Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate của cây sú trắng ( aegiceras floridum)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM HỌC 2017-2018 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETATE CỦA CÂY SÚ TRẮNG ( AEGICERAS FLORIDUM ) Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học Tự nhiên Tháng 3/2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM HỌC 2017-2018 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETATE CỦA CÂY SÚ TRẮNG ( AEGICERAS FLORIDUM ) SV năm cuối Nữ Kinh D14HHC Thái Minh Trí Nam Kinh D16HH03 SV năm thứ Hóa học Lê Thị Lưu Nữ Kinh D16HH03 SV năm thứ Hóa học Nam Kinh D16HH03 SV năm thứ Hóa học Nữ Kinh D16HH03 SV năm thứ Hóa học Lớp, Khoa Hóa học chuyên Trưởng ngành nhóm hữu Huỳnh Kim Thuận Trần Cao Minh Trần Thị Bích Xuân Dân tộc Ngành học Họ tên SV Giới tính SV năm thứ/ Số năm đào tạo ST T Người hướng dẫn: ThS Lưu Huỳnh Vạn Long Ghi UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HỊA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung Tên đề tài: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETATE - CỦA CÂY SÚ TRẮNG ( AEGICERAS FLORIDUM ) - Sinh viên/ nhóm sinh viên thực STT Họ tên MSSV Lớp Huỳnh Kim Thuận 1424401120173 D14HHC Thái Minh Trí 1624401120150 D16HH03 Lê Thị Lưu 1624401120066 D16HH03 Trần Cao Minh 1624401120075 D16HH03 Trần Thị Bích Xuân 1624401120167 D16HH03 Khoa Khoa học tự nhiên Khoa học tự nhiên Khoa học tự nhiên Khoa học tự nhiên Khoa học tự nhiên Năm thứ/ Số năm đào tạo SV năm cuối SV năm thứ SV năm thứ SV năm thứ SV năm thứ Người hướng dẫn: ThS Lưu Huỳnh Vạn Long Mục tiêu đề tài Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate sú trắng (Aegiceras floridum) Xác định cơng thức cấu tạo hoạt tính kháng oxy hóa hợp chất lập Tính sáng tạo Đã lập xác định cấu trúc hợp chất từ cao EA sú trắng Mặc dù hợp chất cũ lần cô lập từ sú trắng Nghiên cứu khả kháng oxy hóa DPPH hợp chất , kết cho thấy hợp chất myricetin, acid 3,4,5-trihydroxy benzoic isorhamnetin có khả kháng oxy i hóa mạnh acid 3,4,5-trihydroxy benzoic myricetin có khả kháng oxy hóa mạnh chất đối chứng trolox Kết nghiên cứu Cô lập thành công hợp chất từ phân đoạn cao ethyl acetate sú trắng (Aegiceras floridum) Xác định hoạt tính kháng oxy hóa hợp chất cô lập, khảo sát số phân đoạn cao sú trắng với mục đích cung cấp cho hướng nghiên cứu sau thuận lợi việc lập khảo sát hoạt tính Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài Cung cấp dẫn liệu khoa học cho ứng dụng y học Việc nghiên cứu tìm tịi hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có khả kháng oxy hóa trị bệnh có ý nghĩa thiết thực việc điều trị bệnh lý: xơ vữa động mạch, suy yếu hệ thống miễn dịch, giảm trí tuệ, tiểu đường, ung thư, Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài Kết nghiên cứu viết gửi cho hội thảo “ Nghiên cứu phát triển sản phẩm tự nhiên lần thứ VI” ii Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài - Đề