Báo cáo về đề tài phân lập vi sinh vật 3 chủng vi khuẩn, 1 chủng nấm men, 1 chủng nấm mốc. Kèm hình ảnh, lời giải thích cụ thể. Cung cấp lời giảng của giáo viên
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM Báo cáo thực hành môn VI SINH VẬT HỌC Đề tài: Phân lập, xác định thành phần đặc điểm chủng vi sinh vật mẫu GVHD: Nguyễn Thị Lan Hương NHÓM SINH VIÊN: Nhóm tổ Lớp: DHSH17A TP HCM, ngày 15 tháng 11 năm 2022 Danh sách tổ Tên sinh viên MSSV Đoàn Minh Tâm 21086561 Dương Kim Quỳnh Như 21061381 Đặng Thị Huyền Ngân 21094021 Huỳnh Văn Phước 21089341 Phan Nhật Tân 21078831 Đào Công Minh 21105571 Lý Thiên Thanh 21074491 Đề tài: Phân lập, xác định thành phần đặc điểm chủng vi sinh vật mẫu I) MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI - Phân lập, xác định thành phần đặc điểm chủng vi sinh vật mẫu PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II) Chọn mẫu xử lí mẫu Chọn mơi trường nuôi cấy mẫu Cấy phân lập (Iculation) Quan sát đại thể, vi thể (Inspection) Tách vi sinh vật (Isolaton) Ủ (Incubation) Nhuộm Gram Chọn TK (+); TK (-); nấm men; nấm mốc; cầu khuẩn (+) Cấy truyền làm vsv vào ống nghiệm III) KẾT QUẢ DỰ KIẾN Phân lập chủng vi sinh vật Trực khuẩn (+) Trực khuẩn (-) Cầu khuẩn (+) Nấm men Nấm mốc IV) TÀI LIỆU THAM KHẢO https://microbiologysociety.org/publication/education-outreachresources/basic-practical-microbiology-a-manual.html Kế hoạch đề tài Buổi 1: Lên kế hoạch phân công chi tiết Buổi 2: Pha môi trường nuôi cấy phân lập Buổi 3: Quan sát kính hiển vi tiêu soi tươi, cấy truyền làm lần Buổi 4: Nhuộm Gram, cấy truyền lần Buổi 5: Kiểm tra độ cấy vào ống nghiệm BUỔI 1: Lên kế hoạch phân công chi ( 18/10/2022 ) 1) Công việc - Đọc hiểu quy trình làm ni cấy vi sinh vật (Qui trình phân lập) Chọn mẫu vi sinh vật ni cấy ( nước mía, đất) Xử lí mẫu nước muối sinh (Trình bày rõ buổi 2) Pha chế đổ môi trường (Trình bày rõ buổi 2) Cấy phân lập vi sinh vật, làm mẫu chung (Trình bày rõ buổi 2) Khảo sát đại thể, vi thể, cấy truyền làm (Trình bày buổi 3) Nhuộm Gram, cấy truyền làm (Trình bày buổi 4) Kiểm tra độ chủng vi sinh bảo quản giống (Trình bày buổi 5) - Lên kế hoạch phân công công việc cho thành viên - Khảo sát môi trường nuôi cấy Môi trường Cao thịt – Peptone (Vi khuẩn) Môi trường Hasen (Nấm men) Môi trường PDA (Nấm mốc) 2) Tính tốn đĩa Petri (20 đĩa) đĩa PDA đĩa Hansen 10 đĩa cao thịt - peptone 3) Thảo luận với giáo viên: đĩa đổ – 10ml mơi trường 4) Rửa, gói, sấy đĩa Petri *THAO TÁC THỰC HIỆN* - Bước 1: Rửa đĩa petri nước lau khô đĩa - Bước 2: Chuẩn bị giấy