Đồ án tốt nghiệp ứng dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh macrobrachium rosenbergii (de man, 1879)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CÔNG NGHỆ RNA INTERFERENCE VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI GIỚI TÍNH TƠM CÀNG XANH Macrobrachium Rosenbergii (De Man, 1879) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : Nguyễn Thị An Cán hướng dẫn : Th.S Bùi Thị Liên Hà MSSV: Lớp: 08DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) lồi tơm nước có giá trị quan trọng đóng vai trị lớn nghề ni trồng thủy sản nhiều nước nhiệt đới cận nhiệt đới Trong năm gần đây, việc nuôi tôm xanh Việt Nam phát triển cách mạnh mẽ, đặc biệt khu vực nuôi tôm thương mại lưu vực sông Mê Kông mở rộng 8000 sản lượng đạt 10000 năm 2010 (Hai, 2010) Do nhu cầu giống cho việc nuôi đại trà lớn Tuy nhiên, nghề nuôi tôm xanh gặp nhiều khó khăn đặc điểm sinh học chúng Những tôm xanh đực thường lớn nhanh gấp bốn năm lần tôm quần thể thời gian nuôi, điều dẫn tới cạnh tranh thức ăn, môi trường sống gây tượng ăn thịt đồng loại Thông thường, khác kích thước tơm thấy mắt giai đoạn trưởng thành giới tính, ngưng phát triển tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản (Cohen, 1984), đực tiếp tục phát triển đạt kích thước lớn so với trưởng thành Những vấn đề ảnh hưởng tới sản lượng thu hoạch lợi ích kinh tế kích thước tơm lớn giá thành cao Việc ni tơm xanh tồn đực đạt sản lượng cao việc ni tồn hay đực quần thể (Sagi Ra’anan, 1988) Khối lượng trung bình quần thể 473 g/m2, 248 g/m2 260 g/m2 Những nhà khoa học Ả Rập Xê Út báo cáo kết tương tự tiến hành thí nghiệm ni tơm tồn đực, tồn hỗn hợp đực (Siddiqui, 1997) Điều thể việc ni tơm xanh tồn đực làm tăng sản lượng cách đáng kể mang lại lợi nhuận cao việc ni tồn hay hỗn hợp đực Vì thế, việc nghiên cứu phát triển số kỹ thuật tạo quần thể tơm xanh tồn đực nhu cầu cần thiết Đồ án tốt nghiệp Kỹ thuật bất hoạt RNA (Guo Kempheus, 1995) sử dụng công cụ hiệu để hiểu rõ chức gene quy định tính trạng cách tiêm RNA mạch đôi vào thể giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008) Ý tưởng tạo giả cách làm bất hoạt RNA thơng tin mã hóa gene tuyến đực insuline–like tơm xanh (Macrobrachium rosenbergii insulin–like androgeneic gland, Mr–IAG) RNA mạch đôi (dsRNA) thực thành công quy mơ phịng thí nghiệm (Ventura ctv, 2009) Kể từ đó, kỹ thuật bất hoạt RNA hứa hẹn hướng tiếp cận để tạo quần thể tơm tồn đực cho việc ni tơm xanh thương mại Chính lý mà đề tài “Ứng dụng thử nghiệm công nghệ iRNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii” tiến hành 1.2 Mục đích đề tài Mục đích việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật bất hoạt RNA để tạo giả phục vụ cho cơng tác tạo tơm xanh tồn đực với Mr–IAG gene mục tiêu 1.3 Nội dung đề tài Nghiên cứu công nghệ bất hoạt RNA thơng qua quy trình tổng hợp double stranded RNA theo Kit hãng Promega Ambion Kiểm tra hiệu sợi đôi dsRNA thực nghiệm chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan tuyến đực tôm xanh Macrobrachium rosenbergii 2.1.1 Phụ đực Phụ đực quan giao cấu tơm xanh đực xuất