tài cô lập hợp chất từ cao ethyl acetate Sú trắng có cấu trúc xác định, kí hiệu AF đế n AF AF : Myricetin AF : Kaempferol AF : Isorhamnetin AF : Acid 3,4,5-trihydroxy benzoic AF : Methyl 4-hydroxy-3-methoxybenzoate AF : Methyl 3,5-dihydroxy-3-methoxybenzoate - Hợp chất acid 3,4,5-trihydroxy benzoic myricetin có giá trị SC50 1,55 4,57 (µg/mL) nhỏ giá trị SC50 chất chứng dương trolox (SC50 = 8,21 µg/mL) nên khả kháng oxy hóa mạnh, chí mạnh chất chứng dương trolox Isorhamnetin (SC50=17,83 µg/mL) thể khả kháng oxy hóa mạnh Chất methyl 3,5-dihydroxy-3-methoxybenzoate (SC50 = 766,63 µg/mL), kaempferol (SC50 = 141,27 µg/mL) methyl 4-hydroxy-3-methoxybenzoate (SC50 = 73,41 µg/mL) cho hoạt tính kháng oxy thấp Ngày Xác nhận lãnh đạo khoa tháng năm Người hướng dẫn (ký, họ tên) (ký, họ tên) iii UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HỊA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN Ảnh 3x4 Họ tên: Huỳnh Kim Thuận Sinh ngày: 30 tháng 09 năm 1996 Nơi sinh: Bình Dương Lớp: D14HHHC Khóa: 2014-2018 Khoa: Khoa học Tự nhiên Địa liên hệ: Đại học Thủ Dầu Một Điện thoại:01654177027 Email: Huynhkimthuan915@gmail.com II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích sinh viên từ năm thứ đến năm học) * Năm thứ Ngành học: Hóa học Khoa: Khoa Học Tự Nhiên Kết xếp loại học tập: Trung bình Sơ lược thành tích: * Năm thứ Ngành học: Hóa Ho ̣c Khoa: Khoa Ho ̣c Tự Nhiên Kết xếp loại học tập: Trung Bình Sơ lược thành tích: * Năm thứ Ngành học: Hóa Ho ̣c Khoa: Khoa Ho ̣c Tự Nhiên Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: * Năm thứ Ngành học: Hóa Ho ̣c Khoa: Khoa Ho ̣c Tự Nhiên Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: iv Ngày tháng năm Xác nhận lãnh đạo khoa Sinh viên chịu trách nhiệm (ký, họ tên) thực đề tài (ký, họ tên) v LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu làm việc với cố gắng nỗ lực thân cộng với giúp đỡ tất người Chúng xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Thầy Lưu Huỳnh Vạn Long theo sát, tận tình hướng dẫn, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp kiến thức, động viên suốt thời gian thực đề tài nghiên cứu đề tài Thầy gương sáng tinh thần học tập hoạt động nghiên cứu khoa học không mệt mỏi, động lực hình mẫu để tơi noi theo Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô môn hóa học khoa Khoa Học Tự Nhiên trường Đại học Thủ Dầu Một giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu để hồn thành tốt đề tài nghiên cứu Xin chân thành cám ơn! Bình Dương, tháng năm 2018 Nhóm sinh viên thực vi MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Tình hình nghiên cứu .1 Lý lựa chọn đề tài Mục tiêu đề tài Phương pháp nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đặc tính thực vật 1.1.1 Mô tả thực vâ ̣t 1.1.2 Phân bố 1.2 Nghiên cứu dược tính .4 1.2.1 Nghiên cứu dược tính Aegiceras floridum 1.2.2 Nghiên cứu dược tính chi Aegiceras corniculatum 1.3 Nghiên cứu hóa học 1.3.1 Nghiên cứu hóa học Aegiceras floridum .6 1.3.2 Nghiên cứu hóa học cùng chi Aegiceras corniculatum .6 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 10 2.1 Hóa chất thiết bị .10 2.1.1 Hóa chất 10 2.1.2 Thiết bị 10 2.2 Nguyên liệu 10 2.2.1 Nhâ ̣n danh .10 2.2.2 Thu hái mẫu 11 2.3 Điề u chế loa ̣i cao 11 2.4 Nghiên cứu khả kháng DDPH phân đoạn cao sú trắng 12 2.5 Ly trích và lập số hợp chất hữu từ cao ethyl acetate của lá Aegiceras floridum .13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 3.1 Khảo sát thành phần hóa học sú trắng .15 3.1.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất AF 15 3.1.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất AF 17 3.1.3 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất AF 18 3.1.4 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất AF 20 3.1.5 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất AF 21 3.1.6 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất AF 23 3.2 Phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự DPPH 24 3.3 Kết hoạt tính kháng oxy hóa hợp chất AF 1-AF loại cao sú trắng 25 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .27 4.1 Kết luận .27 4.2 Kiến nghị .28 TÀI LIỆU THAM KHẢO .29 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Rf : Retardation factors J : Hằng số ghép cặp (coupling constant, phổ 1H-NMR) brs : Broad singlet (mũi đơn rộng) dd : Doublet-doublet (mũi đôi-đôi) d : Doublet (mũi đôi) m : Multiplet (mũi đa) s : Singlet (mũi đơn) t : Triplet (mũi ba) m/z : Tỉ lệ khối lượng theo điện tích ion (phổ MS) ppm : Part per million (phần triệu) GC-MS : Gas Chromatography Mass Spectometry- Sắc ký phổ khối lượng SKLM : Sắc Kí Lớp Mỏng NMR : Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy AF : Kí hiệu hợp chất cô lập từ cao etyl acetate Aegiceras floridum IC50 : Nồng độ gây chết 50% số sinh vật thử nghiệm HeLa : Dòng tế bào ung thư cổ tử cung MCF-7 : Dòng tế bào ung thư vú U937 : Dòng tế bào ung thư máu viii Bảng 3.2 So sánh dữ liê ̣u phổ NMR hợp chất AF với kaempferol STT 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ OH5 Hợp chất AF.3 (DMSO) H, J (Hz) 6.16 (s) 6.41 (s) 8.03 (d, 8.8) 6.91 (d, 8.8) 6.91 (d, 8.8) 8.03 (d, 8.8) C 146.9 135.7 175.9 160.7 98.2 163.9 93.5 156.2 103.1 121.7 129.5 115.5 159.2 115.5 129.5 12.46 (brs) Kaempferol [16] (DMSO) H, J (Hz) 6.19 (d, 2.0) 6.44 (d, 2.0) 8.06 (d, 8.0) 6.92 (d, 8.0) 6.92 (d, 8.0) 8.06 (d, 8.0) C 146.8 135.7 175.9 160.7 98.2 163.9 93.5 156.2 103.0 121.7 129.5 115.4 159.2 115.4 129.5 12.47 (brs) 3.1.3 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất AF Hợp chất AF cô lâ ̣p từ phân đoạn Fea 5.4 của cao ethyl acetate có đặc điểm sau: * Có dạng bơ ̣t vơ đinh ̣ hình màu vàng * SKLM cho giải ly hệ dung môi CHCl3 : CH3OH (95 : 5), hình mỏng dung dịch H2SO4 30% nung nóng bản, cho vết trịn, màu vàng, với giá trị Rf = 0.55 * Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) (Phụ lục 3a): trình bày Bảng 