báo để gói đĩa petri - Bước 3: Cho 3-4 đĩa petri vào giấy báo - Bước 4: Gói giấy báo chứa đĩa cẩn thận gói chặt giấy báo đưa vào tủ sấy tiệt trùng 180 độ vòng 30 phút *CÁC BƯỚC SỬ DỤNG TỦ SẤY* Bước 1: mở cửa tủ đặt mẫu cần sấy vào buồng tối cho không đụng vào thành tủ, đóng cửa tủ lại Bước 2: cắm điện khởi động tủ sấy Bước 3: tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy nhiệt độ thích hợp (dụng cụ thủy tinh, kim loại), sấy 180 độ C 30 phút Bước 4: tủ vận hành,nhiệt độ đạt đến giá trị điều chỉnh Bước 5: đợi nhiệt độ tủ nhiệt độ mơi trường xung quanh mở tủ lấy mẫu vật BUỔI 2: Pha môi trường nuôi cấy phân lập ( 25/10/2022 ) 1) Làm dung dịch nước muối sinh lí - Dùng pipet bóp cao su hút ống nghiệm 10 ml nước muối sinh lí cho vào 10 ống đậy nắp lại - Đưa dàn nước muối sinh lí vào nồi hấp khởi động - Hấp 30 phút 1200C 2) Pha chế môi trường dinh dưỡng - Cách thức pha chế môi trường Cân đo đong đếm thành phần Để riêng thành phần riêng Cho nước trộn thành phần riêng lẻ Sau phối chế thành phần riêng lẻ theo nguyên tắc thể tích tăng dần (trong mơi trường có chất kết tủa chất đầu tiên, vừa đổ vừa khuấy chất sau vừa đổ vừa khuấy) => để tránh gây kết tủa Đem vào lò vi sóng đun sơi cho Agar nở - Mỗi tổ pha chế mơi trường cho nhóm xài Tổ môi trường PDA Tổ môi trường cao thịt – peptone Tổ môi trường Hansen - Môi trường PDA Dịch chiết khoai tây: 100g Succarose: 10g Agar: 10g Thêm nước cất lên đủ 400ml đem đun sôi cho tan agar - Phối chế môi trường ống nghiệm Đổ môi trường đun sôi vào ống nghiệm (10-12 ml) Đậy nắp mang giá ống nghiệm có ống nghiệm hấp Sau đem ống nghiệm đặt lên giá nghiêng để làm thạch nghiêng Ống nghiệm thạch nghiêng - Phối chế môi trường đĩa Petri Sau đun sơi đổ vào bình thủy tinh có nắp vặn bình Erlen (làm nút bơng khơng thấm sau lấy giấy bạc buộc chặt) Mang hủ thủy tinh có mơi trường hấp tiệt trùng Tiệt trùng xong đem đổ môi trường vào đĩa Petri (sấy tiệt trùng) tiệt trùng môi trường vô trùng ( đèn cồn buồng cấy vô trùng) - Cách sử dụng nồi hấp Bước 1: kiểm tra nồi hấp, khố van (van thơng nồi, vặn xả khí) Kiểm tra mật độ nước (mực nước đạt từ 1/2 đến 2/3 ống nước) bọt khí, khóa van nước Bước 2: bật cầu dao Bước 3: đồng hồ nồi lên 1atm, 121độ C Cho dụng cụ môi trường cần hấp vào nồi, khóa nắp theo quy tắc đối xứng hai bên Mở van thông hai nồi Bước 4: chờ đồng hồ nồi lên 1atm, mở van xả khí (3-5phút) Sau đóng van xả khí chờ đồng hồ lên 1atm bắt đầu tính 30 phút 121 độ Bước 5: Sau thời gian hấp tiệt trùng đóng van thơng hai nồi, tắt cầu dao, xả khí, đồng hồ xuống 