BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG XỬ LÝ DẦU THÔ Ở PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ BIỂN CẦN GIỜ Ngành CÔN[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG XỬ LÝ DẦU THÔ Ở PHỊNG THÍ NGHIỆM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ BIỂN CẦN GIỜ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN Nguyễn Hoàng Mỹ Sinh viên thực MSSV: 107111215 : Tống Khánh Tuyền Lớp: 07DSH2 TP Hồ Chí Minh, 2011 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền CHƢƠNG MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Từ phát nay, dầu thô nguồn nguyên liệu vô quý giá quốc gia nói riêng tồn giới nói chung Ngay dầu thơ sản phẩm dầu thô khai thác sử dụng với khối lượng ngày tăng Dầu thơ có mặt hầu hết lĩnh vực đời sống sinh hoạt hàng ngày người hoạt động công – nông nghiệp Bên cạnh ưu điểm kinh tế xã hội, sản phẩm dầu thô mối đe dọa ô nhiễm môi trường Những yếu tố khách quan chủ quan khai thác sử dụng dầu gây nên hiểm họa cho mơi trường sinh thái Có nhiều vụ tràn dầu sơng, biển xảy tồn giới để lại hậu đáng lo ngại Đó chưa kể đến việc khai thác dầu thềm lục địa việc rửa tàu chuyên chở dầu vô ý thức gây nên ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ sinh thái Ở Việt Nam vòng 10 năm qua có 50 vụ tràn dầu lớn nhỏ, thiệt hại khơng kiểm sốt Chính việc nghiên cứu tìm cách phịng ngừa nhiễm dầu đưa sách bảo vệ mơi trường nói chung, nhiễm dầu gây nói riêng trở nên cấp thiết Hiện có nhiều phương pháp khắc phục cố tràn dầu biển như: phương pháp học, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học Nhưng biện pháp học hóa học sử dụng thiết bị tách dầu đại không loại bỏ thành phần độc dầu Trong phương pháp sinh học phương pháp làm nhiễm dầu có tính ưu việt với giá thành rẻ, không gây ô nhiễm sau Xử lý dầu tràn chủng vi sinh vật giúp làm dầu biển giúp hiểu q trình chuyển hóa thành phần dầu Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền qua điều khiển q trình phân hủy sinh học dễ dàng nhằm làm tăng hiệu xử lý Góp phần cơng tác ứng cứu tràn dầu biển làm dầu trình khai thác vận chuyển đặc biệt Việt Nam, tiến hành nghiên cứu đề tài: „„Bước đầu thử nghiệm khả xử lý dầu thô quy mơ phịng thí nghiệm chủng vi khuẩn phân lập từ biển Cần Giờ” Tình hình nghiên cứu Nghiên cứu Việt Nam Năm 2003, tác giả Lại Thúy Hiền nghiên cứu chất hoạt động bề mặt sinh học vi sinh vật tạo ra, ứng dụng cơng nghệ dầu khí xử lý môi trường Kết phân lập chủng vi sinh vật Pseudomonas pesudomatei, Pseudomonas aeruginosa, Cryptococcus terreus Candida guiller có khả sinh chất hoạt động bề mặt có hoạt tính cao, tác dụng làm tăng trình phân hủy dầu tổng Kết 67% lượng dầu tràn, thúc đẩy nhanh trình xử lý ô nhiễm dầu [7] Đề tài cấp nhà nước số KHCN 02 – 12 “Nghiên cứu làm dầu phương pháp phân hủy dầu mỏ phương