Đồ án tốt nghiệp thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded rna vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh macrobrachium rosenbergii (de man, 1879)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỰC NGHIỆM CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP DOUBLE STRANDED RNA VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI GIỚI TÍNH TƠM CÀNG XANH Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán hướng dẫn : Th.S BÙI THỊ LIÊN HÀ Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM HỒNG MSSV: 0851110091 Lớp: 08DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) loài giáp xác thương mại quan trọng, đánh bắt nuôi trồng rộng rãi phân bố tự nhiên ruộng lúa (New, 2005) Năm 1987, sản lượng M rosenbergii tồn cầu ước tính đạt khoảng 27000 năm (New, 1990) Một số lượng lớn sản xuất Trung Quốc mở rộng nhanh chóng Ấn Độ Bangladesh (New, 2005) Ngày nay, nuôi rộng rãi nước giới Trong thập kỷ qua, sản lượng trung bình năm M rosenbergii tăng 9-35,5% giá trị Năm 1993, tổng sản lượng 17,164 tấn, trị giá 116,799,000 USD năm 2005 đạt 205,033 với trị giá 896,263,000 USD Việc ni trồng tơm xanh đóng góp lớn vào ngành ni trồng thủy sản tồn cầu, số lượng giá trị M rosenbergii nuôi nhiều Châu Á số khu vực khác Châu Phi, Israel, Trung Nam Mỹ (Nhan, 2009) Tại Việt Nam, tôm xanh đối tượng nuôi địa nơng dân ưa thích, nhiều địa phương xác định đối tượng ni có giá trị kinh tế cao, đặc biệt khu vực nuôi tôm thương mại lưu vực sơng Mê Kơng Do nhu cầu giống cho việc nuôi đại trà lớn Tuy nhiên, trình tăng trưởng, đực thường lớn nhanh Khi chiều dài thể đạt trung bình 8-14 cm trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển đực tương đương Nhưng chiều dài thể vượt 14 cm, đực thường lớn nhanh (Lê Quang Khôi, 2009) Do giai đoạn ngưng phát triển tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản (Ra`anan Cohen, 1984) Tơm đực lớn đạt 110 g, tôm lớn đạt 50 g sau tháng nuôi (Lê Quang Khôi, 2009) Đây vấn đề gây trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm xanh thương phẩm có kích thước lớn giá thành cao sản lượng thu hoạch tăng cao Nghiên cứu Sagi Ra`anan năm 1988 chứng minh việc nuôi tơm xanh tồn đực đạt sản lượng cao việc ni tồn hay đực quần thể Khối lượng trung bình quần thể 473 Đồ án tốt nghiệp g/m2, 248 g/m2 260 g/m2 Những nhà khoa học Ả Rập Xê Út báo cáo kết tương tự tiến hành thí nghiệm ni tơm tồn đực, toàn hỗn hợp đực (Siddiqui, 1997) Điều thể việc nuôi tôm xanh toàn đực làm tăng sản lượng cách đáng kể mang lại lợi nhuận cao việc ni tồn hay hỗn hợp đực Do đó, phát triển kỹ thuật cho việc sản xuất quần thể toàn đực nhu cầu cần thiết cho việc nuôi tôm xanh Các nghiên cứu gần chứng minh chức làm bất hoạt gene iRNA tế bào tôm (Estrada ctv, 2007) Và cơng cụ có tiềm đáp ứng cho việc sản xuất tôm xanh toàn đực Kỹ thuật bất hoạt RNA (Guo Kempheus, 1995) sử dụng công cụ hiệu để làm bất hoạt sản phẩm gene cách tiêm RNA mạch đôi vào thể nhiều loài giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008) Ý tưởng tạo giả cách làm bất hoạt RNA thơng tin mã hóa gene tuyến đực insuline-like tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii insuline-like androgenic gland, Mr-IAG) RNA mạch đôi (dsRNA) thực thành cơng quy mơ phịng thí nghiệm (Ventura ctv, 2009) Kể từ đó, kỹ thuật bất hoạt RNA hứa hẹn hướng tiếp cận để tạo quần thể tơm tồn đực cho việc ni tôm xanh thương mại Xuất phát từ nhu cầu giống tôm xanh đực từ thị trường đề tài “Thực nghiệm cơng nghệ tổng hợp double stranded RNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)” cần thiết nhiều mong đợi Mục tiêu đề tài ứng dụng dsRNA để tạo tôm xanh giả, từ giả sản xuất tơm xanh tồn đực để đáp ứng nhu cầu cho việc nuôi tôm xanh thương phẩm Những nội dung cần thực là: + Tổng hợp Mr-IAG RNA mạch đôi cho kỹ thuật bất hoạt RNA + Kiểm tra hiệu Mr-IAG RNA mạch đôi việc chuyển đổi giới tính tơm xanh với nồng độ tần suất tiêm khác Đồ án tốt nghiệp + Kiểm tra ảnh hưởng thời gian tiêm Mr-IAG RNA mạch đôi lên tạo thành tôm xanh giả Phương pháp nghiên cứu đề tài thu thập thông tin từ báo khoa học công bố, nghiên cứu nước, thu thập số liệu thực nghiệm xử lý phần mềm excel Các kết đạt đề tài: + Tổng hợp thành công dsRNA kit Promega + Khảo sát nồng độ tiêm dsRNA 1,25 µg/g, tần suất tiêm lần/tuần làm bất hoạt gene mã hóa cho hormone tuyến đực tơm PL25 để tạo tôm xanh giả + Thời gian tiêm dsRNA phải kéo dài đến giả thành thục sinh sản Kết cấu đồ án tốt nghiệp gồm chương: + Chương Tổng quan: giới thiệu sơ lược tôm xanh Macrobrachium rosenbergii, tổng quan tuyến đực, chế làm bất hoạt gene iRNA + Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu: vật liệu sinh học tôm PL25, phương pháp tổng hợp dsRNA theo kit Promega, thí nghiệm tiêm thực với nồng độ tiêm µg/g; 2,5 µg/g 1,25 µg/g tần suất tiêm lần/ tuần, lần/tuần lần/tuần Thí nghiệm thời gian tiêm thực vào tháng với nồng độ tiêm 1,25 µg/g tần suất tiêm lần/tuần + Chương Kết thảo luận: nêu lên kết đạt tổng hợp dsRNA, nồng độ tần suất tiêm dsRNA tốt nhất, tạo giả đến tháng thứ thí nghiệm + Chương Kết luận đề nghị: số kết mà đề tài đạt đưa số kiến nghị để làm hướng nghiên cứu tương lai Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Phân loại (New, 2002) Tôm xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1897), loài biết đến giống Macrobrachium công nhận lần vào năm 1705 Q trình đặt tên cho tơm xanh giống lồi gặp nhiều khó khăn lịch sử Trong khứ tên giống bao gồm Cancer (Astacus) Palaemon Trước kia, tên M rosenbergii bao gồm Palaemon carcinus, P dacqueti, P rosenbergii đến năm 1959 tên khoa học Macrobracchium rosenbergii xuất chấp nhận phổ biến hầu Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustacea Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda Bộ phụ: Pleocyemata Phân bộ: Caridea Họ: Palaemonidae Họ phụ: Palaemoninae Giống: Macrobrachium Loài: M rosenbergii (De Man, 1879) Tên tiếng anh: Giant freshwater prawn 1.2 Đặc điểm sinh học tôm xanh 1.2.1 Phân bố Tôm xanh M rosenbergii phân bố tự nhiên Đơng Nam Á, nước Nam Thái Bình Dương, phía Bắc châu Đại Dương phía Tây đảo Thái Bình Dương (New Singholka, 1982; New, 2002) Tôm xanh phân bố tất thủy vực nước thủy vực nước lợ nhiều vùng giới (Nguyễn Việt Thắng, 2003) Môi trường sống Đồ án tốt nghiệp tôm xanh đa dạng thủy vực nước nước đục Ở Việt Nam, tôm xanh phân bố chủ yếu tỉnh Nam Bộ đặc biệt vùng đồng sông Cửu Long (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002) 1.2.2 Vịng đời tập tính sống Vịng đời tôm xanh chia làm giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu ấu trùng tôm trưởng thành Khi tôm trưởng thành, chúng thường sống môi trường nước như: sơng, rạch, ao, hồ.