321 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA BỘ Ư TẬP VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG Nguyễn Tấn Lộc, Lê Thị Mỹ Diệu*, Nguyễn Bảo Trân, Trần Minh Thư, Nguyễn Ngọc Gia Bảo Vi[.]
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA BỘ Ư TẬP VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG Nguyễn Tấn Lộc, Lê Thị Mỹ Diệu*, Nguyễn Bảo Trân, Trần Minh Thư, Nguyễn Ngọc Gia Bảo Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương TÓM TẮT Vi khuẩn Lactobacillus thể khả kháng nấm Aspergillus flavus sinh aflatoxin phân lập từ hạt đậu phộng Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn sau 16 thể khả kháng nấm Aspergillus flavus sinh aflatoxin từ khảo sát phương cấy đối kháng đ a thạch Từ khóa: Aspergillus sinh aflatoxin, hoạt tính kháng nấm, Lactobacillus, phương pháp cấy đối kháng, vi khuẩn lên men lactic ĐẶT VẤN ĐỀ Lactobacillus spp vi khuẩn gram (+), hình que hình cầu, khơng sinh bào tử, sinh acid lactic tạo thành phần vi khuẩn đường ruột thông thường người động vật Chúng đẩy mạnh kháng lại sinh vật ngoại sinh sinh vật mang mầm bệnh, hình thành hợp chất đối kháng: bacteriocin đồng thời có khả ức chế phát triển nấm mốc sinh độc tố aflatoxin Aflatoxin độc tố vi nấm gây ung thư gan sản sinh tự nhiên số loài thuộc chi Aspergillus đáng ý Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Bên cạnh sử dụng biện pháp, canh tác phun thuốc, xu hướng xử lý hạt giống diệt mầm bệnh Xử lý nguồn bệnh tồn hạt giống trước gieo trồng điều quan trọng việc đảm bảo chất lượng hạt giống, vừa tăng khả chống chọi hạt khỏi tác nhân gây bệnh, ngăn ngừa nguồn bệnh lan truyền từ hạt sang đồng ruộng, vừa làm tăng sản lượng thu hoạch có lợi cho người nông dân Xử lý hạt giống hóa chất ngày sử dụng rộng rãi để phịng trừ sâu bệnh hại nơng nghiệp với ưu điểm tác dụng nhanh, tương đối đơn giản, đem lại hiệu kinh tế cao… Nhưng hợp chất hóa học dần có yếu điểm độc hại với môi trường gây ô nhiễm đất, nguồn nước khơng khí, hình thành lồi kháng thuốc, ảnh hưởng đến quần thể sinh vật đặc biệt ảnh hưởng đến sức khỏe người Việc sử dụng hoạt chất sinh học vừa có tác dụng kháng nấm, vừa không gây hại cho người hướng mở rộng chủng nghiên cứu ứng dụng nhiều chủng sinh acid lactic Đã có nhiều nghiên cứu khả kháng nấm vi khuẩn lactic (Laitila A cộng (2002),[4]; Kim Jeong Dong (2005),[3]; Muñoz R cộng (2010),[5]), nhiên Việt Nam có nghiên cứu vấn đề 321 chưa có ứng dụng vào bảo quản Mục tiêu nghiên cứu khảo sát khả kháng nấm sinh aflatoxin sưu tập sẵn có vi khuẩn lên men lactic phịng thí nghiệm khả ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Chủng vi khuẩn Lactobacillus spp (L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1) cung cấp Phịng Thí nghiệm Khoa Vi sinh thuộc Trường Đại học Cơng nghệ Tp.Hồ Chí Minh Các chủng nấm mốc thị thuộc Aspergillus flavus CĐP1, CĐP2 phân lập từ hạt đậu phộng mốc cung cấp Khoa Vi sinh thuộc Trường Đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh Daconil từ nhà sản xuất Cơng ty TNHH Việt Thắng Bảng 1: Nguồn phân lập chủng vi khuẩn Lactobacillus Ký hiệu chung Nguồn phân lập KCIA Kim Chi L5, L3, L1, L10L, L2N Nem chua C1 Cơm mẻ 2.2 Phương pháp 2.2.1 Khảo sát tính khiết đặc điểm ni cấy chủng Lactobacillus spp Chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 tăng sinh môi trường MRS Broth ủ 37 oC 24 Sau đó, tiến hành cấy chuyển MRS Agar ủ ngày 37 oC sau quan sát hình thái khuẩn lạc khảo sát đặc điểm ni cấy thí nghiệm sinh lý, sinh hố gồm: Nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalse, thử nghiệm khả sinh acid lactic (ARNOLD J P (1987), [1]), khả lên men đường khả di động 2.2.2 Khảo sát khả lên men lactic Nuôi cấy môi trường MRS lỏng 16 giờ, chuẩn độ acid tồng NaOH 0,1 N, thị phenolphthalein đến màu hồng nhạt Xác định hàm lượng acid tổng quy acid lactic theo công thức: %Acid lactic V 1.K 100 V2 đó: V1: Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml) V2: Thể tích ni cấy đem chuẩn độ (ml) K: Thể tích ni cấy đem chuẩn độ (Acid lactic 0,009) 322 2.2.3 Khảo sát khả đối kháng in vitro chủng Lactobacillus spp với Aspergillus flavus CĐP1 Chủng vi khuẩn Lactic L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 tăng sinh môi trường MRS Broth 37 oC, lắc 150 v/phút 16 giờ, tỷ lệ cấy giống 5% Môi trường sử dụng MRS Agar cải tiến Chủng nấm đục từ môi trường MRS cải tiến cấy trước ngày đặt vào tâm đ a Dịch nuôi cấy cấy đường cách mép đ a 15 mm với nghiệm thức cấy đồng thời với nấm cấy sau ngày Theo dõi đường kính phát triểm nấm Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Tính tỷ lệ kháng nấm theo công thức: Tỷ lệ ức chế (%) = D đối chứng + D thí nghiệm D đối chứng 100% đó: D đối chứng: Đường kính (cm) đ a nấm đối chứng D thí nghiệm: Đường kính (cm) đ a thí nghiệm 2.2.4 Khảo sát khả đối kháng nấm Aspergillus flavus CĐP2 đậu phộng Hạt đậu phộng rửa bằng cồn 70 sau rửa lại nước cất ba lần để nước Dịch nuôi cấy L3 L5 chuẩn bị để ngâm đậu phộng Các nghiệm thức ngâm sau: NT1: dịch nuôi cấy; NT2: dịch nuôi cấy pH6; NT3: dịch nuôi cấy đun 100 oC, 15 phút; NT4: dịch nuôi cấy pH6, đun 100 oC 15 phút; NT5: đối chứng âm nước cất; NT6 đối chứng dương Daconil Đậu phộng ngâm xong để nhiệt độ phòng vào chai thủy tinh, bổ sung 0,1 ml huyền phù nấm mốc mật độ 1,2*104 để đạt mật độ 102 bào tử/g Theo dõi ngày mọc tơ nấm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát đặc điểm nuôi cấy Khảo sát tính khiết đặc điểm ni cấy chủng vi khuẩn giữ sưu tập cần thiết trước thử hoạt tính sinh học chúng Trên MRS agar, chủng Lactobacillus spp (L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1) khiết, có khuẩn lạc trịn lồi, mép nhẵn, trắng sữa Các đặc điểm ni cấy khác trình bày Bảng 1, cho thấy vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, khơng có khả di động, catalase âm tính, có khả sinh acid lactic, lên men đồng hình Bảng 2: Kết hình thái, sinh lý, sinh hố chủng Lactobacillus spp Đặc điểm Mơ tả hình thái tế bào Các chủng Lactobacillus spp L5 L3 L1 L2N Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn L10L Que ngắn KC1A C1 Que ngắn Que dài Nhuộm gram + + + + + + + Nhuộm bào tử - - - - - - - 323 Các chủng Lactobacillus spp Đặc điểm Mơ tả hình thái tế bào L5 L3 L1 L2N Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn L10L Que ngắn KC1A Que ngắn C1 Que dài Khả di động - - - - - - - Thử nghiệm Catalase - - - - - - - Khả sinh acid lactic (thuốc thử Uffelmann) + + + + + + + Lên men đường glucose, fructose, galactose, mannose, sucrose, lactose, maltose + + + + + + + Các thử nghiệm cho thấy, chủng L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 giữ đặc điểm chi Lactobacillus dựa Khóa phân loại Bergey Hình 1: Khuẩn lạc chủng L10L mơi trường MRS agar tế bào C1 nhuộm gram 3.2 Khảo sát khả lên men lactic Hàm lượng acid tổng chủng vi khuẩn L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 xác định sau nuôi cấy môi trường MRS Broth vịng 16 Trong chủng L2N sinh acid nhiều 1.656% chủng C1 có mật độ sinh khối cao ODhc600 nm = 9.036 Hình 2: Nồng độ acid tổng sinh khối sau lên men 16 môi trường MRS 324 3.3 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp Aspergillus flavus CĐP1 Để khẳng định chủng vi khuẩn có khả kháng