pháp phân hủy sinh học” tiến sỹ Đặng Thị Cẩm Hà chủ trì đồng nghiệp tiến hành từ năm 1999 – 2000, hội đồng nghiệm thu nhà nước đánh giá đạt loại xuất sắc Thành đạt đề tài chế phẩm cung cấp cho q trình xử lý dầu nhiễm mơi trường sinh thái khác xây dựng quy trình xử lý ô nhiễm dầu môi trường nước [1] Viện Công nghệ sinh học sản xuất đưa vào sử dụng gồm Oicleanser 1, Oicleanser 2, Oicleanser Các chế phẩm sinh học, chất vi lượng sản xuất đáp ứng yêu cầu xử lý loại hình nhiễm dầu điều kiện sinh thái khác [1] Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Nghiên cứu giới Các nhà khoa học California có cải tiến quan trọng kỹ thuật làm dầu loang biển, hồ khu vực lưu thơng đường thủy, máy lọc dầu cải tiến Đây thiết bị chủ yếu thu hồi dầu loang biển, khu vực có bề mặt dầu loang rộng lớn, thiết bị có nhiều rãnh thu nhiều dầu thiết bị hớt váng dầu thông thường với bề mặt phẳng, thiết bị thu gom gần 100% dầu bám dính mặt thiết bị Nhóm nghiên cứu thuộc Viên Cơng Nghệ Massaachusetts (MIT) Mỹ nghiên cứu loại bọt biển nano hút dầu loang khởi mặt nước Loại bọt biển lưới gồm sợi nano oxit mangan có đường kính khoảng 20 nano mét đan nối với nhau, thiết bị phủ lên lớp silicon lưới giúp khơng thấm nước Do có nhiều lỗ thơng khí, lưới nano hoạt động miếng bọt biển, hút lượng dầu gấp 20 lần trọng lượng Với bề mặt khơng thấm nước, bọt biển hút chất không tan nước dầu, bọt biển hút chất không tan nước dầu, bọt biển nano cịn đẩy gần 100% nước Hiện thị trường giới có nhiều chế phẩm cung cấp cho trình xử lý dầu tràn Một số chế phẩm làm từ bơng phế thải, có tính chất thu hồi dầu sàn dính dầu khơng có khả phân hủy dầu Các chế phẩm sau thu gom phải xử lý tiếp, đốt nhiệt độ cao ( (310 lần), dầu chứa lưu huỳnh tỷ lệ Va/Ni < (0,1) Ngoài Va Ni cịn có Fe, Cu, Zn, Ti, Ca, Mn… Số lượng phức kim loại thường so với phức Va Ni Ngồi pophirin cịn có vịng thơm naphten ngưng tụ Loại phức chiếm phần lớn, chưa nghiên cứu đầy đủ Bên cạnh kim loại dầu thơ có chất nhựa asphalten dầu thô chất mà cấu trúc phân tử ngồi C H cịn có đồng thời nguyên tố khác như: S, O, N 10 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Asphalten có màu nâu sẫm đen dạng bột rắn thù hình, đun nóng khơng chảy mềm, có bị phân hủy nhiệt độ đun sôi cao 3000C tạo thành khí cốc, nên trọng lượng phân tử chúng thay đổi phạm vi rộng từ 1000 đvC tới 10000 đvC cao Asphalten không hịa tan rượu, xăng nhẹ, hòa tan benzene, clorofor CS2 Asphalten hòa tan số dung mơi thực trình trương để hình thành nên dịch keo Các chất nhựa, tách khỏi dầu thô chúng chất lỏng đặt quánh, trạng thái rắn Chúng có màu sẫm vàng nâu, tỷ trọng lớn 1, trọng lượng phân tử từ 500 đvC đến 2000 đvC Nhựa hòa tan hồn tồn loại dầu nhờn dầu thơ, xăng nhẹ, benzen, chloroform, etse Khác với asphalten, nhựa hịa tan dung mơi chúng tạo thành