chân bơi thứ hai Chồi phụ đực bắt đầu xuất vào giai đoạn khoảng 70 ngày tuổi sau giai đoạn postlarve (trọng lượng 0,38g; tổng chiều dài 3,7 cm) đến giai đoạn 94 ngày tuổi phụ đực phát triển đầy đủ (Chung Quang Trí, 2006) Hình 2.1 Chân bơi thứ tơm xanh đực 2.1.2 Tuyến đực Những tế bào thuộc tuyến đực quan sát Faxon (1884) tôm nước Cambarus montanus (Faxon, 1884) Tuyến hormon xác định sau giáp xác Orchestia gammarellus vào 1953 mơ gọi tuyến đực (Charniaux–Cotton, 1953) Những nghiên cứu sau cho thấy rõ tuyến đực, lớp mơ mỏng gắn phần cuối ống dẫn tinh tôm nước Procambarus blandingii, P viaeviridis, Camb bartonni Camb diogenes (Puckett, 1964) Những cấu trúc tương tự quan sát cua Scylla serrata (King, 1964) Ở giáp xác tinh sào nơi tạo tinh trùng quan tạo hormon tuyến đực Nếu đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục (tinh sào) có hai chức tạo tinh trùng nội tiết testosterone tơm xanh nhiều động vật giáp xác thuộc mười chân Decapoda khác hai chức Đồ án tốt nghiệp thực hai quan riêng lẻ Tinh sào tôm xanh chuyên tạo tinh, tuyến đực (androgenic gland) – quan biệt lập khác có chức tiết hormon, tham gia vào biệt hố giới tính phát triển đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước tăng trưởng (Sagi, 2001) Ở tơm đực lớn người ta thấy tuyến đực tương đối rõ Đó khối tế bào có hình kim tự tháp, dính với phần sau ống phóng tinh Cũng tuyến sinh dục ống dẫn tinh, tuyến đực chịu ức chế tuyến nội tiết nằm cuống mắt tơm Hình 2.2 Tuyến đực tơm xanh có hình kim tự tháp cuối ống dẫn tinh Sự tồn tuyến đực xác nhận nhiều loài giáp xác, chúng tiết hormon có tác động lên biệt hố giới tính (Chaniaux–Cotton Payen, 1985; Katakura, 1989) Tuyến AG có vai trị lên biệt hóa giới tính trình lột xác Charniaux– Cotton chứng minh việc cắt bỏ tuyến AG Orchestia gammarella làm giảm sinh tinh trùng đực (Charniaux–Cotton, 1954) 2.1.3 Hormon tuyến đực Hormon tuyến đực tinh chế tìm nhóm giáp xác chân Armadilidium vulgare protein gồm có ba chuỗi peptid A (chứa 29aa), B (44aa), C (45aa), chuỗi A aa thứ 18 cịn có thêm nhóm carboxyl (Martin ctv, 1999) Trọng lượng phân tử hormon khoảng 16.570 Da Khi tiến hành tiêm hormon tuyến đực cho nhỏ, sau này phát triển thành đực, cho giao vĩ với có chức sinh sản cho hệ Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3 Cấu trúc phân tử hormon tuyến đực (Martin ctv, 1999) 2.1.4 Tác động tuyến đực lên phân hóa giới tính tơm xanh Tuyến androgenic (AG) quan nội tiết đực, có vai trị quan trọng việc hình thành giới tính đặc tính sinh dục thứ cấp (Ohs ctv, 2006) AG nằm cuối ống dẫn tinh, gần lỗ mở sinh dục liên kết lõng lẻo với ống dẫn tinh AGH hormon điều khiển biệt hóa giới tính thành đực phát triển đặc điểm sinh dục đực thứ cấp Sự tiết GSH GIH cho quy định số chất dẫn truyền thần kinh tác động trực tiếp vào buồng trứng Ở đực, GIH tác động lên tinh hoàn gián tiếp điều khiển AG sau giảm tiết AGH Hormon kích thích tuyến sinh dục cần thiết để có sinh tinh xảy tinh hoàn (Fingerman, 1997) AG tham gia vào q trình biệt hóa giới tính đực thơng qua việc tiết hormon AGH tín hiệu ban đầu tất bước cần thiết