…Cũng nơi xảy trình thành thục, phát dục giao vĩ đẻ trứng Nhưng ơm trứng chúng có xu bơi vùng nước lợ từ 6-18 0/00, ấu trùng nở sống trơi theo kiểu phù du Sau 11 lần lột xác với 12 giai đoạn biến thái ấu trùng (Nauplii) biến thành hậu ấu trùng (Postlarvae-PL) lúc tôm di cư vùng nước ngọt, sống lớn lên (Ling Omerica, 1962; Nguyễn Thanh Phương, 2003) Ấu trùng có tính hướng quang mạnh, vận động trơi nước Sang thời kỳ hậu ấu trùng giai đoạn trưởng thành, tơm có tập tính sống đáy, bám vào cỏ; giá thể…Tơm trưởng thành hoạt động thường ẩn náo vào ban ngày tích cực hoạt động vào ban đêm Tơm xanh có tập tính ăn thịt lẫn nhau, việc dùng giá thể tăng chổ ẩn nắp, hạn chế tượng ăn thịt lẫn để nâng cao tỷ lệ sống tơm (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008) 1.2.3 Hình thái tăng trưởng Dựa vào hình dạng màu sắc để phân biệt tơm nhóm tơm khác Tơm xanh có thể thon dài, đối xứng bên Con trưởng thành thường có màu xanh dễ nhận, đơi có màu nâu nhạt (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008) Tơm xanh nước ta có trọng lượng cá thể lớn, đực đạt tới 450 g/cá thể, thân tương đối tròn, cá thể trưởng thành có màu xanh dương đậm Chủy phát triển nhọn cong lên ½ bề dài tận chủy, phía mắt chủy có 1115 3-4 sau hốc mắt Mặt thường có 12-15 Chiều dài chủy trưởng thành thường ngắn vỏ đầu ngực, chủy đực dài chiều dài đầu ngực (Lê Quang Khơi, 2009) Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Tơm xanh M rosenbergii Chân thứ phát triển chân khác, đực trưởng thành, đơi chân bị thứ có hình dạng kích thước giống phía (trái phải); (Lê Quang Khơi, 2009) Đặc điểm kích cỡ, hình dạng, màu sắc gai đôi thay đổi theo giai đoạn thành thục tôm, tơm đực Khi tơm cịn nhỏ, đơi có màu trong, sau chuyển thành vàng cam (còn gọi lửa), chưa có gai hay có gai mịn càng, chưa có hay lơng tơ Khi tơm lớn, đơi có màu xanh đậm, xuất nhiều gai nhọn lơng tơ Q trình thay đổi thể qua giai đoạn như: tôm nhỏ, tôm lửa nhạt, tôm lửa đậm, tôm lửa đậm chuyển tiếp xanh, tôm xanh nhạt, tôm xanh đậm tôm già (Nguyễn Thanh Phương Trần Ngọc Hải, 2009) Trong trình tăng trưởng, đực thường lớn nhanh Khi chiều dài thể đạt trung bình 8-14 cm trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển Đồ án tốt nghiệp đực tương đương Nhưng chiều dài thể vượt 14 cm, đực thường lớn nhanh (Lê Quang Khôi, 2009) 1.3 Đặc điểm sinh sản tôm xanh 1.3.1 Phân biệt tôm đực tôm Tôm xanh trưởng thành dễ dàng phân biệt đực qua đôi chân bò thứ (càng) mà qua quan sinh dục lỗ sinh dục đực nằm gốc chân bò thứ 5, lỗ sinh dục nằm gốc chân bị thứ (Nguyễn Việt Thắng, 1993) Tơm đực có kích cỡ lớn tơm tuổi Đầu ngực tôm đực to khoang bụng hẹp tôm Đôi thứ to, dài thô Cơ quan sinh dục đực gồm đôi tinh sào, đôi ống dẫn tinh đầu mút Đôi tinh sào ngoằn ngèo nằm mặt lưng giáp đầu ngực nối với ống dẫn tinh chạy từ trước tim dọc sang bên viềng sau giáp đầu ngực đổ vào đầu mút nằm đốt gốc chân ngực thứ năm Túi tinh hình thành q trình phóng tinh Túi tinh chứa khối tinh trùng không di động Ở cái, buồng trứng nằm mặt lưng phần đầu ngực, dày gan tụy Khi buồng trứng thành thục có màu vàng nhìn thấy qua giáp đầu ngực, trải dài từ sau mắt đến đốt đầu phần bụng Ống dẫn trứng nối từ buồng trứng trước tim chạy dọc bên phía bụng đổ túi chứa tinh đốt gốc chân ngực thứ ba (Nguyễn Thanh Phương Trần Ngọc Hải, 2009) Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1 Tóm tắt đặc điểm tôm đực tôm Đặc điểm Tôm đực Tơm Kích cỡ Lớn đầu ngực to Nhỏ đầu ngực nhỏ tôm tôm đực Đôi thứ to, ghồ Nhỏ nhẵn ghề, nhiều gai tôm đực Hiện diện gốc Hiện diện gốc chân ngực thứ năm có chân ngực thứ ba, có nắp đậy màng mỏng bao phủ Mặt bụng có đốt thứ Tơm thành thục có có điểm cứng bụng thứ nhất, thứ 2, Càng Lỗ sinh dục Bụng thứ ba dài nở rộng, hình thành buồng ấp trứng Lơng tơ sinh dục Khơng có Xuất nhiều chân ngực chân bụng tôm trưởng thành Tuyến androgenic Dãy tế bào dính vào vùng Khơng có cuối ống dẫn tinh Chiều dài kích cỡ thành Chiều dài 17,5 cm, trọng Chiều dài 15 cm, trọng thục lượng trung bình 35 g lượng trung bình 25 g Phụ giao vĩ Xuất nhánh Khơng có nhánh phụ chân bụng thứ (Nguyễn Thanh Phương Trần Ngọc Hải, 2009) 1.3.2 Thành thục, giao vĩ, đẻ trứng ấp trứng tôm xanh Trong tự nhiên điều kiện nhân tạo, tôm thành thục giao vĩ xảy quanh năm Mùa đẻ rộ tôm xanh đồng Nam Bộ tập trung từ tháng 4-6 từ tháng 8-10 (Nguyễn Việt Thắng, 1993; Nguyễn Thị Thanh Đồ án tốt nghiệp Thủy, 2005) Tôm thành thục lần khoảng 3-3,5 tháng kể từ hậu ấu trùng 10-15 ngày (PL10-15) Kích cở tơm nhỏ đạt thành thục từ 10-13 cm 7,5 g (Nguyễn Việt Thắng, 1993) Quá trình lột xác tiền giao vĩ tôm tiết chất dẫn dụ có tác dụng kích thích tơm đực tìm đến Sau tôm lột xác 1-22 giờ, thường 3-6 giờ, tôm bắt đầu giao vĩ Tồn q trình tiếp xúc giao vĩ xảy vòng 20-35 phút Sau giao vĩ 2-5 giờ, có 6-24 giờ, tơm bắt đầu đẻ trứng (Nguyễn Thanh Phương, 2003) Tôm thường đẻ trứng vào ban đêm Tôm thường di chuyển từ tầng đáy lên tầng hay tầng mặt để đẻ Trong trình đẻ trứng, trứng thụ tinh ngang túi chứa tinh Trứng dính chùm vào lơng tơ đôi chân bụng thứ tư, thứ ba, thứ hai, thứ Thời gian đẻ trứng khoảng 10-60 phút thông thường từ 15-25 phút Những tơm thành thục chín muồi không giao vĩ đẻ trứng vòng 24 sau lột xác Những trứng không thụ tinh nên rụng sau 1-2 ngày (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002) Trong trình ấp trứng, tôm thường dùng chân bụng quạt nước, tạo dịng nước, cung cấp dưỡng khí cho trứng Thời gian ấp trứng đến trứng nở từ 15-23 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ nước (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008) 1.4 Tổng quan tuyến đực Hệ thống nội tiết nhóm giáp xác gồm phần tuyến sinus quan X nằm cuống mắt Cơ quan X sản xuất gonal-inhibiting hormone (GIH) molt-inhibiting hormone giữ tuyến sinus trước lưu thông thể Ở giáp xác quan Y nằm trung tâm phần đầu ngực sản xuất gonal-stimulating hormone (GSH) ecdysone GIH GSH tác động trực tiếp vào buồng trứng gián tiếp vào tinh hồn thơng qua tiết hormone từ tuyến androgenic (AGH) Giáp xác có quan thuộc hàm dưới, quan neurohemal, vị trí tổng hợp tiết methyl farnosoate, loại hormone có vai trò quan trọng trưởng thành sinh dục đực cái, phát triển hệ thống sinh sản rõ Đồ án tốt nghiệp ràng, tạo noãn hồn, khác biệt hình thái hành vi giao phối (Ohs ctv, 2006) 1.4.1 Phụ đực Phụ đực quan giao cấu tôm xanh đực xuất chân bơi thứ Chồi phụ đực bắt đầu xuất vào giai đoạn khoảng 70 ngày tuổi sau giai đoạn postlarve (trọng lượng 0,38 g, tổng chiều dài 3,7 cm) đến giai đoạn 94 ngày tuổi phụ đực phát triển đầy đủ (Chung