dung dịch thực [2][10] 1.1.3 Khái thác vận chuyển dầu Khai thác dầu khí Việt Nam đứng hàng thứ tư Đông Nam Á, sau Malysia, Indonesia Philippine, đứng hàng thứ 44 danh sách nước sản xuất dầu giới Các mỏ đưa vào khai thác: Tiền Hải C, Đông Quan D, D14 (bể Sông Hồng); Bạch Hổ, Rồng, Rạng Đông, Phương Đông, Ruby, Sư Tử Đen, Sư Tử Vàng, Cá Ngừ Vàng (bể Cửu Long); Đại Hùng, Lan Tây, Rồng Đôi, Rồng Đôi Tây (bể Nam Côn Sơn); Cái Nước, Sông Đốc (bể Malay - Thổ chu) Trong năm gần sản lượng dầu giảm mạnh, mỏ khai thác từ trước như: Bạch Hổ, Sư Tử Đen,…(Bảng 1.2) 11 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bảng 1.2: Sản lượng khai thác dầu Việt Nam (triệu tấn/năm) Tên mỏ 2009 2010 2011 Bạch Hổ 5,45 4,82 4,26 Rồng 0,84 1,21 1,03 Sư Tử Đen 1,49 1,12 0,84 Sư Tử vàng 3,29 2,8 2,24 Cá Ngừ vàng 0,57 0,34 0,21 Rạng Đơng 1,17 0,88 0,66 (Nguồn: Tập chí thơng tin dầu khi) Cơng tác tìm kiếm thăm dị dầu khí Tập đồn Dầu khí Việt Nam triển khai mạnh mẽ toàn thềm lục đại Việt Nam với mục tiêu phát triển nhiều mỏ dầu mới, đáp ứng nhu cầu nước xuất Sau thời gian tìm kiếm thăm dị đạt kết sau: Các mỏ chuẩn bị đưa vào khai thác: Bạch Hổ 19, Trung tâm Nam trung tâm Rồng, Sư Tử Trắng, Hải Sư Trắng, Hải Sư Đen, Thăng Long, Đông Đô, Topaz, Pearl, Diamond (bể Cửu Long); Hải Thạch, Mộc Tinh, Lan Đỏ, Thiên Ưng, Mãng Cầu (bể Nam Côn Sơn); Hoa Mai, cụm mỏ Rạch Tàu - Phú Tân - Khánh Mỹ, Kim Long (bể Malay - Thổ Chu) Bên cạnh Tập đồn dầu khí Việt Nam triển khai thành cơng hoạt động tìm kiếm, thăm dị khai thác dầu thơ nước ngồi Hiện tham gia đầu tư vào 13 dự án ở: Cuba, Lào, Campuchia, Indonesia… Trong giai đoạn từ năm 2011 – 2015, Petro Việt Nam tập đoàn dầu khí lớn Việt Nam đầu tư vào 25 dự án thăm dò khai thác phát triển dầu khí với mức đầu tư 2.35 tỷ USD Nga, Venezuela nước Châu Mỹ Latin, Bắc Phi… Muốn khai thác dầu thô, người ta khoan lỗ khoan gọi giếng dầu Khi khoan trúng lớp dầu mỏng, dầu tự phun lên áp suất cao khí 12 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền dầu Khi lượng dầu giảm áp suất khí giảm, người ta phải dùng bơm hút dầu lên bơm nước xuống để đẩy dầu lên [11][13] 1.2 Tổng quan vi sinh vật phân hủy dầu 1.2.1 Sự phân bố Các vi sinh vật có khả phân hủy hydrocarbon thô hợp chất liên quan xuất khắp nơi, môi trường nước biển, nước đất Cho đến nay, người ta xác định 200 lồi vi khuẩn, nấm có khả phân hủy hydrocarbon Trong môi trường biển vi khuẩn nhóm phân hủy hydrocarbon ưu phân bố vùng cực lạnh Còn nước ngọt, nấm đóng vai trị quan trọng việc phân hủy dầu Số lượng thành phần vi sinh vật không đồng khu vực khác độ sâu khác tùy theo điều kiện môi trường cụ thể Những mơi trường có chứa nhiều chất hữu cơ, số lượng thành phần vi sinh vật phát triển mạnh Ngược lại, khu vực nghèo chất hữu cơ, số lượng thành phần vi sinh vật Trên mặt đất, số