3.3 * Phổ 13C-NMR (DMSO-d6) (Phụ lục 3b): trình bày Bảng 3.3 * Phổ MS (Phụ lục 3c): cho mũi ion m/z 315.13 [M-H]- 18 ❖ Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR hợp chất AF xuất tín hiệu proton bao gồm tín hiệu proton nhóm –OH kiềm nối (H 12.48), tín hiệu proton hệ ABX vòng B [ H 7.75 (d, J=2.0 Hz, H-2’), H 7.69 (d, J=2.0 Hz, H-6’) H 6.95 (d, J=2.0 Hz, H5’)], tín hiệu ghép cặp meta vịng A [H 6.19 (d, J=2.0 Hz, H-6) 6.47 (d, J=2.0 Hz, H-8)] tín hiệu proton nhóm methoxy OCH3 (H 3.83) Phổ 13 C-NMR hợp chất AF xuất 16 tín hiệu carbon bao gồm tín hiệu >C=O (C 175.9), tín hiệu carbon hương phương tứ cấp (C 164.0, 160.7, 156.2, 148.9, 147.5, 146.7, 122.0, 103.1), carbon oxyolefin tứ cấp C 135.9, carbon nhóm OCH3 (C 55.9) carbon methine hương phương (C 121.8, 115.6, 111.2, 98.3, 93.7) Khố i phổ ESI-MS cho mũi ion m/z 315.13 [M-H]- phù hơ ̣p với công thức phân tử của AF là C16H12O7 (M=316) So sánh liệu phổ 1H- 13 C-NMR hợp chất AF với số liệu phổ isorhamnetin cho thấy có tương hợp (Bảng 3.3) Do chúng tơi đề nghị cấu trúc hợp chất AF isorhamnetin [17] Hình 3.3 Cấ u trúc hóa học của Isorhamnetin (AF 3) 19 Bảng 3.3 So sánh dữ liê ̣u phổ NMR hợp chất AF với Isorhamnetin STT 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ OCH3 OH-5 Hợp chất AF (DMSO) H, J (Hz) 6.19 (d, 1.6) 6.47 (d, 1.6) 7.74 (d, 1.6) 6.94 (d, 8.8) 7.68 (d, 8.4) 3.83 (s) 12.45 (s) C 148.9 135.9 175.9 160.7 98.3 164.0 93.7 156.3 103.1 122.1 111.9 147.5 146.7 115.6 121.8 55.9 Isorhamnetin [17] (DMSO) H, J (Hz) C 148.8 135.8 175.9 160.7 6.19 (d, 1.9) 98.2 163.9 6.47 (d, 1.9) 93.6 156.1 103.0 122.0 7.75 (d, 2.2) 111.7 147.3 146.6 6.94 (d, 8.4) 115.5 7.69 (dd, 8.5, 2.0) 121.7 3.84 (s) 55.8 - 3.1.4 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất AF Hợp chất AF cô lâ ̣p từ phân đoạn Fea5.4 của cao ethyl acetate, có đặc điểm sau: * Có dạng tinh thể màu trắng *SKLM cho giải ly hệ dung môi CH2Cl2 : CH3OH (7 : ), hình dưới đèn UV 254, cho vết tròn, với giá trị Rf =0.6 * Phổ 1H-NMR NMR (DMSO-d6) (Phụ lục 4a và Bảng 3.4) * Phổ 13C-NMR DEPT-NMR (DMSO-d6) (Phụ lục 4b, 4c và Bảng 3.4) * Phổ MS (Phụ lục 4d): cho mũi ion m/z 168.93 [M-H]❖ Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR của hơ ̣p chấ t AF xuấ t tin ́ hiê ̣u proton thơm đố i xứng H-2, H-6 ở H 6.9, cho thấy hợp chất AF có tính đối xứng 20 Phổ 13C-NMR hợp chất AF xuất tín hiệu carbon gồm tín hiệu carbon nhóm acid carboxylic -COOH (C 167.5), tín hiệu carbon C 138.1, 120.54, tín hiệu carbon methine đối xứng vòng B C 145.5 (C-3, C-5) và C 108.8 (C-2, C-6) Khố i phổ ESI-MS cho mũi ion m/z 168.9 [M-H]- phù hơ ̣p với công thức phân tử của AF là C7H6O5 (M=170) So sánh liệu phổ 1H- 13 C-NMR hợp chất AF với số liệu phổ acid 3,4,5-trihydroxy benzoic [26] cho thấy có tương hợp (Bảng 3.4), cấu trúc hợp chất AF đươ ̣c đề nghi ̣là acid 3,4,5-trihydroxy benzoic Hình 3.4 Cấ u trúc hóa học của acid 3,4,5-trihydroxy benzoic (AF 4) Bảng 3.5 So sánh dữ liê ̣u phổ NMR hợp chất AF với acid 3,4,5-trihydroxy benzoic STT -COOH Hợp chất AF ( DMSO) H, J (Hz) C 120.5 6.9 (s) 108.8 145.5 138.1 145.5 6.9 (s) 108.8 167.6 3,4,5-trihydroxyl benzoate (CD3OD ) [26] H, J (Hz) C 122.4 7.05 (s) 110.7 146.7 138.9 146.7 7.05 (s) 110.7 170.7 3.1.5 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất AF Hợp chất AF cô lâ ̣p từ phân đoạn Fea5.4 của cao ethyl acetate, có đặc điểm sau: * Có dạng tinh thể, không màu *SKLM cho giải ly hệ dung môi CH2Cl2 : CH3OH (99 : 1), hình dưới đèn 21 UV 254, cho vết trịn, với giá trị Rf = 0.45 * Phổ 1H-NMR NMR (CDCl3,ppm) (Phụ lục 5a và Bảng 3.5) * Phổ 13C-NMR (CDCl3, ppm) (Phụ lục 5b và Bảng 3.5) * Phổ MS (Phụ lục 5c): cho mũi ion m/z 181,72 [M-H]❖ Biện luận cấu trúc Phổ NMR của hơ ̣p chấ t AF tương tự với hơ ̣p chấ t acid vanillic xuấ t hiê ̣n thêm tín hiê ̣u nhóm methyl ester ta ̣i H (3.93, COOCH3), C (52.0) Khố i phổ ESI-MS cho mũi ion m/z 181,72 [M-H]- phù hơ ̣p với công thức phân tử của AF là C9H10O4 (M=182) So sánh liệu phổ 1H- 13 C-NMR hợp chất AF với số liệu phổ methyl 4-hydroxy-3-methoxybenzoate [23] cho thấy có tương hợp (Bảng 3.5), cấu trúc hợp chất AF đươ ̣c đề nghi ̣là methyl 4-hydroxy-3-methoxybenzoate Hình 3.5 Cấ u trúc hóa học của Methyl 4-hydroxy-3-methoxybenzoate (AF 5) Bảng 3.5 So sánh dữ liê ̣u phổ NMR hợp chất AF với Methyl 4-hydroxy-3-methoxybenzoate STT Hợp chất AF (CDCl3) H, J (Hz) C=O OCH3 COOCH3 7.56 (s) 6.94 (d, 8.4) 7.64 (d, 8.4) 3.90 s 3.93 s C 122.3 111.9 150.2 146.4 114.3 124.3 167.0 56.2 52.0 22 Methyl 4-hydroxy-3methoxybenzoate [23] (CDCl3) H, J (Hz) C 122.2 7.55 (d, 1.8) 111.7 149.9 146.1 6.93 (d, 8.7) 114.0 7.63 (dd, 8.7, 1.8) 124.1 166.5 3.89 s 56.1 3.96 s 51.9 3.1.6 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất AF Hợp chất AF cô lâ ̣p từ phân đoạn Fea5.4 của cao ethyl acetate, có đặc điểm sau: * Có dạng tinh thể, không màu * SKLM cho giải ly hệ dung mơi CH2Cl2 : CH3OH (95 : 5), hình dưới đèn UV 254, cho vết tròn, với giá trị Rf = 0.45 * Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) (Phụ lục 6a): trình bày Bảng 3.6 * Phổ 13C-NMR (DMSO-d6) (Phụ lục 6b): trình bày Bảng 3.6 * Phổ MS (Phụ lục 6c): cho mũi ion m/z 166,96 [M-H]- ❖ Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR của hơ ̣p chấ t AF xuấ t hiê ̣n của proton thơm, nên có thể vòng benzen gắ n nhóm thế Tiń hiê ̣u hai proton ghép meta với J = 2.0 Hz có đô ̣ dich ̣ chuyể n trùng cho biế t có sự đố i xứng phân tử Ngoài ta còn xuấ t hiê ̣n mô ̣t tín hiê ̣u nhóm methoxy OCH3 H 3.78 Phổ 13 C-NMR cho tiń hiê ̣u nhóm methyl ester COOCH3 ta ̣i C 166.4 và 52.1 Ngoài còn có tín hiê ̣u carbon vòng thơm nên kế t luâ ̣n vòng thơm đố i xứng Khố i phổ ESI-MS cho mũi ion m/z 166,96 [M-H]- phù hơ ̣p với công thức phân tử của AF là C8H8O4 (M=168) So sánh liệu phổ 1H- 13 C-NMR hợp chất AF với số liệu phổ methyl 3,5-dihydroxy-3-methoxybenzoate [24] cho thấy có tương hợp (Bảng 3.6), cấu trúc hợp chất AF đươ ̣c