Quang Trí, 2006) Hình 1.2 Chân bơi thứ tơm xanh đực (Chung Quang Trí, 2006) 1.4.2 Tuyến đực Những tế bào thuộc tuyến đực quan sát Faxon (1884) tôm nước Cambarus montanus Tuyến hormone xác định sau giáp xác Orchestia gammarellus vào 1953, mơ gọi tuyến đực (Charniaux - Cotton, 1953) Những nghiên cứu sau cho thấy rõ tuyến đực, lớp mơ mỏng gắn phần cuối ống dẫn tinh tôm nước Procambarus blandingii, P viae - viridis, Camb bartonni Camb diogenees, có chiều dài vài milimet Những cấu trúc tương tự quan sát cua Callinectes sapidus (King, 1964) Theo Sagi (2001) “Ở giáp xác, tinh sào nơi tạo tinh trùng quan tạo hormone tuyến đực Nếu đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục đực (tinh sào) có chức tạo tinh trùng nội tiết testosterone 10 Đồ án tốt nghiệp tôm xanh chức thực quan riêng lẻ Tinh sào tôm xanh chuyên tạo tinh, tuyến đực (androgenic gland) - quan biệt lập khác có chức tiết hormone, tham gia vào biệt hóa giới tính phát triển đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước tăng trưởng” Ở tơm lớn người ta thấy tuyến đực tương đối rõ Đó khối tế bào có hình kim tự tháp, dính với phần sau ống phóng tinh (Chung Quang Trí, 2006) 1.4.3 Hormone tuyến đực Hormone tuyến đực tìm nhóm giáp xác chân Armadilidium vulgare protein gồm có chuổi peptide A (chứa 29 aa), B (44 aa), C (45 aa), chuổi A aa thứ 18 cịn có thêm nhóm carboxyl (Martin ctv, 1999) 1.5 Hoạt động tuyến AG (Androgenic gland) Tuyến androgenic có nhiều tơm đực xanh, chứa mạng lưới nội chất sần sùi tế bào chất Hoạt động tuyến androgenic đóng vai trị kiểm sốt hoạt động phát dục M rosenbergii (Okumura Hara, 2004) Tuyến androgenic hormone tuyến đực xác định cua Callinectes sapidus Cronin (1947) Ở giáp xác 10 chân tuyến androgenic nằm tận ống dẫn tinh Các tế bào xếp thành lớp mỏng, song song nối hay cấu trúc dạng thùy Ở M rosenbergii tuyến androgenic kết hợp cấu trúc (Sagi, 1995) Tuyến androgenic có vai trị điều khiển giới tính giáp xác mười chân Nó làm xuất đặc điểm hình thể bên đực (Taketomi ctv, 1990) Tuyến androgenic hormone chịu trách nhiệm biệt hóa giới tính đực giáp xác (Charniaux-Cotton Payen, 1985; Katakura, 1989) Gần hormone tuyến androgenic xác định hormone peptide trình tự cDNA phát Armadillidium vulgare (Martin ctv, 1999; Okuno ctv, 1999) Tuyến androgenic có chức điều khiển giới tính đực khác nhau, tuyến sinh dục khác phát triển phần phụ sinh dục tôm xanh M 11 Đồ án tốt nghiệp rosenbergii (Nagamine ctv, 1980) Sự phát triển mạng lưới nội chất sần sùi tế bào chất tuyến androgenic có liên quan đến hoạt động sinh sản đực vài loài giáp xác mười chân (King, 1964; Taketomi ctv, 1990) Ở tơm đực M rosenbergii, phân biệt kiểu hình thái nhờ vào màu sắc chiều dài hoạt động sinh sản: đực nhỏ, đực vàng đực xanh (Ra’anan Sagi, 1985; Kuris ctv, 1987) Mỗi kiểu hình thái mơ tả để phân biệt hoạt động sinh sản khác Con đực nhỏ có đơi ngắn, chưa có hoạt động giao phối phát triển thành đực cam Con đực cam thể phát triển nhanh chóng không giao phối Con đực cam phát triển thành đực xanh, đực xanh có hoạt động giao phối với trưởng thành Hoạt động sinh tinh thay đổi theo hình thái khác nhau; cao đực nhỏ đực cam, thấp đực xanh, tinh hồn tơm đực xanh đầy tinh trùng chín sử dụng để dự trữ (Sagi ctv, 1988) Sự khác biệt kiểu hình thái chịu tác động kiểm soát