lượng thành phần vi sinh vật ít, độ ẩm khơng thích hợp tác động tia ánh sáng mặt trời làm cho phần lớn vi sinh vật bị tiêu diệt Trong đất, thường gặp loài vi khuẩn như: Bac.mycoides, Bac.subtilis, Bac.mensentriricus, Micrococcusslbus Độ sâu từ 10cm đến 20cm, số lượng thành phần vi sinh vật tập chung nhiều độ sâu này, độ ẩm vừa thích hợp (50% - 90%), chất dinh dưỡng lại tích lũy nhiều, không bị tác dụng chiếu sáng nên vi sinh vật phát triển nhanh Các q trình chuyển hóa quan trọng đất chủ yếu xảy độ sâu Số lượng thành phần vi sinh vật giảm độ sâu 30cm, vi sinh vật có độ sâu thường nhóm yếm khí, đồng thời có khả chịu áp suất lớn Ở lớp đất chất hữu nên vi sinh vật khó phát triển Số 13 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền lượng thành phần vi sinh vật phân hủy dầu đất giảm mạnh nơi có nhiều đá cuội, cát, sỏi làm cho số lượng thành phần vi sinh vật [6][8][12] 1.2.2 Các nhóm vi sinh vật phân hủy dầu 1.2.2.1 Vi sinh vật phân hủy hydrocarbon Năm 1897, Miyoshi cơng bố Isotrytis Cinevea có khả phân hủy paraffin Năm 1906, Rahn nghiên cứu phân giải paraffin nấm mốc Bắt đầu từ mà có hàng loạt nghiên cứu cho thấy nhiều lồi vi sinh vật có khả phân hủy dầu bảng 1.3 [12] 1.2.2.2 Cơ chế phân hủy hydrocarbon Vi sinh vật sử dụng hydrocarbon làm nguồn dinh dưỡng lượng cho sinh trưởng phát triển Việc sử dụng hydrocarbon vi sinh vật xảy theo hai hướng Với số hydrocarbon tan nước, vi sinh vật hấp thụ trực tiếp Với hydrocarbon khó tan mà tan dạng nhũ tương dầu – nước trình phân hủy vi sinh vật theo trình tự bước: hòa tan hydrocarbon dạng nhũ tương dầu nước cách tiết chất hoạt hóa bề mặt sinh học, sau vi sinh vật tiếp xúc với dầu, cuối tiết enzyme để chuyển hóa hydrocarbon thành chất mà sử dụng [6] Cơ chế phân hủy hydrocarbon Khả phân hủy ankan phụ thuộc vào cấu trúc phân tử chúng Thông thường hydrocarbon bậc bậc dễ phân hủy hydrocarbon bậc 14 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bảng 1.3: Những vi sinh vật phân hủy hydrocarbon dầu Hydrocarbon Hecxandecan Vi sinh vật Nấm Vi khuẩn Candida Tropicalis Candida sp Microccoccus Cerificans Micrococcus Cerificans Bacillus Thermophil Mycobacterium Lacticotum Oxadecan Nocardia Sp M.Rubum Vas propanicum Candida lipolyticu M.Flavum Vas Math Nicum Fseudomonas Aerygimosa C12 – C20 Nocardia Sp Mycobacterium Phiei Candida Guilliermondi C12 – C15 C13 – C19 C14 – C18 Micrococcu Cerficans Candida Tropicalis Torulopsis Candida Tropicalis Lipolytica C.Pelliculosa C.Intermedia C14 – C19 Candida Intermetia C Lipolytica Candida albicans C15 – C28 C.Tropicalis Candida lipolytica N-paraffin Pseudomonas (Nguồn: Lại Thúy Hiền, Giáo trình vi sinh vật dầu mỏ) 15 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Cơ chế phân hủy n-ankan: Quá trình phân hủy ankan nhờ vào enzyme mono-oxygenaza