đề nghi ̣ methyl 3,5-dihydroxy-3methoxybenzoate Hình 3.6 Cấ u trúc hóa học của Methyl 3,5-dihydroxy-3-methoxybenzoate (AF 6) 23 Bảng 3.6 So sánh dữ liê ̣u phổ NMR hợp chất AF với Methyl 3,5-dihydroxy-3-methoxybenzoate Hợp chất AF (DMSO) STT H, J (Hz) C=O OCH3 OH 6.82 (d, 2.0) 6.44 (s) 6.82 (d, 2.0) 3.78 s 9.66 s C 131.4 107.2 158.6 107.3 158.6 107.2 166.4 52.1 Methyl 3,5-dihydroxy-3methoxybenzoate [24] (DMSO) H, J (Hz) C 131.2 6.80 (m) 106.9 158.4 6.43 (m) 107.0 158.4 6.80 (m) 106.9 166.1 3.78 s 51.9 9.64 s 3.2 Phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự DPPH Hoạt tính chống oxy hóa thử nghiệm tại: Phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh học phân tử trường đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM theo phương pháp diệt gốc tự DPPH ❖ Về nguyên tắc Là phương pháp nhằm xác định khả kháng oxi hoá hợp chất dựa khả bắt gốc tự DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) có khả tạo gốc tự bền methanol có độ hấp thu cực đại bước sóng 517 nm Khi cho mẫu thử ngiệm vào hỗn hợp này, chất có khả làm trung hoà bao vây gốc tự làm DPPH chuyển từ màu tím sang vàng DPPH DPPH-H (Màu tím) (Màu vàng) Hình 3.7.Cơ chế phản ứng trung hịa gốc tự DPPH 24 Tín hiệu đo máy ELISA reader Hoạt tính kháng oxi hố chất thử nghiệm đánh giá thông qua phần trăm làm giảm giá trị hấp thụ ánh sáng mẫu thử nghiệm so với đối chứng Có nhiều phương pháp khác để thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa chất Trong tất phương pháp thử, phương pháp làm gốc tự DPPH phương pháp sử dụng phổ biến mức độ in vitro Ngồi ra, phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với điều kiện có sẵn phịng thí nghiệm nên hoạt tính kháng oxy hóa chất lập (AF 1-AF 6) đánh giá phương pháp DPPH ❖ Tính tốn kết Kết hoạt tính kháng oxy hóa chất phương pháp DPPH biểu diễn giá trị SC50 (Effective concentration of 50%) SC50 định nghĩa nồng độ chất thử nghiệm bắt giữ 50% gốc tự DPPH SC50 giá trị dùng để đánh giá khả ức chế mạnh yếu mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính cao giá trị SC50 thấp Tỉ lệ phần trăm bắt gốc tự DPPH tính theo cơng thức sau: SC% = − ODt × 100 (%) ODc Trong đó: ODt: mật độ quang mẫu thí nghiệm sau trừ blank (khơng có DPPH) ODc: mật độ quang mẫu control sau trừ blank (khơng có DPPH) 3.3 Kết hoạt tính kháng oxy hóa hợp chất AF 1-AF loại cao sú trắng Giá trị SC50 hoạt tính bắt gốc tự DPPH hợp chất cô lập loại cao xác định Bảng 3.7 25 Bảng 3.7 Giá trị SC50 mẫu xác định phương pháp DPPH Kí hiệu Mẫu SC50 ( µg/mL) Lần Lần Lần Trolox Myrietin Kaempferol 8,45 4,22 144,50 8,11 4,65 141,40 8,06 4,85 137,90 TB±ĐLC 8,21 ± 0,21 4,57±0,32 141,27±3,30 Isorhamnetin 19,22 18,44 15,82 17,83±1,78 1.64 1.58 1.44 1.55±0.10 752,90 805,50 741,50 766,63±34,14 74,65 84,93 78,65 73,41±5,18 Axit 3,4,5-trihydroxy bezoic Methyl 3,5-dihydroxy -3-methoxybenzoat Methyl 4-hydroxy -3-methoxybenzoat (Kết biểu thị dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần lặp lại thí nghiệm) Lưu ý: Trolox (Sigma) sử dụng làm chứng dương cho quy trình thử nghiệm Từ Bảng 3.7 cho thấy hợp chất acid 3,4,5-trihydroxy benzoic myricetin có giá trị SC50 1,55 4,57 (µg/mL) nhỏ giá trị SC50 chất chứng dương trolox (SC50 = 8,21 µg/mL) nên khả kháng oxy hóa mạnh, chí mạnh chất chứng dương trolox Isorhamnetin (SC50=17,83 µg/mL) thể khả kháng oxy hóa mạnh Chất methyl 3,5-dihydroxy-3-methoxybenzoate (SC50 = 766,63 µg/mL), kaempferol (SC50 = 141,27 µg/mL) methyl 4-hydroxy-3-methoxybenzoate (SC50 = 73,41 µg/mL) cho hoạt tính kháng oxy thấp 26 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Bằng phương pháp li trích, chiết tách dùng phân lập hợp chất hữu cơ, cô lập hợp chất có cấu trúc xác định, kí hiệu AF đế n AF AF : Myricetin AF : Kaempferol AF : Isorhamnetin AF : Acid 3,4,5-trihydroxy benzoic AF : Methyl 4-hydroxy-3-methoxybenzoate AF : Methyl 3,5-dihydroxy-3-methoxybenzoate Trong số hợp chất cô lập: ➢ Hợp chất AF 1-AF là các flavonoid thường hiê ̣n diê ̣n nhiề u các loài thuô ̣c chi Aegiceras ➢ Hợp chất AF 4-AF là các hơ ̣p chấ t phenol phổ biến thực vật Cấu trúc tên gọi hợp chất hữu cô lập từ số phân đoạn cao Aegiceras floridum trình bày Hin ̀ h 4.1 Myricetin (AF 1) Kaempferol (AF 2) Isorhamnetin (AF 3) 3,4,5-trihydroxy benzoate (AF 4) 27 Methyl 4-hydroxy-3-methoxybenzoate Methyl 3,5-dihydroxy-3-methoxybenzoate (AF 5) (AF 6) Hình 4.1 Cấ u trúc và tên gọi các hợp chấ t đã cô lập được từ lá Sú trắ ng (Aegiceras floridum) ❖ Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa hợp chất cô lập từ cao ethyl acetate sú trắng Hợp chất acid 3,4,5-trihydroxy benzoic myricetin có giá trị SC50 1,55 4,57 (µg/mL) nhỏ giá trị SC50 chất chứng dương trolox (SC50 = 8,21 µg/mL) nên khả kháng oxy hóa mạnh, chí mạnh chất chứng dương trolox Isorhamnetin (SC50=17,83 µg/mL) thể khả kháng oxy hóa mạnh Chất methyl 3,5-dihydroxy-3-methoxybenzoate (SC50 = 766,63 µg/mL), kaempferol (SC50 = 141,27 µg/mL) methyl 4-hydroxy-3-methoxybenzoate (SC50 = 73,41 µg/mL) cho hoạt tính kháng oxy thấp 4.2 Kiến nghị Tiếp tục khảo sát phân đoạn cao chưa khảo sát, đặc biệt phân đoạn cao etyl acetat metanol Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn độc tính số dòng tế bào ung thư MCF-7, HeLa, các hợp cô lập 28 TÀ I LIỆU THAM KHẢO [1] Jun Wu, Qiang Xiao, Jing Xu, Min-Yi Li, Jian-Yu Pana, Mei-hua Yang (2008), Natural products from true mangrove flora: source, chemistry and bioactivities Natural Product Reports 25, 955–981 [2] Phạm Hoàng Hộ (1999) Cây cỏ Việt Nam Tập 1, NXB Trẻ, trang 711, 385−386 [3] Lê Đức Tuấn, Trần Thị Kiều Oanh, Cát Văn Thành, Nguyễn Đình Q (2002) Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ NXB Nông Nghiệp, TP HCM [4] Ellison, J., Koedam, N.E., Wang, Y., Primavera, J., Jin Eong, O., Wan−Hong Yong, J & Ngoc Nam, V., Aegiceras floridum The IUCN Red List of Threatened Species 2010: e.T178856A7628795.http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2010−2.RLTS.T1 