tuyến androgenic, tảng cho thí nghiệm cắt bỏ tuyến androgenic (Sagi ctv, 1990) Theo Fingerman (1997), AGH hormone điều khiển biệt hóa giới tính thành đực phát triển đặc điểm sinh dục đực thứ cấp Sự tiết GSH GIH cho quy định số chất dẫn truyền thần kinh tác động trực tiếp vào buồng trứng Ở đực, GIH tác động lên tinh hoàn gián tiếp điều khiển AG sau giảm tiết AGH Hormone kích thích tuyến sinh dục cần thiết để có sinh tinh xảy tinh hoàn AG tham gia vào q trình biệt hóa giới tính đực thơng qua việc tiết hormone AGH tín hiệu ban đầu tất bước cần thiết q trình biệt hóa giới tính phát triển đặc điểm đực (Ohs ctv, 2006) Nếu AG tiết AGH khơng đủ tuyến sinh dục biệt hóa thành tuyến sinh dục (Sagi ctv, 1995) Việc loại bỏ tuyến androgenic giai đoạn sớm phát triển dẫn đến phát triển ngược thành (Malecha ctv, 1992) 1.6 Bất hoạt gene iRNA (RNA interference) 1.6.1 Sơ lược iRNA 12 Đồ án tốt nghiệp iRNA tượng sợi kép RNA (dsRNA) có khả bắt cặp đặc hiệu với trình tự gene đích, thúc đẩy phân hủy gene đích ngăn chặn biểu dsRNA can thiệp gián tiếp vào trình phiên mã gene làm bất hoạt gene (PTGS-bất hoạt gene hậu phiên mã), kéo dài suốt trình tiến hóa Nó mơ tả mức độ phiên mã dịch mã, từ can thiệp vào suốt trình dịch mã tạo gene nội sinh; mức độ chất nhiễm sắc, cách hình thành nhiễm sắc thể nhân (Estrada ctv, 2007; Đỗ NăngVịnh, 2007) iRNA hệ thống bên tế bào sống, giúp kiểm soát gene hoạt động Đó đoạn RNA ngắn ức chế biểu gene có trình tự tương đồng với Các phân tử iRNA gây nên hiệu ứng: ức chế trình dịch mã mRNA, ức chế phiên mã gene nhân, phân giải mRNA Quá trình iRNA xảy mức độ sau phiên mã kích hoạt đoạn dsRNA-còn gọi siRNA, đoạn tạo từ dsRNA dài nhờ phân cắt enzyme RNase III Dicer đưa vào từ bên Sau đưa vào phức hợp RNA-inducing silencing (RISC) tế bào chất, siRNA làm trình tự đặc hiệu tương đồng với trình tự mRNA iRNA khám phá Andrew Fire Craig Mello tuyến trùng Caenorhabditis elegans sau tìm thấy lồi sinh vật khác, bao gồm động vật có vú (Fire ctv, 1998) 1.6.2 Lịch sử nghiên cứu iRNA Đến năm đầu thập niên 1990 số nhà khoa học công bố kết nghiên cứu iRNA tạp chí quốc tế (Napoli ctv, 1990) Năm 1992, Romano Macino phát tượng bất hoạt gene hậu phiên mã (PTGS) nấm men Neurospora crassa (Romano Macino, 1992) Năm 1995 tạp chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu Guo Kemphues đưa chứng tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng: Phân tử sense RNA gây ức chế gene (Guo Kemphues, 1995) 13 Đồ án tốt nghiệp Đến năm 1998, nhóm nghiên cứu Fire giải thích điều nghịch lý thí nghiệm tuyến trùng C elegans (Fire Mello, 1998) Năm 2000, Zamore PD ctv công bố việc phát hiện tượng dsRNA dài bị phân cắt thành đoạn ngắn khoảng 21-23 nucleotide Rnase III (Dicer) ruồi giấm Drosophila (Zamore PD ctv, 2000) Năm 2001, lần iRNA mô tả tế bào động vật có vú (Tuschl ctv, 2001) Năm 2006 giải thưởng Nobel sinh lý y học cho việc phát chế iRNA nhà bác học Mỹ Andrew Fire (Đại học Stanford) Craig Mello (Đại học Massachusetts) (Won Noble Prize, 2006) Năm 2010, lần chứng minh siRNA sản xuất gene ức chế đặc hiệu (giảm mRNA protein) người hoạt động theo chế iRNA (Davis ME ctv, 2010) 1.6.3 Vai trò iRNA điều khiển hoạt hóa gene, (Fire Mello, 1998) Chỉ có RNA sợi kép (dsRNA) có khả bất hoạt gene cách hiệu quả, RNA sợi đơn (sense antisense) có