26 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản Số 1/2021 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI SINH VẬT TRÊN PHI LÊ CÁ RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus) CUỐI QUÁ TRÌNH[.]
Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 1/2021 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI SINH VẬT TRÊN PHI LÊ CÁ RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus) CUỐI QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN PROXIMATE COMPOSITION AND MICROFLORA OF NILE TILAPIA (Oreochromis niloticus) FILLETS AT THE PROCESSING END Nguyễn Thị Kiều Diễm1,2, Mai Thị Tuyết Nga2 Khoa Công nghệ Thủy sản, Trường Cao đẳng Kinh tế - Kỹ thuật Cần Thơ Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang Tác giả liên hệ: Mai Thị Tuyết Nga (Email: ngamtt@ntu.edu.vn) Ngày nhận bài: 08/01/2021; Ngày phản biện thông qua: 26/03/2021; Ngày duyệt đăng: 29/03/2021 TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm khảo sát chất lượng cá rơ phi vằn sau q trình phi lê sau đông rời IQF, kết khảo sát cho thấy phi lê cá rô phi sau đơng lạnh có hàm lượng lipid 0,68% hàm lượng acid béo tự 4,87 g/100 g chất béo Chỉ số acid thiobarbituric (TBARS) phi lê sau phi lê đông lạnh thấp (lần lượt 0,06 ± 0,004 0,11 ± 0,012 mg MDA/kg), đồng thời hàm lượng peroxide sau phi lê sau trình đông lạnh ngưỡng phát Hàm lượng tổng nitơ bazơ bay (TVB-N) ban đầu phi lê cá rô phi sau phi lê 11,13 ± 0,74 sau đông lạnh 12,82 ± 1,22 mg N/100g thấp nhiều so với ngưỡng cho phép 25 mg N/100 g Lượng Pseudomonas spp., tổng số vi sinh vật hiếu khí (TVC), Clostridium perfringens, Coliforms E.coli nằm giới hạn cho phép, không phát có mặt vi sinh vật gây bệnh như: Samonella, Staphylococcus, Vibrio, Listeria Kết định danh vi sinh vật phi lê cá rơ phi cho thấy có diện vi sinh vật gây hư hỏng đặc trưng Pseudomonas lundensis Pseudomonas fragi Từ khóa: Lạnh đông, cá rô phi, phi lê, Pseudomonas spp., số peroxide, thành phần hoá học ABSTRACT The study aimed to investigate the quality of tilapia after filleting and IQF steps, the results showed that tilapia fillets contained 0.68% lipid and content amount of free fatty acids 4.87g of free fatty acids/100 g lipid The thiobarbituric acid (TBARS) value in the fillets were low (0.06 ± 0.004 and 0.11± 0.012 mg MDA/kg after filleting and freezing, respectively) and the peroxide contents were undetectable at these stages The of total volatile basic nitogen (TVB-N) values of tilapia fillets were 11.13 ± 0.74 and 12.82 ± 1.22 mg N/100 g after being filleted and frozen, accordingly, lower than that in the permitted threshold of 25 mg N/100 g The load of Pseudomonas spp., total viable count (TVC), Clostridium perfringens, Coliforms and E.coli were within the acceptable limits In addition, no such pathogens as Salmonella, Staphylococcus, Vibrio, or Listeria were observed in all samples The identification results of microorganisms isolated from tilapia fillets revealed that there was the presence of such specific spoilage organisms as Pseudomonas lundensis and Pseudomonas fragi Key words: Frozen, tilapia, fillets, Pseudomonas spp., peroxide value, proximate compositions I ĐẶT VẤN ĐỀ Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) biết đến nguồn nguyên liệu thuỷ sản phổ biến Đồng Sông Cửu Long, loại nguyên liệu có khả đáp ứng nhu cầu xuất mạnh mẽ cho Việt Nam năm qua Ở số