nấm, chúng tơi tiến hành thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực tiếp vi khuẩn Lactobacillus spp (L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1) với chủng nấm sử dụng đối chứng dương Daconil Kết cho thấy chủng vi khuẩn có khả kháng nấm từ 25,3% - 47,5%, đối chứng Daconil thuốc trừ nấm thương mại kháng 19,3% cấy đồng thời nấm vi khuẩn Khi cấy khuẩn sau cấy nấm ngày để nấm phát triển trước thơng thường khả đối kháng giảm trường hợp Daconil chủng L10L, KC1A, L1, chủng L5 cho khả đối kháng không đổi, chủng L2N, L3, C1 lại cho khả đối kháng tăng Các chủng L1, L3, L5, L2N, L10L có khả kháng nấm Aspergillus sp CĐP1 xấp xỉ cao KC1A C1 Bảng 3: Tỷ lệ ức chế nấm (%) chủng Lactobacillus spp với CĐP1 Cấy khuẩn đồng thời cấy nấm Cấy khuẩn sau ngày cấy nấm L3 37,5 43,75 L5 40 39,2 L1 43,75 37,5 L2N 37,5 43,75 L10L 47,5 37,5 KC1A 28,75 16,25 C1 25,3 30,1 Daconil 19,3 15,24 Chủng lactic Đối chứng âm L5 Đối chứng dương (Daconil Hình 3: Thí nghiệm đối kháng Aspergillus flavus CĐP1 Lactobacillus sp L5 sau ngày đồng nuôi cấy 3.4 Kết bảo quản đậu phộng vi khuẩn lactic Các chủng L3 L5 chọn để tiếp tục khảo sát khả kháng nấm hạt đậu phộng Bảng cho thấy hai chủng L3 L5 kháng nấm Asp flavus CĐP2 khác Chủng L5 kháng nấm không xử lý nhiệt, pH kháng nấm tốt pH acid sau nuôi cấy Ngược lại, chủng L3 phải xử lý nhiệt trung hịa pH lại có khả kháng nấm tốt trường hợp khác 325 Bảng 4: Số ngày chưa mọc tơ nấm từ cấy nấm Chủng Không xử lý pH6 100 oC-15 phút pH6, 100 oC-15 phút ĐC- (H2O) Daconil L3 2 4.3 6.3 L5 4.7 6.3 1 6.3 KẾT LUẬN Tất chủng vi khuẩn Lactobacillus spp (L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1) có khả kháng nấm cấy đồng thời cấy khuẩn sau nấm 24 Bản chất hợp chất kháng nấm chủng khác nhau, cịn phụ thuộc vào xử lý nhiệt hịa sau ni cấy Kết cho thấy nên khảo sát khả kháng nấm invivo mở rộng cho chủng đối kháng invitro, sau kết hợp chủng có khả kháng nấm khác để sản xuất chế phẩm xử lý hạt giống TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ARNOLD J P, M.D (1987) ‚A New Test For Lactic Acid In The Gastric Contents And A Method of Estimating Approximately The Quantity Present‛ The Journal of the American Medical Association (JAMA) Vol XXIX, No.08 pp 371 [2] CAST (1989) Mycotoxins: Economic and health risks Task Force Report No.116 Ames, Iowa, United States: Council for Agricultural Science and Technology (CAST) [3] Kim Jeong Dong (2005) Antifungal Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi Against Aspergillus fumigatu Inha University, Incheon: Institute of Industrial Biotechnology [4] Laitila A, Alakomi H-L, Raaska L, Mattila-Sandholm T and Haikara A (2002) Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro and in malting of barley Findland : VTT Biotechnology [5] Muñoz R, Arena M.E,Silva J,González S.N (2010) Inhibition of mycotoxin-producing Aspergillus nomius vsc 23 by lactic acid bacteria and Saccharomyces cerevisiae Argentina: Facultad de Bioquímica 326 ... cứu khảo sát khả kháng nấm sinh aflatoxin sưu tập sẵn có vi khuẩn lên men lactic phịng thí nghiệm khả ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Chủng vi khuẩn. .. sau lên men 16 môi trường MRS 324 3.3 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp Aspergillus flavus CĐP1 Để khẳng định chủng vi khuẩn có khả kháng nấm, chúng tơi tiến hành thí nghiệm khảo sát khả đối kháng. .. phù nấm mốc mật độ 1,2*104 để đạt mật độ 102 bào tử/g Theo dõi ngày mọc tơ nấm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát đặc điểm nuôi cấy Khảo sát tính khiết đặc điểm ni cấy chủng vi khuẩn giữ sưu tập