trình biệt hóa giới tính phát triển đặc điểm đực (Ohs ctv, 2006) Nếu khơng có AG tiết AGH khơng đủ tuyến sinh dục biệt hóa thành tuyến sinh dục (Sagi ctv, 1995) Sự phát triển AG cho dấu hiệu tín hiệu di truyền (Ohs ctv, 2006) Sự cắt bỏ tuyến androgenic tôm xanh Macrobrachium rosenbergii giai đoạn cịn non gây đảo giới hồn tồn, với hóa tính trạng sinh dục sơ cấp thứ cấp vật sinh sản (Sagi ctv, 1990; Sagi ctv, 1997) Đồ án tốt nghiệp 2.2 Cơng nghệ chuyển đổi giới tính tơm xanh 2.2.1 Cơ sở lý thuyết tạo dịng tơm xanh tồn đực Cặp nhiễm sắc thể giới tính tôm xanh đực đồng giao tử (ZZ) dị giao tử (WZ) Để tạo dòng đơn tính tồn đực (100% tơm đực ZZ) cần có tơm bố tơm mẹ có NST ZZ Để tạo dịng tồn đực việc cần thiết để tạo tôm giả mang NST ZZ Male: ♂ (ZZ) X Female: ♀ (ZZ) 100% ♂ (ZZ) Hình 2.4 Sơ đồ tạo dịng đơn tính đực Sagi Cohen cho biết cho chuyển giới khoẻ mạnh lai với đực thông thường cho dịng tồn đực (Sagi, Cohen, 1990) 2.2.2 Các phương pháp tạo tôm xanh giả 2.2.2.1 Vi phẩu loại bỏ tuyến đực Tơm chưa trưởng thành thực vi phẫu loại bỏ tuyến androgene tôm đực, dẫn đến tạo trứng, phát triển vòi trứng lỗ sinh sản đực chuyển giới giai đoạn phát triển cịn non Tơm đực sau phát triển thành (Nagamine ctv, 1980) Việc loại bỏ AG đực, làm AGH gây nên tượng: đực thành mang NST ZZ Kỹ thuật vi phẫu loại bỏ tuyến androgenic thực lần Sagi (Sagi ctv, 1990) Ở Việt Nam, kỹ thuật vi phẫu thực thành công năm 2004 (Nguyễn Văn Hảo ctv, 2004) Kỹ thuật vi phẫu kỹ thuật tạo tơm giả để sản xuất tơm tồn đực phổ biến Tuy nhiên kỹ thuật cần có kỹ thuật viên có tay nghề cao, cần nhiều người để sản xuất số lượng tôm giả lớn, chi phí sản xuất lớn, tỷ lệ tơm vi phẫu thành tơm giả sinh sản khơng ổn định Vì vậy, cần tìm phương pháp để cải thiện hạn chế kỹ thuật vi phẫu nhằm tạo nguồn tơm tồn đực để tăng sản lượng cho người nuôi Đồ án tốt nghiệp 2.2.2.2 Cấy tuyến đực vào tôm Sự biệt hóa giới tính ngược isopod Armadillidium vulgare, gây việc cấy AG vào cái, sau bắt đầu biệt hóa hình thái giới tính Ở tơm xanh, việc cấy AG đực trưởng thành vào chưa trưởng thành, kết biệt hóa ngược thành đực (Nagamine ctv, 1980) Tuy nhiên, khả sống sau cấy AG thấp (Ohs ctv, 2006) 2.2.2.3 Sử dụng hormon Hiện nay, steroid sử dụng để thay đổi kiểu hình giới tính cá ngâm tiêm qua chế độ ăn trước biệt hóa giới tính Điều mang lại hy vọng việc sử dụng hormon để điều khiển giới tính động vật giáp xác Điều khiển chế độ ăn chứa hormon xem phương pháp thiết thực quy mô thương mại Tuy nhiên, phương pháp mang lại thách thức khả hormon rò rỉ từ viên thức ăn từ cố tiêu hóa, đặc biệt thay đổi thức ăn chế biến trước tiêu thụ (Ohs ctv, 2006) Dewi cộng dùng hormon 17β–estradiol bổ sung vào thức ăn để điều khiển giới tính tơm xanh Kết thu 17β–estradiol không ảnh hưởng đến tỷ lệ đực tôm xanh (Dewi ctv, 2006) Baghel cộng nghiên cứu ảnh hưởng chuyển đổi giới tính cho ấu trùng tơm xanh ăn artemia làm giàu với 17α–methyltestosterone, dạng steroid động vật có xương sống, kết cho thấy 17α–methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính tơm xanh từ thành đực (Baghel ctv, 2004) Nhưng sau