0atm, mở nắp 3) Xử lí mẫu - Pha loãng mẫu lỏng Lấy 10 ống nghiệm chứa 9ml NaCl 0,9% vào ống nghiệm đậy nắp cho vào nồi hấp tiệt trùng 15p Mẫu - Pha loãng mẫu rắn 10g vật mẫu rắn vào 90ml dd NaCl 0,9% => huyền phù (là hạt vsv lơ lửng nước) Lấy ống nghiện chứa 9ml dd NaCl 0,9% vào ống nghiệm đậy nắp cho vào nồi hấp tiệt trùng 15p 4) Cấy phân lập – mẫu chung - Cấy trải Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng hấp tiệt trùng hạ nhiệt độ xuống tối thiểu 400C Đổ 10-12ml môi trường vào dĩa thạch vô trùng để nguội cho đông lại 24h, lấy 0,1ml mẫu pha loãng, dùng que trải khử trùng trải mẫu thạch bề mặt thạch khô lại đem ủ - Cấy đổ Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng hấp tiệt trùng hạ nhiệt độ xuống tối thiểu 400C Lấy 1ml mẫu pha loãng, xoay nhẹ cho mẫu trải đổ10 12ml môi trường dinh dưỡng vào lắc xoay nhẹ cho mẫu lan đều, để yên cho đông lại đem ủ 3) Khảo sát vi thể kính hiển vi quang học - Kính hiển vi quang học Hệ thống học: giá kính gồm đế kính, thân kính, trụ đỡ xoay thị kính, ổ gắn xoay vật kính, bàn kính, trượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc chỉnh thô ốc chỉnh tinh Hệ thống quang học: thị kính, vật kính, tụ quang, chắn sáng, nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng kính chiếu sáng) Cách vệ sinh kính: Dùng chổi mềm bóp thổi bụi để thổi hạt bụi Sử dụng tăm gạc nhúng vào dung môi làm Xylen dung dịch Xylen cồn tỉ lệ 1:1 Lau vật kính theo hình xoắn ốc Sau lau xong kiểm tra lại có dung mơi thừathì dùnglấy giấy lau lại Sử dụng bóp thổi bụi thổi bụi cịn lại Kiểm tra lại lần sau để kính vào tủ bảo quản nơi bảo quản kính - Làm tiêu giọt ép Bước 1: Nhỏ giọt nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) miếng Lame kính Bước 2: Dùng que cấy để lấy sinh khối vsv vừa đủ (tùy vào đối tượng vsv mà sử dụng loại que cấy khác nhau) môi trường nuôi cấy để đưa vào vùng nước muối sinh lý vừa nhỏ Bước 3: Hòa loãng sinh khối vsv vừa lấy vào nước muối sinh lý vừa nhỏ vào miếng Lame: Nấm men đánh tan hồn tồn nấm men dễ để quan sát kính hiển vi Vi khuẩn tế bào vi khuẩn nhỏ nhiều so với nấm men nên đánh tan phần sinh khối, chừa lại góc khơng đánh tan vào nước muối sinh lý để làm dấu, để có vết mà dễ quan sát thấy kính hiển vi Cịn nấm mốc khơng đánh tan ra, nấm mốc cấu tạo hệ sợi, đánh tan làm đứt gãy sợi nấm mốc làm đứt quan sinh bào tử mà cần phải quan sát làm cho không quan sát Bước 4: Đặt miếng Lamen theo góc 45 từ từ hạ xuống phần nước muối sinh lý có chứa sinh khối vsv vừa lấy để tránh tạo bọt khí Và cuối đặt tiêu lên