dioxygenaza, địi hỏi có tham gia phân tử oxy chất cho điện tử NADPH2 Các giai đoạn oxy hóa ankan: Giai đoạn 1: Tạo thành rượu, xảy qua bước Tạo thành hợp chất peoxyt R - CH2 - CH3 + O2 R - CH2 - CH2 - OOH Hợp chất peoxyt không bền tác dụng NADPH2 tạo thành rượu nước: R - CH2 - CH2 - OOH + NADPH2 RCH2 - CH2 - OH + H2O + NADP (2) Từ ankan chuyển thành rượu có hai khả xảy ra: Tạo thành rượu bậc 1: xảy nhóm OH gắn vào C bậc (2) Tạo thành rược bậc 2: nhóm OH gắn với C bậc R - CH2 - CH2 - OOH + O2 + NADPH2 R-CH- CH + H2O + NADP OH Giai đoạn 2: Rượu bậc tạo thành andehit: R - CH2 - CH2 - OH + 1/2O2 R - CH2 - CHO + H2O Rượu bậc tạo thành xeton: R - CH - CH3 + 1/2O2 R - CH - CH3 + H2O OH O Giai đoạn 3: tạo thành axit béo Các xeton bị oxy hóa thành ester, liên kết ester bị phá vỡ tạo axit rược bậc một, rược bậc lại bị oxy hóa thành andehit bị oxy thành axit béo 16 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền R- CH2 - C- CH3 R - CH2 - O - C - CH3 R- CH2 - OH + CH3 - COOH O O Các andehit bị oxy hóa axit béo: R - CH2 - CHO + 1/2O2 R - CH2 - COOH Các trường hợp oxy hóa xảy hai đầu ankan tạo thành diol, dicacbonxylie Giai đoạn 4: Các axit béo bị oxy hóa tiếp nhờ q trình oxy hóa Axit béo mạch dài tác dụng loải enzyme chuyển sang dạng acety coenzyme A chuyển hóa tiếp tác dụng nhiều enzyme khác Kết sau chu kì chuyển hóa, nhóm acetyl CoA bị cắt phân tử axit béo bị cắt hai nguyên tử carbon Sản phẩm cuối chu trình oxy hóa CO2 nước Cơ chế phân hủy ankan mạch nhánh Do cản trở mặt không gian nên khả phân hủy ưu tiên C bậc bậc 2, C bậc khó phân hủy Ankan nhóm metyl đầu mạch khó phân hủy mạch Ankan có mạch dài dễ bị phân hủy ankan có mạch nhánh ngắn Trong q trình phân hủy ankan mạch nhánh, người ta đề xuất biến dạng chu trình Metylcitrat, thay vào vị trí axit citric metylcitrat Cơ chế phân hủy cycloankan Cycloankan cấu tử dầu thơ phân hủy cycloankan cá enzyme monooxygenaza oxygennaza Dưới tác dụng enzyme này, cyloankan bị phân hủy thành cycloankanol Khả phân hủy cyclohexan mạnh dãy đồng đẳng cyloankan Cùng vòng cycloankan chất có mạch nhánh dài dễ phân hủy 17 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Khi phân hủy cyclohexan, trình hydroxyl hóa xúc tác enzyme oxydaza chức tạo rượu mạch vòng Rượu mạch vòng bị dehydro hóa để tạo xeton, xeton bị oxy hóa tiếp thành lacton Lacton bị thủy phân, nhóm hydroxyl bị oxy hóa thành nhóm andehit nhóm carboxyl Kết axit dicacboxylic bị biến đổi tiếp nhờ chu trình oxy hóa Các vi sinh vật có khả phát triển cyclohexan phải thực tất phản ứng Tuy nhiên ta thường gặp vi sinh vật có khả chuyển cyclohexan thành rượu mạch vịng khơng có khả lacton hóa mở mạch vòng Do chế cộng sinh trao đổi chất (cometabolism) đóng vai trị quan trọng phân hủy sinh học hợp hydrocarbon mạch vòng [6] Cơ chế phân hủy hydrocarbon