đó, Ohs cộng dùng 17α–methyltestosteron bổ sung vào thức ăn để chuyển giới tính tơm xanh Tuy nhiên, kết lại cho thấy 17α– methyltestosteron khơng có tác dụng việc chuyển đổi giới tính tôm xanh (Ohs ctv, 2006) Như vậy, 17α–methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính tơm xanh chưa xác định Ohs cộng cho hậu ấu trùng tôm xanh thường (50% đực, 50% cái) ăn thức ăn có bổ sung dopamine với nồng độ 0,15; 1,5; 15 ppm vòng 60 ngày (Ohs ctv, 2006) Kết nhóm đối chứng có tỷ lệ tơm 62,6%, Đồ án tốt nghiệp nghiệm thức cho tôm ăn thức ăn bổ sung dopamine với nồng độ 0,15; 1,5 15 mg/kg có tỷ lệ tơm là: 80,9%; 88%; 71% Kết cho thấy có chênh lệch đáng kể nhóm khơng có cho ăn thức ăn có bổ sung dopamine Thử nghiệm tạo tiềm sử dụng dopamine để tạo tơm xanh tồn đực phục vụ cho sản xuất 2.3 Giới thiệu cộng nghệ iRNA ứng dụng tạo tôm xanh giả 2.3.1 Giới thiệu iRNA Công nghệ iRNA gây bất hoạt gene công cụ đầy hứa hẹn chế điều khiển hoạt hóa gene phổ biến thể sống nhân thực iRNA trình làm bất hoạt gene cách đặc thù, làm bất hoạt gene (gene đích) có trình tự tương đồng với tác nhân gây bất hoạt gene (các sợi RNA ngắn khoảng 21–27 nucleotide) iRNA tham gia điều khiển hoạt hóa gene giai đoạn phiên mã gene – ngăn cản sinh tổng hợp RNA giai đoạn sau phiên mã – phân hủy mRNA làm triệt tiêu sinh tổng hợp protein (Đỗ Năng Vịnh, 2007) Can thiệp RNA (iRNA) sợi đơi RNA (dsRNA), có tác động đặc hiệu với trình tự mục tiêu, thúc đẩy phân hủy ngăn chặn biểu trình tự mục tiêu (Chen ctv, 2003) Sự can thiệp RNA thông qua trung gian dsRNA chế bất hoạt gene sau phiên mã (PTGS) bảo tồn suốt q trình phát triển Nó biểu mức độ phiên mã dịch mã trình chép nội sinh mức nhiễm sắc cách hình thành vùng chất nhiễm sắc thể nhân (Hannon, 2002) iRNA tượng Neurospora crassa, trình tự RNA tương đồng có khả chế ngự gene nội sinh (Romano Macino, 1992) Dựa thành tựu chương trình Geneomics trình tự hầu hết gene quan trọng xác định, từ thiết kế dsRNA tương đồng để gây bất hoạt gene đích Cơng nghệ iRNA tạo cách mạng nghiên cứu y sinh chữa bệnh Ý nghĩa khoa học tiềm ứng dụng to lớn công nghệ iRNA nhiều tác giả đề cập, họ cho “một công nghệ đầy uy lực”, “cuộc cách mạng iRNA” (Archana, 2003; Ajit, 2007) Năm 1998, hai nhà Đồ án tốt nghiệp khoa học Mỹ Fire Mello xuất cơng trình nghiên cứu đột phá chế gây bất hoạt gene iRNA đăng tạp chí Nature (Fire Mello, 1998) 2.3.2 Lịch sử nghiên cứu iRNA Trong lịch sử, can thiệp RNA hay iRNA biết đến với tên gọi khác : RNA silencing, quelling, cosuppresion, RNA inteference Lần đầu tiên, nhà nghiên cứu nhận thấy RNA sense có hiệu RNA antisense việc ức chế biểu gene loài giun với tên khoa học C elegans (Guo Kemphues, 1995) Nghiên cứu iRNA mô tả tượng C.elegans, cách tiêm dsRNA vào C elegans dẫn đến bất hoạt trình tự gene đặc hiệu tạo thuật ngữ “iRNA – Can thiệp RNA” (Fire ctv, 1998) Nghiên cứu trình bất hoạt gene hậu phiên mã (PTGS) thực vật báo cáo Hamilton Baulcombe (Hamilton Baulcombe, 1999) Phát hiện tượng PTGS trồng khả kháng virus gây dsRNA Hiện tượng bất hoạt gene sau dịch mã có tương quan với phân tử RNA nhỏ (mỗi phân tử có chiều