giá đỡ tiêu kính hiển vi bắt đầu quan sát Vi khuẩn soi tươi - - Nhận xét: Vi khuẩn soi tươi có điểm chấm màu trắng nhỏ 4) Đổ môi trường vào đĩa cấy phân lập Môi trường sử dụng SDA Mục tiêu: Tìm khuẩn lạc nấm men, nấm mốc Phương pháp cấy: Cấy đổ, cấy trải 5) Cấy truyền làm Đối với vi khuẩn (Cấy ria chữ T) Bước 1: Vệ sinh tay trước làm việc mặt bàn cồn 70 Bước 2: Chuẩn bị que cấy đầu tròn tiệt trùng que cấy lửa đèn cồn Bước 3: Tay phải cầm que cấy hơ lửa cho nóng hơ phần thân gần nơi đầu que cấy Bước 4: Tay trái cầm đĩa chứa mẫu vi sinh vật hơ xung quanh đĩa mở nghiêng đĩa gần lửa cho vừa đủ để que cấy vào đĩa Bước 5: Để que cấy nguội đưa que cấy vào đĩa petri lấy sinh khối vi sinh vật đậy nắp đĩa petri hơ kỹ Bước 6: Lấy đĩa petri có môi trường cấy vào đĩa Kỹ thuật cấy: Lấy sinh khối Ria đường số hơ loại bỏ VSV Từ đường số ria đường số hơ loại bỏ VSV từ đường số ria đường số hơ loại bỏ vi sinh vậtTừ đường số ria đường số (Lưu ý đường số khơng đụng vào đường cịn lại) Đối với nấm mốc (Cấy gõ cấy điểm) Làm vào 8/11/2022 1/11/2022 chưa có mẫu BUỔI 4: Nhuộm Gram, khảo sát vi thể, cấy truyền làm (8/11/2022) 1) Kiểm tra đĩa Petri cấy phân lập Nấm men 2) - - Nấm mốc Đã xuất khuẩn lạc nấm men nấm mốc Khảo sát đại thể, vi thể nấm men nấm mốc (Đã trình bày phương pháp buổi 3) a) Đại thể Nấm men: Vết hình trịn nhỏ, màu trắng sữa Nấm mốc: Vết trịn màu đen, rìa ngồi có sợi lơng mịn bơng b) Vi thể Sử dụng kính hiển vi quang học làm tiêu giọt ép Nấm mốc Nấm men - Nấm mốc: Có cấu trúc dạng sợi phân nhánh, đám sợi chằng chịt, màu đen 3) - Nấm men: Cấu trúc hình cầu, hình bầu dục, màu trắng sữa Cấy truyền làm nấm men nấm mốc Đối với nấm men bước làm tương tự vi khuẩn (buổi 3) Đối với nấm mốc Bước 1: Vệ sinh tay trước làm việc mặt bàn cồn 70 Bước 2: Chuẩn bị que cấy đầu móc tiệt trùng que cấy lửa đèn cồn Bước 3: Tay phải cầm que cấy hơ lửa cho nóng hơ phần thân gần nơi đầu que cấy Bước 4: Tay trái cầm đĩa chứa mẫu vi sinh vật hơ xung quanh đĩa khẽ mở nghiêng đĩa gần lửa cho vừa đủ để que cấy vào đĩa Bước 5: Để que cấy nguội đưa que cấy vào đĩa petri lấy bào tử sợi nấm đậy nắp đĩa petri hơ kỹ phần mở nắp lúc úp ngược đĩa đẩy đĩa vng góc mặt bàn Bước 6: Lấy đĩa petri có mơi trường cấy vào đĩa Kỹ thuật cấy: Sử dụng cấy gõ cấy điểm Cấy điểm: Đưa que cấy vào đĩa, chấm điểm sâu đĩa rút que cấy tiệt trùng, muốn đẹp cấy điểm tạo tam giác Cấy gõ: Lấy sinh khối nấm mốc đưa vào đĩa, gõ nhẹ lên nắp đĩa, bào tử rơi rải rác khắp mặt đĩa), rút que cấy tiệt trùng đóng miệng đĩa 4) Kiểm tra đĩa cấy truyền vi