khả gây bất hoạt yếu khơng có khả gây bất hoạt gene dsRNA gây bất hoạt cách đặc thù, phân hủy phân tử mRNA có trình tự tương đồng với nó, phân tử mRNA khác khơng bị ảnh hưởng Các sợi dsRNA có khả gây bất hoạt gene có trình tự tương đồng với mRNA trưởng thành (mature RNA) (tức mRNA ngồi tế bào chất khơng cịn mang trình tự intron); Các trình tự tương đồng với intron promoter khơng có tác dụng Điều cho thấy dsRNA gây bất hoạt gene giai đoạn sau phiên mã (post transcriptional gene silencing - PTGS) xảy tế bào chất Chỉ cần vài phân tử dsRNA tế bào đủ để hồn thành q trình phân hủy mRNA Điều chứng tỏ dsRNA nhân tác dụng tác nhân xúc tác 14 Đồ án tốt nghiệp Tác động dsRNA lan rộng từ mô sang mô khác di chuyển tế bào 1.6.4 Cơ chế hoạt động iRNA Nghiên cứu hóa sinh iRNA ruồi giấm cho thấy RNA sợi kép (dsRNA) phân cắt thành đoạn dsRNA ngắn gồm 21-23 nucleotide (Tuschl ctv, 1999) Họ cho phân tử dsRNA ngắn (siRNA-small interference RNA) đóng vai trị phân hủy mRNA Sau nhóm Fire Mello xác định dsRNA dài cắt thành đoạn RNA ngắn (khoảng 25 nucleotide) siRNA gây phân hủy mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA (Parrish ctv, 2000) 15 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3 Cơ chế hoạt động iRNA (http://www.rnaiweb.com/RNAi/What_is_RNAi/) 16 Đồ án tốt nghiệp A Sao chép nội sinh đưa sợi ngoại sinh vào tế bào, dsRNA kích hoạt q trình iRNA B Quá trình thực RNase III enzyme Dicer, phản ứng phụ thuộc vào lượng ATP C Quá trình Dicer dsRNA dài thành siRNA 21-23 nucleotide siRNA tổng hợp bên ngồi tế bào sau đưa vào tế bào thơng qua q trình truyền nhiễm xung điện D Các siRNA kết hợp vào phức hợp RISC, bao gồm protein Argonaute (Ago) thành phần Ago tách loại bỏ thành phần khơng có tác dụng (sense) siRNA có ảnh hưởng đến hoạt động RISC E F Các sợi antisense siRNA tồn đóng vai trò sợi dẫn đường để RISC tác động vào mRNA tương đồng với nó, dẫn đến phân cắt endonucleotide mRNA đích (Fire ctv, 1998) 1.6.5 Ứng dụng iRNA động vật thủy sản Cơ chế iRNA làm bất hoạt gene sau phiên mã, chức tự nhiên chịu trách nhiệm chống lại nhiễm trùng virut đa số loài Kết làm bất hoạt gene Dicer-1 virut tôm sú (Penaeus mondon) làm tăng tỷ lệ chết virut, chế iRNA hoạt động mạnh mẽ có chức miễn dịch tốt tôm Mức cao Dicer tế bào bạch cầu đóng vai trị làm miễn dịch tự nhiên tôm (Kitagishi, 2012) Ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Dicer-2 bao gồm miễn dịch khơng đặc hiệu chống lại virut Dicer-2 góp phần vào chức miễn dịch không đặc hiệu tôm cách nâng cao hiệu lực iRNA (Kitagishi, 2012) Làm bất hoạt gene đích có hiệu lực cao, miễn dịch đặc hiệu chống lại virut đốm trắng (WSSV) virut Taura tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Penaeus vannamei) cách tiêm dsRNAs sợi dài có trình tự mã hóa cấu trúc protein virut Sử dụng dsRNA tác động vào gene mục tiêu virut đầu vàng (YHV) thu hiệu miễn dịch đặc hiệu giống virut tôm sú Penaeus monodon (Sarathi, 2010) 17 Đồ án tốt nghiệp dsRNA can thiệp gián tiếp vào hầu hết trình phiên mã gene, làm bất hoạt gene Chức gene nghiên cứu sinh vật nước cách sử dụng iRNA Kỹ thuật iRNA ứng dụng sinh vật nước: cá ngựa vằn (Danio rerio) tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus schimitti) Đại Tây Dương Kết chứng minh iRNA sử dụng công cụ để nghiên cứu chức sinh học gene