dài khoảng 21–25 nucleotide) Trong quần thể phân tử RNA nhỏ có trình tự sense RNA antisense RNA (Hamilton Baucombe, 1999) Quá trình xử lý dsRNA mạch dài thành đoạn ngắn 21–23 nucleotide nhờ enzyme Dicer RNase III ruồi giấm Drosophila (Zamore ctv, 2000) Lần mô tả iRNA tế bào động vật có vú (Tuschl ctv, 2001) Nghiên cứu đoạn RNA ngắn có cấu trúc kẹp tóc (shRNAs) nguyên nhân gây bất hoạt trình tự đặc hiệu tế bào động vật có vú (Paddison ctv, 2003; Sui ctv, 2003; Paul ctv, 2003) Bài báo cáo cho đoạn iRNA nhỏ sử dụng chữa bệnh động vật có vú (Song ctv, 2003) Những đoạn iRNA nhỏ có khả bất hoạt gene mức độ phiên mã thông qua methyl hóa DNA de novo người (Kawasaki, Taira ctv, 2004) Đồ án tốt nghiệp iRNA kiểm soát hoạt hóa gene giai đoạn phiên mã (TGS – transcriptional gene silencing), phân tử siRNA ngăn cản phiên mã khống chế số lượng phân tử mRNA Cơ chế xảy nhân tế bào mục tiêu tác động DNA (Matzke ctv, 2004; Huettel ctv, 2007) Ở tế bào sinh vật nhân thực, iRNA máy sinh hóa quan trọng đóng vai trị điều hịa hoạt hóa gene bảo vệ thể (Hannon, 2002; Mello ctv, 2004; Meister Tuschl, 2004; Hammond, 2005) Giải thưởng Nobel sinh học y học việc khám phá chế iRNA (Andrew Fire Craig Mello, 2006) Nghiên cứu đoạn dsRNA nhỏ tạo hoạt hóa gene phiên mã “hoạt hóa RNA” (Li ctv, 2006) Chứng minh siRNA giúp người sản xuất gene đặc hiệu làm giảm lượng mRNA protein nhờ chế hoạt động iRNA (Davis cộng sự, 2010) 2.3.3 Cơ chế bất hoạt gene iRNA Nghiên cứu hóa sinh iRNA ruồi giấm cho thấy RNA sợi kép (dsRNA) phân cắt thành đoạn dsRNA ngắn gồm 21–23 nucleotide (Tuschl ctv, 1999) Họ cho phân tử dsRNA ngắn (siRNA–small interfering RNA) đóng vai trị phân hủy mRNA Sau đó, nhóm Fire Mello; Parrish cộng xác minh dsRNA dài cắt thành đoạn RNA ngắn khoảng 25 nucleotide siRNA gây phân hủy mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA (Fire, Mello ctv, 2000)  Cơ chế bất hoạt gene mô tả sau: RNA sợi kép (dsRNA) bị cắt thành mảnh nhỏ (siRNA) endonuclease gọi dicer Sau đó, sợi kép ngắn lại mở xoắn để tạo sợi đơn ngắn sợi sợi antisense (sợi đối nghĩa) Sợi antisense ngắn (siRNA) nạp vào phức hợp RISC Sau đó, phức hợp RISC có gắn antisense RNA bắt cặp với mRNA liên kết tương đồng giữ base Phần dư sợi mRNA bị RISC phân cắt Điều có nghĩa sợi mRNA thơng tin bị phân hủy 10 Đồ án tốt nghiệp kết protein dịch mã từ mRNA không tổng hợp Quá trình dịch mã gene bị bất hoạt Hình 2.5 Cơ chế hoạt động iRNA [68] A Trong tế bào, trình chép nội sinh ngoại sinh mở đầu cho hoạt động sợi dsRNA dài, chúng xem chất kích hoạt trình can thiệp RNA (iRNA) B Đây trình mà dsRNA xử lý tác dụng enzyme RNase III ATP C dsRNA dài bị cắt thành đoạn siRNA có kích thước 21–23 nucleotide với nucleotide nhô đầu 3’ siRNA tổng hợp bên 11 Đồ án tốt nghiệp ngồi tế bào sau đưa vào tế bào nhờ trình lây nhiễm xung điện D siRNA kết hợp với phức hợp phản ứng lại kích thích iRNA (RISC) Phức hợp chứa thành phần Agronaute (Argo), Ago gắn vào siRNA, tách loại bỏ sợi sense siRNA để RISC hoạt động E F Còn lại sợi antisense siRNA mạch kép, xem sợi dẫn, hướng dẫn RISC bám vào bắt cặp với mRNA có trình tự