khuẩn Đĩa Đĩa Đĩa - Nhận xét: Đĩa đường cấy chưa đẹp, khuẩn lạc chưa phân bố rộng Đĩa chưa có đám vết trắng chưa rõ xuất Đĩa đường cấy vi khuẩn bị lan đường cấy chạm vào - Nguyên nhân: Đĩa 1: Do kĩ thuật ria chưa đường Đĩa 2: Do thao tác lấy mẫu sinh khối bị dính sinh khối khác Đĩa 3: Do đường ria bị dính vào - Giải quyết: Cấy truyền làm lại đĩa 5) Những khó khăn cách giải - Khó khăn: Hết đĩa mơi trường chưa cấy, hết môi trường cao thịt – peptone, hết môi trường SDA - Giải quyết: Bàn bạc với thành viên nhóm định làm thêm buổi ngồi vào ngày 13 tháng 11 năm 2022 6) Nhuộm Gram - Các bước thực Chuẩn bị vết bôi: + Nhỏ giọt canh trường (là môi trường lỏng chứa VSV) lên Lame kính + Đánh tan sinh khối VSV khoảng cm sau lấy Cố định vết bơi: + Cầm Lame kính hơ qua đầu lửa (2-3 lần) => Giết chết vi sinh vật để dễ bắt màu; gắn chặt vi sinh vật giúp vết bơi khó bị rửa trơi Nhuộm tím kết tinh + Nhỏ giọt tím kết tinh lên tiêu chờ phút (Mục đích: crystal violet tích điện dương liên kết với thành tế bào vi khuẩn gram dương màng vi khuẩn gram âm tích điện âm dẫn đến bắt màu) Rửa nước cất Nhuộm Lugol + Nhỏ giọt Lugol lên tiêu chờ phút (Mục đích: Giúp thuốc nhuộm tím kết tinh gắn chặt vào tế bào giúp gắn màu chặt hơn) Rửa nước cất Dùng cồn 96 rửa (Mục đích: làm màu vi khuẩn gram (-) lớp phospholipid, thành phần lipid nên dễ tan cồn làm lộ lớp peptidoglycan mỏng liên kết CV-I lỏng lẻo làm màu tím kết tinh Gram (+) tế bào bị nước, peptidoglycan co lại lỗ => bắt màu chặt hơn) Rửa nước cất Nhuộm thuốc nhuộm bổ sung + Nhỏ thuốc nhuộm đỏ vàng safranin đỏ tía fuchsin + Chờ phút rửa nước cất + Hơ khô tiêu cho giọt dầu soi vào quan sát vật kính 100X Đĩa - Nhận xét: Mẫu vi khuẩn sau nhuộm Gram quan sát vi khuẩn bắt màu đỏ tía, dạng hình que - Kết luận: Đĩa có chứa trực khuẩn Gram âm Đĩa - Nhận xét: Mẫu vi khuẩn sau nhuộm Gram quan sát vi khuẩn bắt màu tím, có dạng hình cầu - Kết luận: Đĩa có chứa Cầu khuẩn Đĩa - Nhận xét: Mẫu vi khuẩn sau nhuộm Gram quan sát vi khuẩn bắt màu tím, có dạng hình que - Kết luận: Đĩa chứa trực khuẩn Gram dương 1) 2) - - BUỔI LÀM THÊM (13/11/2022) Hấp bỏ đĩa mơi trường hư Gói đĩa hư vào giấy báo cho vào nồi kín Sử dụng nồi hấp để hấp bỏ (Đã trình bày bước sử dụng nồi hấp buổi 2) Rửa sạch, lau khơ gói đĩa lại cho vào tủ sấy nhiệt độ 1800C 30 phút Pha chế môi trường hấp mơi trường Mơi trường SDA (đã trình bày buổi 3) Môi trường cao thịt – peptone Cao thịt: 0,6g Peptone: 2g NaCl: 1g Agar: 4g Thêm nước cất đủ 200ml Nôi sôi cho tan Agar Môi trường đun sôi xong cho vào Erlen có nút