thơm Benzen Xúc tác ban đầu cho trình oxy hóa benzene enzyme dioxygenaza, tức phân tử oxy gắn trực tiếp vào carbon vòng thơm Naphtalen Xúc tác enzyme oxygenaza gắn phân tử oxy vào phân tử naphtalen để tạo thành cis-1,2 dihydroxyl 1,2 dihydro naphtalen, sau tách nước để thành 1,2-dihydroxynaphtalen Tại đây, vòng bị cắt để tạo thành cishydroxyl benzan pyruvic axit, sau tiếp tục bị oxy hóa tạo thành salicyandehyd, salicylic axit atechol, tiếp cắt vòng khác theo hướng –octhor hay –metha phụ thuộc vào chủng vi khuẩn Cũng có trường hợp xúc tác để oxy hóa naphtanen enzyme monooxygenaza cuối cho cis-1,2 - dihydroxyl 1,2- dihydronaphtalen Nấm mốc nhóm vi sinh vật chiếm ưu chủng loại có khả phân hủy naphtalen 18 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Như vậy, naphtalen chuyển hóa thành phân tử có khối lượng bé nhờ vi sinh vật làm cho độ nhớt dầu giảm [8] 1.3 Tổng quan chất hoạt động bề mặt Các chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) tạo từ đường lên men vi sinh vật Đó hợp chất lưỡng tính gồm phần: phần kị nước (hydrophobic moiety) phần ưa nước (hydrophilic moiety), có khả làm giảm sức căng bề mặt phân tử Phần ưa nước thường nhóm: axit amin, peptit, sacarit đơn, đôi, polysacrarit Phần kị nước axit béo, axit no, khơng no Các CHĐBMSH có cấu tạo khác cấu trúc hóa học lẫn kích thước phân tử từ đơn giản axit béo đến mức phức tạp hợp chất polymer Các CHĐBMSH thường tiết bên tế bào chất glucolipid, axit béo, photpholipid, polysacarit lipid, lipopetic-lipoprotein, hay thân bề mặt tế bào vi sinh vật Ngoài đặc tính làm giảm sức căng bề mặt cịn có đặt tính kháng sinh chất gramicidin S hay polymicin Các CHĐBMSH tạo chất không tan nước lẫn tan nước lẫn tan nước Nó tạo phản ứng thích nghi với mơi trường khơng thuận lợi, độc hại có xu hướng tạo nhiều chất khơng hịa tan nước Các CHĐBMSH gen nhiễm sắc thể lẫn gen plasmid tổng hợp điều khiển Các gen dễ chức qua thời gian dài bị đột biến chọn lọc gặp môi trường không thuận lợi cho chúng biểu Điều giải thích bắt gặp lồi có khả sử dụng dầu nơi không bị nhiễm dầu hoạt tính tạo CHĐBMSH thấp Các CHĐBMSH tạo suốt trình phát triển vi sinh vật, sản lượng hoạt tính sau bị giảm mơi trường 19 ... tràn dầu biển làm dầu trình khai thác vận chuyển đặc biệt Vi? ??t Nam, tiến hành nghiên cứu đề tài: „? ?Bước đầu thử nghiệm khả xử lý dầu thô quy mơ phịng thí nghiệm chủng vi khuẩn phân lập từ biển Cần. .. thử nghiệm khả phân hủy dầu vi sinh vật Các kết đạt đƣợc đề tài Tuyển chọn chuẩn vi sinh khuẩn có khả phân hủy dầu từ nguồn nước nhiễm dầu Đánh giá số vi khuẩn có khả phân hủy dầu mạnh làm sở... Khánh Tuyền Mục đích nghiên cứu Xác định khả xử lý chủng vi sinh vật phân lập có khả phân hủy dầu mẫu nước biển nhiễm dầu quy mô phịng thí nghiệm Nhiệm vụ nghiên cứu Xây dựng sơ đồ bố trí thí nghiệm