có liên quan đến phát triển cá ngựa vằn Các nghiên cứu gần chứng minh tính hữu ích dsRNA thể tôm trưởng thành Hơn nữa, khả dsRNA ức chế chức hormone hyperglycemic (CHH) tôm Đại Tây Dương nghiên cứu (Estrada ctv, 2007) Ảnh hưởng iRNA tơm giải thích thí nghiệm in vivo cách tiêm dsRNA có trình tự tương đồng với gene mã hóa gonal inhibiting hormone (GIH) tơm cát Metapenaeus ensis dsRNA làm giảm biểu GIH (Guan ctv, 2004) Công nghệ iRNA nghiên cứu động vật thân mềm mảnh, định chức gene sò Crassostrea gigas Việc tiêm dsRNA tương ứng với gene Oyster vasa-like gene (Oyvlg) vào tuyến sinh dục làm ức chế trình giảm phân làm bất hoạt sản sinh tế bào phơi sị Crassostrea gigas (Fabioux ctv, 2009) iRNA có ảnh hưởng đến yếu tố tạo tua khác loài bạch tuộc Sepia oficinalis (Grimaldi ctv, 2004) 1.7 Các phương pháp chuyển đổi giới tính tơm xanh 1.7.1 Cơ sở lý thuyết Cặp nhiễm sắc thể giới tính tôm xanh đực đồng giao tử (ZZ) dị giao tử (WZ) Để tạo dòng đơn tính tồn đực (100% tơm đực ZZ) cần có tơm bố tơm mẹ có NST ZZ Sơ đồ tạo dịng đơn tính đực: 18 Đồ án tốt nghiệp ♂ (ZZ) X ♀ (ZZ) 100% ♂ (ZZ) Để tạo dịng tồn đực việc cần thiết phải tạo tôm giả mang NST ZZ (Ra’anan Cohen, 1984) 1.7.2 Kỹ thuật chuyển giới tính Sử dụng hormone đực hóa trộn vào thức ăn cho tơm ăn, hịa tan thành dịch để ngâm, tắm tơm khoảng thời gian định Đàn tơm tồn đực tạo gồm cá thể tơm đực có kiểu di truyền ZZ tơm đực có kiểu di truyền WZ chuyển giới tính Kết sử dụng hormone chuyển giới tính tơm phụ thuộc vào số yếu tố loại hormone, thời gian, liều lượng sử dụng, giai đoạn phát triển tôm đưa vào xử lý (Phạm Anh Tuấn, 2002) 1.7.3 Tạo tôm giả ZZ hormone Hiện nay, steroid sử dụng để thay đổi kiểu hình giới tính cá ngâm tiêm qua chế độ ăn trước biệt hóa giới tính Điều mang lại hy vọng việc sử dụng hormone để điều khiển giới tính động vật giáp xác Điều khiển chế độ ăn chứa hormone xem phương pháp thiết thực quy mô thương mại Tuy nhiên, phương pháp mang lại thách thức khả hormone rò rỉ từ viên thức ăn từ cố tiêu hóa, đặc biệt thay đổi thức ăn chế biến trước tiêu thụ (Ohs ctv, 2006) Năm 2006, Dewi ctv dùng hormone 17β-estradiol bổ sung vào thức ăn để điều khiển giới tính tơm xanh Kết thu 17β-estradiol không ảnh hưởng đến tỷ lệ đực tôm xanh (Dewi ctv, 2006) Năm 2004, Baghel ctv nghiên cứu ảnh hưởng chuyển đổi giới tính cho ấu trùng tơm xanh ăn artemia làm giàu với 17α-methyltestosterone, dạng steroid động vật có xương sống, kết cho thấy 17α-methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính tơm xanh từ thành đực Nhưng năm 2006, Ohs ctv dùng 17α-methyltestosterone bổ sung vào thức ăn để chuyển giới tính tơm xanh, nhiên kết lại cho thấy 17α-methyltestosterone khơng có 19 ... tơm xanh thương mại Xuất phát từ nhu cầu giống tơm xanh đực từ thị trường đề tài ? ?Thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded RNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii. .. dung cần thực là: + Tổng hợp Mr-IAG RNA mạch đôi cho kỹ thuật bất hoạt RNA + Kiểm tra hiệu Mr-IAG RNA mạch đôi việc chuyển đổi giới tính tơm xanh với nồng độ tần suất tiêm khác Đồ án tốt nghiệp. .. đơi có màu xanh đậm, xuất nhiều gai nhọn lơng tơ Q trình thay đổi thể qua giai đoạn như: tôm nhỏ, tôm lửa nhạt, tôm lửa đậm, tôm lửa đậm chuyển tiếp xanh, tôm xanh nhạt, tôm xanh đậm tôm già (Nguyễn