bơng khơng thấm bọc miệng bình giấy báo Đem hấp 1210C 30 phút 3) Kiểm tra đĩa nấm mốc nấm men cấy truyền Nấm men Nấm mốc - Nhận xét: Đĩa nấm men nấm mốc - Kết luận: Lấy sinh khối đĩa cấy vào ống nghiệm để bảo quản giống 4) Cấy vào ống nghiệm (Nấm men, nấm mốc) Bước 1: Chuẩn bị ống nghiệm thạch nghiêng có mơi trường phù hợp đĩa mẫu chứa vi sinh vật Bước 2: Sử dụng trang suốt trình cấy; khử trùng tay bàn trước làm việc Bước 3: Tiệt trùng que cấy lấy sinh khối vi sinh vật từ đĩa Bước 4: Tay trái cầm ống nghiệm, tay phải cầm que cấy, ngón út lịng bàn tay tay phải cầm giữ nút ống Bước 5: Khử trùng miệng ống nghiệm, đưa que cấy trơn vào đáy ống nghiệm ria theo vòng xoắn từ kéo lên hướng gần miệng ống (đối với vi khuẩn, nấm men), dùng que cấy nhọn đâm điểm vào thạch ( nấm mốc) Bước 6: Rút que cấy ra, hơ miệng ống nghiệm; đóng nút ống nghiệm, khử trùng que cấy 5) 6) - Đổ môi trường Lấy bình Erlen chứa mơi trường hấp tiệt trùng Lấy đĩa Petri sấy tiệt trùng Thao tác đổ mơi trường ( trình bày buổi 2) Để đĩa nguội Số lượng đĩa đổ: cao thịt - peptone Cấy truyền làm vi khuẩn Qui tắc cấy truyền làm (Sử dụng cấy ria chữ T) Đã trình bày buổi Cấy vào đĩa, chủng đĩa Cấy truyền làm vi khuẩn lần BUỔI 5: Kiểm tra độ cấy vào ống nghiệm (15/11/2022) 1) Kiểm tra đĩa cấy truyền vi khuẩn lần - Có đĩa cầu khuẩn, đĩa trực khuẩn Gram âm, đĩa trực khuẩn Gram dương Trực khuẩn Gram + Cầu khuẩn Trực khuẩn Gram - 2) Cấy vào ống nghiệm kiểm tra ống nấm men nấm mốc - Qui tắc cấy trình bày buổi làm thêm - Sau ngày ta thu được: ống nấm mốc ống nấm men ống trực khuẩn Gram + ống trực khuẩn Gram – ống cầu khuẩn Nấm mốc Nấm men Trực khuẩn Gram + Trực khuẩn Gram - Cầu khuẩn 3) Viết nộp báo cáo cuối kì cho - Người viết: Đoàn Minh Tâm - Ảnh + Clip: Lý Thiên Thanh, Đào Công Minh, Dương Kim Quỳnh Như - Kiểm tra báo cáo: Đoàn Minh Tâm 4) Hấp bỏ, rửa đĩa, trả đĩa dụng cụ - Cả nhóm thực Hết ... 21074491 Đề tài: Phân lập, xác định thành phần đặc điểm chủng vi sinh vật mẫu I) MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI - Phân lập, xác định thành phần đặc điểm chủng vi sinh vật mẫu PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... muối sinh lý vừa nhỏ Bước 3: Hịa lỗng sinh khối vsv vừa lấy vào nước muối sinh lý vừa nhỏ vào miếng Lame: Nấm men đánh tan hồn tồn nấm men dễ để quan sát kính hiển vi Vi khuẩn tế bào vi khuẩn... mơi trường phù hợp đĩa mẫu chứa vi sinh vật Bước 2: Sử dụng trang suốt trình cấy; khử trùng tay bàn trước làm vi? ??c Bước 3: Tiệt trùng que cấy lấy sinh khối vi sinh vật từ đĩa Bước 4: Tay