tương đồng với nó, phân hủy mRNA đích Kết khơng có mRNA cho q trình giải mã tổng hợp protein hay hormon gene 2.3.4 Vai trị iRNA iRNA kìm hãm tổng hợp protein điều hòa phát triển thể sinh vật Hiện phát khoảng 500 gene người động vật có vú tổng hợp khoảng 500 phân tử miRNA khác có chiều dài khoảng 21 nucleotide khoảng 30% tổng số gene điều khiển phân tử miRNA (Ajit, 2007) iRNA chế bảo vệ thể khỏi xâm nhiễm virus Các cơng trình nghiên cứu cơng bố năm 1997 cho thấy trồng có hàng rào bảo vệ hiệu chống lại xâm nhiễm virus dựa chế PTGS (Covey ctv, 1997; Ratcliff ctv, 1997) Bộ máy dsRNA nhận biết RNA virus xâm nhập ngăn chặn RNA virus cách phân hủy RNA virus, nhận biết xâm nhập sinh vật ký sinh, tạo phản ứng gây bất hoạt gene ban đầu sau khuếch đại phản ứng để loại bỏ hoàn toàn nhân tố bên xâm nhập iRNA bảo đảm bền vững genome thông qua bất hoạt gene nhảy (Fire, Melo ctv, 1998) Các gene nhảy gây nhiều đột biến bất lợi thể sống Trong vùng chứa gene nhảy genome, hai sợi DNA chép, dsRNA tạo thành dẫn đến trình iRNA loại bỏ sản phẩm không mong muốn từ gene nhảy Những phần tử dsRNA ngắn tác động trực tiếp lên sợi nhiễm sắc ngăn chặn dịch mã (Tabara ctv, 1999) Cơ chế bất hoạt gene iRNA tạo nên hệ thống miễn dịch genome (Plasterk, 2002) 12 Đồ án tốt nghiệp 2.3.5 Các nghiên cứu ứng dụng iRNA nuôi trồng thủy sản Can thiệp RNA (iRNA) tượng bất hoạt đặc hiệu gene sinh vật đa bào gồm Drodophia, Caenorhabditis elegans, động vật có vú ký sinh… Cơng nghệ iRNA phương pháp nghiên cứu hiệu chức gene động vật thủy sản, điển hình cá ngựa vằn Danio rerio,…[71] iRNA nghiên cứu luân trùng Brachionus plicatilis nhằm tăng cường khả đánh giá tính di truyền đặc biệt quan trọng ảnh hưởng đến vòng đời chúng (Snell ctv, 2010) Cơ chế iRNA làm bất hoạt gene sau phiên mã, chức tự nhiên chịu trách nhiệm chống lại nhiễm trùng virus đa số loài Kết làm bất hoạt gene Dicer–1 virus tôm sú (Penaeus mondon) làm tăng tỷ lệ chết virus, chế iRNA hoạt động mạnh mẽ có chức miễn dịch tốt tôm (Su, Oanh, Lyons ctv, 2008) Mức cao Dicer tế bào bạch cầu đóng vai trị làm miễn dịch tự nhiên tôm (Zhang, Song, Zhao ctv, 2010) Ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Dicer–2 bao gồm miễn dịch không đặc hiệu chống lại virus (Chen, Jia, Zhao ctv, 2011) Dicer–2 góp phần vào chức miễn dịch khơng đặc hiệu tôm cách nâng cao hiệu lực iRNA (Kim, Behlke ctv, 2005) Ứng dụng siRNA nghiên cứu ức chế TFV (tiger frog virus) tế bào cá, cung cấp tiềm điều trị bệnh virus nuôi trồng thủy sản (Junfeng Xie ctv, 2004) iRNA nghiên cứu để bất hoạt gene virus gây bệnh đốm trắng (WSD–white spot disease) tôm biển (Krishn ctv, 2009) iRNA đặc hiệu (21bp) ứng dụng để ức chế gene mã hóa protein vỏ (VP28) virus WSSV thể tơm Penaeus japonicas Làm bất hoạt gene đích có hiệu lực cao, miễn dịch đặc hiệu chống lại virus đốm trắng (WSSV) virus Taura tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Penaeus vannamei) cách tiêm dsRNAs sợi dài có trình tự mã hóa cấu trúc protein virus Sử dụng dsRNAs tác động vào gene mục tiêu virus đầu vàng 13 Đồ án tốt nghiệp (YHV) thu hiệu miễn dịch đặc hiệu giống