3 lần, tiến hành cấy hạt môi trường (Malajczuk &Hartney 1986 [31]; Burgess et al 1994 [10] - Khi hạt khử trùng sử dụng dụng cụ vô trùng đưa hạt vào đĩa petri có sẵn mơi trường PDA, nhằm loại bỏ nấm tạp vi khuẩn xâm hại trước đưa vào bình tam giác ống nghiệm cấy nấm Sau khoảng 2-3 ngày hay lâu tùy điều kiện môi trường lựa chọn hạt nứt nanh khơng nhiễm nấm khuẩn cho vào bình tam giác cấy sẵn nấm 2.3.6 Đánh giá hiệu sử dụng nấm ngoại cộng sinh Quá trình thực trồng vào bình trên, làm thí nghiệm với mẫu quan sát mẫu đối chứng, để đánh giá khả sinh trưởng chúng so với đối chứng, nhằm tuyển chọn lồi có hiệu lực với bạch đàn (Wong& Fortin 1989)[42]; Peterson & Chakravarty (1991) [18] Với mẫu thử nghiệm dung lượng quan sát 30 mẫu, tiến hành đo chiều cao vút để so sánh mẫu mẫu đối chứng Số lần đo lần thời điểm khác sau 15 ngày; 25 ngày; 35 ngày tiếp nấm Kết thu được xử lý phần mềm SPSS 15.0 [3] 17 Chương ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN – KINH TẾ - XÃ HỘI KHU VỰC NGHIÊN CỨU 3.1 Điều kiện tự nhiên khu vực nghiên cứu 3.1.1 Vị trí địa lý Khu vực nghiên cứu thuộc trung tâm khoa học sản xuất Lâm Nghiệp Đông Bắc Bộ, thuộc địa bàn xã Ngọc Thanh - huyện Mê Linh - tỉnh Vĩnh Phúc cách Thành phố Hà Nội 50km phía Tây Bắc Khu vực trung tâm nằm vị trí vĩ độ 21º22’B; kinh độ 105º45’ Đ Phía Bắc phía Tây giáp huyện Bình Xun, phía Tây phía Nam giáp Hồ Đại Lải, phía Đơng giáp xã Minh Trí - huyện Sóc Sơn 3.1.2 Địa hình Tồn trung tâm thuộc vùng đồi núi thấp, độ cao trung bình so với mực nước biển 25m – 30m, cao đỉnh Tam Tương cao 396m Ở đỉnh núi cao, sườn có độ dốc 20o – 30o, lại dốc 20o, địa hình nhìn chung chịu chi phối dãy núi chạy dọc theo hướng Đông Bắc Tây Nam, bị chia cắt thành thung lũng hẹp 3.1.3 Điều kiện khí hậu khu vực nghiên cứu Theo tài liệu thu thập trạm khí tượng thuộc Trung tâm Khoa học sản xuất Lâm nghiệp Đông Bắc Bộ đặt trung tâm khu vực nghiên cứu nằm vùng khí hậu nhiệt đới mưa mùa, mùa mưa từ tháng đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng năm sau, chịu ảnh hưởng hai loại gió gió mùa Đơng - Bắc gió mùa Đơng – Nam Số liệu yếu tố khí tượng trình bày Biểu 3.1 18 Biểu 3.1: Tổng hợp yếu tố khí tượng Trung tâm khoa học sản xuất Lâm nghiệp Đông Bắc Bộ Nhiệt độ khơng khí Nhiệt độ đất Bốc Mưa Độ ẩm KK Tháng TB Tối Tối cao thấp TB TB TB Tối Tối cao thấp TB TB P(mm) Số ngày (mm) (%) 16,2 17,9 14,5 18,3 23,1 10,9 9,6 3,8 71,5 86 17,7 19,1 15,9 19,9 22,7 12,3 32,1 5,3 65,9 87 19,7 21 18,1 21,8 25,2 14,5 52,7 5,9 63,4 88 23,9 25,2 20,2 25,8 29,8 18,2 84,6 11,8 66,4 90 27,2 29,4 25,4 30 36,2 20,6 165,6 11,3 92,8 88 29,3 31,5 27,1 33 38,2 22,8 311,4 16,8 93 86 29,4 31,5 