quốc gia giới cá rô phi trở thành nguồn cung cấp protein chủ yếu [9] Năm 2019, sản lượng cá 26 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG rơ phi tồn giới đạt 6,5 triệu tấn, tăng 3,8% so với năm 2018 Theo ước tính, tốc độ tăng trưởng trung bình cá rô phi từ năm 2010 đến năm 2019 tồn giới 7,7% Trong đó, Trung Quốc quốc gia sản xuất cá rô phi đứng đầu giới, với sản lượng 1,7 triệu năm 2019 chiếm gần 50% tổng sản lượng toàn giới Trên giới quốc gia có sản lượng xuất cá rơ phi nhiều Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản phải kể đến Trung Quốc, Indonesia, Ai Cập, Brazil, Bangladesh, Philippines, Thái Lan Việt Nam [7], Việt Nam sản xuất cá rơ phi đứng hàng thứ giới [8] Do đó, cá rơ phi sản phẩm từ cá rơ phi đối tượng quan tâm phát triển Viêt Nam, đặc biệt phi lê cá rô phi, sản phẩm xuất phổ biến Thuỷ sản thực phẩm giàu dinh dưỡng cần thiết cho sức khoẻ người đặc biệt cá có nhiều acid béo không no với hàm lượng cao [14] Tuy nhiên, lipid chứa acid béo không no cao lại nguyên nhân gây ươn hỏng, từ làm giảm chất lượng thuỷ sản [13] Sự biến đổi chất lượng trình chế biến thuỷ sản phải kể đến oxy hóa chất béo, q trình đo số peroxide (PV) số acid thiobarbituric (TBARS) TBARS phản ảnh lượng aldehyde sinh hydroperoxide bị phân hủy giai đoạn ôi dầu [15, 19] Thêm vào đó, diện vi sinh vật phân hủy protein acid amin hình thành hợp chất cấp thấp, có nitơ bazơ bay đặc trưng bằnghàm lượng tổng nitơ bazơ bay (TVB-N) [1], thông số thường sử dụng để đánh giá chất lượng thuỷ sản Có thể nói vi sinh vật nguyên nhân thúc đẩy suy giảm chất lượng thuỷ sản, vi sinh vật đối tượng cần quan tâm theo dõi Sự lây nhiễm vi sinh vật xảy trình chế biến, bảo quản tiêu thụ Đã có nhiều nghiên cứu hệ vi sinh vật phát triển phi lê cá rô phi trình chế biến, bảo quản tiêu thụ như: tổng số vi sinh vật hiếu khí, Pseudomonas spp., Coliforms, E.coli [3, 4] Tuy nhiên, cịn có nhóm vi sinh vật khác diện phi lê cá, đó, để quản lý chất lượng phi lê cá rô phi chuỗi cung ứng tốt hơn, cần kiểm sốt nhóm vi sinh vật diện ban đầu phi lê cá Xuất phát từ thực tế cho thấy, khảo sát chất lượng ban đầu phi lê cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) nhà máy chế biến sở cho trình quản lý chất lượng sản phẩm phi lê cá rô phi vằn chuỗi cung ứng lạnh sau Số 1/2021 II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Phi lê cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus): cá rô phi phi lê đông rời IQF nhà máy chế biến thuỷ sản Nam Việt, An Giang, cỡ 120-170 g/phi lê Mẫu lấy sau công đoạn phi lê sau cơng đoạn cấp đơng rời IQF bao gói túi PE, mẫu chứa thùng xốp cách nhiệt có xếp xen kẻ lớp đá gel vận chuyển phịng thí nghiệm Trường Cao đẳng Kinh tế - Kỹ thuật Cần Thơ vòng Hóa chất mơi trường: Hóa chất mơi trường sử dụng đạt tiêu chuẩn phân tích, gồm có: acid trichloroacetic, acid boric, acid sulfuric, Bromocresol green, Formaldehyde solution, Eosin Methylene Blue agar, Violet Red Bile agar, Glycerol, Plate count agar, Pseudomonas base F, Pseudomonas CFC supplement, Iron agar, Pepton from meat, Pepton from casein, Phenol red (NaCl, Kova’c (Merck, Đức); Methyl red, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4 NaOH (Xilong, Trung Quốc) Phương pháp nghiên cứu 2.1 Các tiêu phân tích Mẫu phi lê cá rơ phi lấy sau công đoạn phi lê sau công đoạn cấp đông rời IQF Ngay sau vận chuyển phịng thí nghiệm, mẫu phân tích tiêu hoá học: hàm lượng nước, protein, tro, hàm lượng lipid, hàm lượng acid béo tự do, số peroxide, số TBARS, thành phần acid béo tự TVB-N Phi lê cá rô phi tiếp tục kiểm tra diện nhóm vi sinh vật theo TCVN 5289:2006 số vi sinh vật thường gặp sản phẩm thuỷ sản như: tổng số vi sinh vật hiếu khí (TVC) phát triển nhiệt độ thấp, Pseudomonas spp., Coliforms, E.coli, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Samonella, Vibrio… Sau xác định diện nhóm vi sinh gây hư hỏng phi lê cá rơ phi, tiến hành phân lập tách rịng định danh số vi sinh vật gây hỏng đặc trưng TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 27 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản 2.2 Phương pháp phân tích hố học - Xác định hàm lượng nước theo phương pháp TVCN 3700:1990 - Xác định hàm lượng protein theo phương pháp TCVM 3705:1990 - Xác định hàm lượng tro theo phương pháp AOAC 938:08- Xác định hàm lượng tổng nitơ bazơ bay (TVB-N) theo phương pháp Malle Poumeyrol (1989) - Xác định số TBARS theo phương pháp Raharjo Schmidt (1992) [22] - Xác định số Peroxide theo TVCN 6121:2018 - Xác định hàm lượng acid béo tự (FFA) theo TCVN 6127:2010 - Xác định hàm lượng lipid theo TCVN 3730:2009 - Xác định thành phần acid béo tự theo CASE.SK.0107-GC thực trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm (CASE) 2.3 Phương pháp phân tích vi sinh vật Chuẩn bị mẫu: đồng phi lê cá rơ phi máy dập mẫu sau lấy xác 25 g cá cho vào túi PE vô trùng, thêm vào 225 ml dung dịch đệm phosphate Tiến hành đồng mẫu Pha loãng mẫu: mẫu sau đồng pha loãng theo dãy thập phân sau: dùng micropipet hút ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa ml nước muối sinh lý (đã khử trùng), đồng dịch pha loãng ta mẫu pha loãng 10-2 Tiếp tục pha đến độ nồng độ thích hợp nghi ngờ mẫu có mật độ vi sinh vật cao Cấy mẫu: dùng micropipet hút 0,2 ml dịch mẫu pha lỗng vào đĩa petri có chứa 20-30 ml mơi trường thạch (đã vơ trùng) thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm tra Dùng que cấy trang nhúng vào cồn 70º, đưa que cấy đốt lửa đèn cồn, đợi cho que cấy nguội, sau dùng que cấy trang mẫu bề mặt thạch Chờ mặt thạch khô, lật úp đĩa petri nuôi cấy nhiệt độ thời gian thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm tra theo quy định Phương pháp xác định vi sinh vật sử dụng dựa vào phương pháp theo quy định TCVN hành, nhiên có điều 28 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Số 1/2021 chỉnh cho phù hợp với tình hình nghiên cứu thực tế - Xác định vi khuẩn sinh H2S tổng số vi sinh vật hiếu khí (TVC) phát triển nhiệt độ thấp theo NMKL 86:2006 - Xác định Pseudomonas spp theo TCVN 7138:2013 - Xác định Coliforms E.coli theo MNKL 125 4th ed 2005 - Xác định Staphylococcus aureus theo MNKL 66:2003 - Xác định Vibrio theo FDA 2004 - Xác định Listeria monocytogenes theo TCVN 7700-1:2007 - Xác định Salmonella theo ISO 6579:2002 - Xác định Clostridium perfringens theo ISO 7937:2004 2.4 Định danh vi sinh vật Phân lập tách ròng vi sinh vật: Đốt que cấy vòng lửa đèn cồn để khử trùng, đợi que cấy vừa nguội, đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc cần phân lập đĩa petri Sau đưa que cấy vào đĩa petri có chứa mơi trường thạch thích hợp, thực thao tác cấy truyền cách ria đường đĩa petri chứa môi trường thạch Sau đường ria liên tục, đốt khử trùng que cấy làm nguội trước thực đường ria Lật ngược đĩa, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Trích