virus tôm sú Penaeus monodon (Vincent, Breland Lotz, 2004) dsRNA can thiệp gián tiếp vào hầu hết trình phiên mã gene, làm bất hoạt gene Chức gene nghiên cứu sinh vật nước cách sử dụng iRNA Kỹ thuật iRNA ứng dụng sinh vật nước: cá ngựa vằn (Danio rerio) tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus schimitti) Đại Tây Dương Kết chứng minh iRNA sử dụng công cụ để nghiên cứu chức sinh học gene có liên quan đến phát triển cá ngựa vằn Danio rerio Các nghiên cứu gần chứng minh tính hữu ích dsRNA thể tôm trưởng thành Hơn nữa, khả dsRNA ức chế chức hormon hyperglycemic (CHH) tôm Đại Tây Dương nghiên cứu (Estrada ctv, 2007) Ảnh hưởng iRNA tôm giải thích thí nghiệm in vivo cách tiêm dsRNA có trình tự tương đồng với gene mã hóa gonad inhibiting hormon (GIH) tôm cát Metapenaeus ensis dsRNA làm giảm biểu GIH (Guan, Mark, Chan ctv, 2004) Công nghệ iRNA nghiên cứu động vật thân mềm hai mảnh, định chức gene sò Crassostrea gigas Việc tiêm dsRNA tương ứng với gene Oyster vasa–like gene (Oyvlg) vào tuyến sinh dục làm ức chế trình giảm phân làm bất hoạt sản sinh tế bào phơi sị Crassostrea gigas (Fabioux ctv, 2009) iRNA có ảnh hưởng đến yếu tố tạo tua khác loài bạch tuộc Sepia oficinalis (Grimaldi ctv, 2004) Nghiên cứu tiêm dsRNA vào tôm Macrobrachium rosenbergii ngăn cản phát triển đặc điểm sinh dục thứ phát “gai phụ sinh dục đực” giảm thông số tăng trưởng vốn thể mạnh đực (Ventura, 2009) 14 Đồ án tốt nghiệp 2.3.6 Phương pháp chuyển dsRNA, shRNA, siRNA vào tế bào 2.3.6.1 Phương pháp chuyển không cần virus Phương pháp sử dụng siRNA bình thường siRNA biến đổi phương pháp hóa học, chép môi trường in vitro siRNA, shRNA, dsRNA biểu plasmid đóng vai trị vector Chuyển cách sử dụng liposome, lipid, protein–antibody, peptide … Các cách phân thành hai dạng: hệ thống cục (Aigner, 2007) Những phương pháp chuyển cục cần lượng nhỏ siRNA để tránh việc chuyển nhầm đến phận khác giảm thất thoát tiết thận Phương pháp chuyển hệ thống thực nhiều cách gắn siRNA vào liposome, lipoplexe, cationic lipid, tiêm siRNA, xung điện (Aigner, 2007) Cũng chuyển siRNA hay dsRNA vào vật chủ phương pháp ngâm trứng loài Drosophila melanogaster hấp thu siRNA/dsRNA giai đoạn phát triển sớm (Tabara ctv, 1998; Timmons ctv, 1998) 2.3.6.2 Phương pháp chuyển plasmid Chuyển shRNA hay siRNA vào plasmid, đó, plasmid mã hóa shRNA, siRNA với hai mạch sense antisense riêng biệt, biểu kiểm sốt promoter chọn Promoter RNA polymerase II (pol–II)–dependent hay RNA polymerase III (pol–III)–dependent U6 Pol–III promoter biểu hầu hết tế bào Quá trình chép bắt đầu xác điểm kết thúc nucleotide uredine Một chuỗi nhiều bốn thymidine xem điểm kết thúc Việc có lợi việc biểu đoạn gene ngắn shRNA nhằm tránh nucleotide không mong muốn điểm kết thúc Pol–II promoter có nhiều ưu điểm việc biểu shRNA Những promoter có thuận lợi việc điều chỉnh bất hoạt RNA cách thời, tùy thuộc vào tính chất chúng Những promoter hoạt hóa tetracycline 15 Đồ án tốt nghiệp promoter metallothionine promoter sử dụng để hoạt hóa kiểm sốt q trình iRNA sản phẩm pol–II promoter khơng kết thúc vị trí xác Vì vậy, mạch