27 32,6 37,5 23,8 313,1 19,5 84,6 89 28,3 30,5 26,1 31,8 36 22,2 203 12 75,3 91 27,5 29,6 25,1 31,2 37 20 163,1 10 92,8 88 10 25,6 27,1 22,2 29,1 34,6 17,8 71,7 115,1 84 11 21,9 24 19,2 25,2 30,1 15,1 40,7 4,2 96,1 83 12 17,7 20,2 15,3 20,8 25,3 11,5 16,9 2,8 93,1 82 TB 23,6 25,6 21,5 26,6 31,3 17,5 1456,6 130 84,2 87 Từ biểu tổng hợp số liệu cho ta thấy nhiệt độ khơng khí trung bình năm 23.6ºC, nhiệt độ tối cao trung bình năm 25,6ºC, tháng có nhiệt độ tối cao trung bình lớn tháng tháng (31,5ºC) Nhiệt độ khơng khí 19 tối thấp trung bình năm 21,5ºC, tháng có nhiệt độ khơng khí tối thấp trung bình năm tháng (14,5ºC) - Chế độ mưa: Lượng mưa bình quân năm 1.456,6mm, phân bố không đồng năm Tổng số ngày mưa năm 130 ngày, lượng mưa cao vào tháng tháng Lượng mưa thấp vào tháng 1, tháng có lượng mưa thấp 9,6mm Mùa mưa từ tháng đến tháng 10 chiếm 80% lượng mưa năm - Lượng bốc hơi: Tháng có lượng bốc lớn tháng 10 (115,1mm) Tháng có lượng bốc nhỏ tháng (63,4mm), lượng bốc trung bình tháng 84,3mm, tổng lượng bốc 1.016,6mm Các tháng có lượng bốc lớn lượng mưa 1, 2, 3, 10, 11 12 Mưa tập trung theo mùa bề mặt địa hình dốc chia cắt nên lượng nước giữ lại đất không lớn, nước thường bị thiếu tháng mùa khô, điều ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển cung cấp nhựa thông nhựa - Chế độ gió: Gió mùa Đơng Bắc gió hoạt động từ tháng 11 đến tháng năm sau, gió mùa Đơng Nam thường thổi từ tháng đến tháng 10 Mang theo nước, ẩm, thời gian mùa mưa nóng thuận lợi cho sinh trưởng phát triển Khí hậu nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến phân bố tự nhiên, sinh trưởng, phát triển trồng khơng khí hậu cịn ảnh hưởng đến việc sản xuất tích luỹ chất hữu cơ, nhựa nhiều loài thực vật Qua tài liệu khí hậu khu vực Đại Lải ta thấy khí hậu thuận lợi cho thông nhựa sinh trưởng, phát triển 3.1.4 Điều kiện đất đai Nền địa chất bao gồm đá mẹ phiến thạch, phiến sa, sa thạch có tảng thạch xen kẽ tạo thành lớp phủ phong hoá không  ... rễ nấm số loài nấm phân lập với chủ bạch đàn - Tuyển chọn loài nấm ngoại cộng sinh có hiệu lực với bạch đàn 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu loài nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn. .. gian nghiên cứu - Điều tra nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn thông Đại Lải – Vĩnh Phúc - Địa điểm nghiên cứu: Thu thập mẫu Đại Lải – Vĩnh Phúc Những mẫu thu thập mang Phịng thí nghiệm Nghiên cứu. .. lý tác giả tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu loài nấm ngoại cộng sinh với Bạch đàn Thông Đại Lải – Vĩnh Phúc? ?? để đưa danh lục loài nấm ngoại cộng sinh danh lục lồi cộng sinh phân lập ni cấy môi trường