ly Deoxyribonucleic acid (DNA): DNA trích ly phương pháp Sambrook cộng (1989) [23] Vi khuẩn nuôi môi trường LB, lấy ml dung dịch vi khuẩn cho vào eppendorf sau tiến hành ly tâm với chế độ 13.000 rpm phút Thu cặn hịa tan cặn 250µl dung dịch TE (Tris EDTE buffer) gồm 10 mM Tris 1mM Ethylene Diamine Tetracetic Acid (EDTA) pH 8, bổ sung 50µl dung dịch 10% SDS 10µl Proteinase K (10 mg/l), sau ủ nhiệt độ 65ºC 20 phút, phút đảo eppendorf lần để trộn dung dịch, tiếp tục thêm 400µl 10% Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB)/0,7 M NaCl, tiếp tục ủ nhiệt độ 65ºC 20 phút Sau đó, thêm 600µl hỗn hợp Chloroform: Isoamyl Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Alcohol với tỷ lệ 24:1, trộn ly tâm với chế độ 12.000 rpm 10 phút, tiến hành hút phần dung dịch phía vào eppendorf thêm ml Isopropanol, lắc đều, ổn định -20ºC 30 phút, sau ly tâm 13.000 rpm 10 phút, lấy phần kết tủa sau bổ sung 1ml Ethanol 70%, tiếp tục ly tâm 12.000 rpm phút, bỏ phần Ethanol, giữ lại phần kết tủa sấy khơ kết tủa, hịa tan kết tủa với 30µl nước cất, trữ -20ºC Giải trình tự số dịng vi khuẩn: q trình giải trình tự DNA sau q trình trích ly tiến hành công ty First BASE Laboratories Sdn Bhd, Malaysia Sau sử dụng chương trình BLAST N (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) để so sánh trình tự đoạn gen 16SrRNA dịng vi khuẩn với trình tự gen 16SrRNA lồi vi khuẩn có liệu ngân hàng NCBI (National Center for Biotechnology Information) 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Thí nghiệm tiến hành lặp lại lần độc lập với lơ phi lê cá rơ phi Số liệu tính trung bình, độ lệch chuẩn lần thí nghiệm phần Microsoft Excel So sánh trình tự đoạn gen 16SrRNA vi sinh vật với liệu ngân hàng NCBI (National Center for Biotechnology Information) chương trình BLAST N (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) https://blast.ncbi.nlm.nih.gov Số 1/2021 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Thành phần hoá học ban đầu phi lê cá rô phi Phi lê cá rô sau q trình đơng IQF có hàm lượng protein 19,6%, hàm lượng lipid 0,68%, cao so với hàm lượng protein lipid thông thường cá phi lê [18, 24] Ngoài hàm lượng nước tro phi lê cá rô phi sau đông rời 78% 0,78% (Bảng 1) Điều cho thấy hàm lượng dinh dưỡng phi lê cá rô phi tương đối cao, cần lưu ý hàm lượng dễ bị biến đổi trình chế biến bảo quản Một tiêu biểu thị biến đổi hư hỏng sản phẩm thuỷ sản quan tâm TVB-N Hàm lượng TVB-N cá rô phi sau phi lê sau q trình lạnh đơng ghi nhận 11,13 ± 0,74 12,82 ± 1,22 mg N/100 g, thấp so với ngưỡng quy định 25 mg N/100 g Kết nghiên cứu thấp so với nghiên cứu tương tự cá rô phi đỏ sau lạnh đông chậm lạnh đông nhanh [10] Các tác giả cho phương pháp lạnh đông ảnh hưởng đến thành phần lipid hàm lượng TVB-N phi lê Sự khác biệt hàm lượng TVB-N cá rô phi nghiên cứu nghiên cứu khác cịn khác biệt lồi, chế độ ni dưỡng, v.v… Bảng Thành phần hố học ban đầu cá rơ phi vằn sau q trình phi lê sau đơng rời IQF Chỉ tiêu Lipid Protein Độ ẩm Tro TVB-N Đơn vị tính % % % % mg N/100g Lipid thành phần lipid tiêu quan tâm thực phẩm nói chung thuỷ sản nói riêng, lipid thuỷ sản thường biết đến nguồn lipid quý giá tốt cho sức khoẻ người Tuy nhiên, hàm lượng lipid cao lại dễ dàng bị biến đổi trình chế biến bảo quản từ ảnh hưởng đến chất lượng Sau phi lê 1,19 ± 0,03 17,7 ± 0,6 79,7 ± 1,1 0,81 ± 0,04 11,13 ± 0,74 Sau đông 0,68 ± 0,04 19,6 ± 0,2 78,0 ± 0,9 0,78 ± 0,02 12,82 ± 1,22 thuỷ sản Kết phân tích Bảng cho thấy hàm lượng lipid phi lê cá rô phi sau đông 0,68 ± 0,04% hàm lượng acid béo tự 4,87 ± 0,12 g/100 g chất béo, số thường dùng để đánh giá biến đổi thành phần lipid trình chế biến phải kể đến là: số peroxide số TBARS, kết phân tích cho thấy TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 29 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 1/2021 Bảng Thành phần lipid cá rô phi vằn sau q trình phi lê sau đơng rời IQF Chỉ tiêu Acid béo tự Peroxide TBARS C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C20:4 Đơn vị tính g/100 g béo meq/kg béo mg MDA/kg % % % % % % % số peroxide khơng có sau q trình phi lê đơng lạnh, cịn số TBARS sau phi lê sau làm đông 0,06 0,11 mg MDA/kg Điều cho thấy chất lượng lipid chưa có biến đổi sau trình lạnh đơng, hiểu q trình đơng rời có thời gian đơng nhanh nên chưa có biến đổi tiêu Trong số nghiên cứu cá rô phi đỏ so sánh chất lượng lipid phi lê lạnh đông chậm lạnh đông nhanh sau tháng, kết cho thấy hàm lượng TBARS mẫu lạnh đông chậm cao so với mẫu lạnh đông nhanh [10] Trong nghiên cứu khác cá bơn, cá trích có kết tương tự [11, 16] Hiện có nhiều nghiên cứu thành phần acid béo loại thuỷ sản đặc biệt cá, acid béo tự tiêu quan tâm Kết nghiên cứu cho thấy thành phần chất béo phi lê cá rơ phi vằn có chứa acid béo khơng no C18:1 chiếm 0,17÷0,38%, C18:2 chiếm 0,08÷0,16% C20:4 chiếm 0,03÷0,04% cho thấy phi lê cá rơ phi vằn nguồn dinh dưỡng tốt, mặc Sau phi lê 2,86 ± 0,05 0,06 ± 0,004 0,03 0,29 0,04 0,08 0,38 0,16 0,03 Sau đông 4,87 ± 0,12 0,11 ± 0,012 0,15 0,05 0,17 0,08 0,04 khác chất lượng sản phẩm dễ bị biến đổi oxy hoá chất béo Nghiên cứu cá trắng nước ngọt, cá đối cá chép [10] hàm lượng acid béo thường thay đổi q trình làm đơng bảo quản đơng Sự diện nhóm vi sinh vật ban đầu phi lê cá rô phi vằn Kiểm tra diện mật số nhóm vi sinh vật cá rô phi sau phi lê sau đông rời IQF thực lơ cá độc lập Tuy nhiên, số nhóm vi sinh vật phát cá tiếp tục theo dõi kiểm soát sau cá vận chuyển phịng thí nghiệm, vi sinh vật tiếp tục phát triển cá, dễ dàng bị lây nhiễm trình bảo quản vận chuyển Do đó, sau cá đưa phịng thí nghiệm bảo quản để phục vụ cho q trình nghiên cứu, chúng tơi tiếp tục kiểm mật số vi sinh vật ban đầu tất nội dung đề tài nghiên cứu Vì mật số TVC, Pseudomonas spp., Coliforms E.coli thực 60 lô cá độc lập Bảng Sự diện nhóm vi sinh vật mẫu sau trình phi lê phi lê sau đông rời IQF cá rô phi vằn Chỉ tiêu kiểm tra TVC Pseudomonas spp Vi khuẩn sinh H2S Mật số vi sinh vật Sau phi lê Sau đơng IQF Sau vận chuyển phịng thí nghiệm 8.103÷8,3.103 CFU/g 3,4.103 ÷3,9.103 CFU/g 3,33.104 ÷9,3.105 CFU/g* 102÷1,33.103 CFU/g 2,23.103÷3,03.103 CFU/g 4,5.102 ÷3,63.104 CFU/g* Khơng phát 1g mẫu 30 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Khơng phát 1g mẫu Không phát 1g mẫu Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Coliforms E Coli Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Salmonella Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae Clostridium perfringens Số 1/2021 < 10 CFU/g < 10 CFU/g 1,02.102 ÷1,21.104 CFU/g* < 10 CFU/g Khơng phát 1g mẫu Không phát 1g mẫu Không phát 25g mẫu Không phát 1g mẫu Không phát 25g mẫu < 10 CFU/g Không phát 1g mẫu Không phát 1g mẫu Không phát 1g mẫu Không phát 25g mẫu < 10 CFU/g* Không phát 1g mẫu Không phát 1g mẫu Không phát 25g mẫu Không phát 1g mẫu Không phát 25g mẫu