chép có nhiều nucleotide dư thừa điểm kết thúc Chúng can thiệp vào trình hoạt hóa đoạn RNA đích Những đoạn dư thừa làm cho q trình iRNA khơng nhận biết đoạn gene mục tiêu Do tác dụng phụ gây độc siRNA/shRNA bị biểu mức nên promoter phải lựa chọn cẩn thận dựa vào chiều dài chúng để tránh tác dụng gây độc Peng cộng phát triển hệ thống kết hợp thuận lợi của hai phương pháp (sự xác của T7 RNA polymerase điều chỉnh biểu pol–II promoter) Họ tạo plasmid cấu trúc biểu shRNA T7–RNA polymerase promoter pol–II promoter kiểm soát biểu T7–RNA polymerase, nên T7 RNA polymerase điều chỉnh pol–II promoter Kết shRNA chỉnh sửa biểu tế bào Một nhược điểm trình hiệu phương pháp chuyển có khác biệt tế bào điều kiện thí nghiệm khác (Singh ctv, 2009) Q trình iRNA thực cách chuyển dsRNAs vào vi khuẩn Vi khuẩn biểu dsRNA kiểm sốt T7 RNA polymerase promoter Khi tế bào chủ hay sinh vật hấp thụ chúng, dsRNA biểu vi khuẩn kích hoạt q trình iRNA tế bào chủ hay sinh vật tương ứng (Singh ctv, 2009) 2.3.6.3 Phương pháp chuyển nhờ virus Thế mạnh việc chuyển siRNA/shRNA virus chuyển vào tế bào mà khó bị nhiễm phương pháp khác tế bào không phân chia Vector virus tải nạp vào tế bào cách tự nhiên hiệu cao so với cảm nhiễm hay cách chuyển khơng dùng virus Những virus vector sử dụng phổ biến để chuyển shRNA bao gồm: 16 Đồ án tốt nghiệp Adenovirus, Adeno Associated Virus (AAV), Lentivirus, Retrovirus, Herpes Baculovirus vector (Singh ctv, 2009) 17 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian thực từ ngày 01 tháng 02 năm 2012 đến ngày 21 tháng 07 năm 2012 Địa điểm nghiên cứu: Phịng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Ni Trồng Thủy Sản 2, 116 Nguyễn Đình Chiểu, phường Đa Kao, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh 3.2 Vật liệu 3.2.1 Vật liệu sinh học Tôm xanh trưởng thành khoảng 18–30 g: đực cái, mục đích tách chiết tuyến đực để thu RNA Địa điểm thu mẫu: Cái Bè (Tiền Giang) Tôm PL25: 60 sử dụng cho thí nghiệm tiêm sợi dsRNA, thu Cái Bè (Tiền Giang) Chủng E.coli JM 109 khả nạp thương mại hóa (Promega) 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 3.2.2.1 Primer Bảng 3.1 Trình tự primer nghiên cứu Thứ tự Sequence primer Primer Mr–IAG Mr–IAG Sense Mr–IAG Forward (5’3’) Reverse(5’3’) TCCCGTCCCTGTCCTATAC CGGTGATTTGACTTTGAGCAT TTG C T7PATGGGATACTGGAATG CTGGAACTGCAGGTGTTAAG CCGG ATGGGATACTGGAATGCC Antisense GAG T7PCTGGAACTGCAGGTGTTA ACG 3.2.2.2 Hóa chất dùng ly trích RNA tổng số  Trizol (phenol pH8, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate) 18 ... ? ?Ứng dụng thử nghiệm công nghệ iRNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii? ?? tiến hành 1.2 Mục đích đề tài Mục đích việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật bất hoạt RNA. .. tra hiệu sợi đôi dsRNA thực nghiệm chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan tuyến đực tôm xanh Macrobrachium rosenbergii 2.1.1 Phụ... sung dopamine Thử nghiệm tạo tiềm sử dụng dopamine để tạo tơm xanh tồn đực phục vụ cho sản xuất 2.3 Giới thiệu cộng nghệ iRNA ứng dụng tạo tôm xanh giả 2.3.1 Giới thiệu iRNA Công nghệ iRNA gây bất