78856A7628795.en [5] M Gowri Ponnapalli, S CH V A Rao Annam, Saidulu Ravirala, Sushma Sukki, Madhu Ankireddy, V Raju Tuniki (2012) Unusual isomeric corniculatolides from mangrove, Aegiceras corniculatum Journal of Natural Products 75, 275–279 [6] Võ Văn Chi (1996), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y Học, TP HCM, trang 1070 [7] Edgardo Gomez, Offlia De La Cruz-Giron (1989) Toxicants from mangrove plants, V Isolation of the piscicide, 2-hydroxy-5-methoxy-3undecyl-1,4-benzoquinone (5-O-methylembelin) from Aegiceras corniculatum Journal of Natural Products 52(3), 649–651 [8] Minjuan Xu, Zhiwei Deng, Min Li, Jun Li, Hongzheng Fu, Peter Proksch, Wenhan Lin (2004) Chemical constituents from the mangrove plant, Aegiceras corniculatum Journal of Natural Products 67, 762–766 [9] Sundaram Ravikumar, Ganesan Ramanathan, Murugesan Gnanadesigan (2012) In vitro antiplasmodial activity of spiro benzofuran compound from mangrove plant of Southern India Asian Pacific Journal of Tropical 29 Medicine, 358–361 [10] K Venkateswara Rao, P K Bose (1962) Chemistry of Aegiceras majus gaertn – III structure of aegiceradiol Tetrahedron 18, 461–464 [11] K Venkateswara Rao, P K Bose (1962) Chemistry of Aegiceras majus Gaertn IIb Isolation of 28-noroleana-12,17-dien-3β-ol Journal of Organic Chemistry 27, 1470–1472 [12] O D Hensens, K G Lewis (1965) Reactions of primula genin A – Part I Tetrahedron Letter 51, 4639–4643 [13] Daojing Zhang, Jun Wu, Si Zhang, Jianshe Huang (2005) Oleanane triterpenes from Aegiceras corniculatum Fitoterapia 76, 131–133 [14] K Venkateswara Rao (1964) Chemistry of Aegiceras majus Gaertn – V structure of the triterpene aegicerin Tetrahedron 20, 973–977 [15] Chien Chang Shen, Yuan Shiun Chang, Li Kang Ho (1993), Nuclear magnetic Resonance studies of 5,7- dihydroxyflavonoids, Phytochemistry 34(3), 843-845 [16] Hyun Ah Jung, Jung Eun Kim, Hae Young Chung, Jae Sue Choi (2003), Antioxidant Principles of Nelumbo nucifera Stamens, Archives of Pharmacal Research 26(4), 279-285 [17] Jung Wha Kim, Tae Bum Kim, Heejung Yang, Sang Hyun Sung (2016), Phenolic compounds isolated from Opuntia ficus indica fruits, Natural Product Sciences 22(2) 117-121 [18] Consolacion Y Ragasa, Kathleen Lim (2005), Sterols from Cucurbita maxima, Philippine Journal of Science, 134(2), 83−87 [19] Juan F Sanz, Oscar Barbera, J Alberto Marco (1989), Sesquiterpene lactones from Artemisia hispanica, Phytochemistry, 28(8), 2163−2167 [20] Jian−Rong Luo, Qing−Yun Ma, You−Xing Zhaoa, Tie−Mei Yi, Cheng−Sen Li, Jun Zhoua (2009), Palaeophytochemical components from the miocene−fossil wood of Pinus griffithii, Journal of the Chinese Chemical Society, 56, 600−605 [21] Weike Su, Can Jin (2004), One-step reaction of Friedel–Crafts acylation and demethylation of aryl-methyl ethers catalyzed by ytterbium(III) triflate, Synthetic Communications, 34(22), 4199–4205 30 [22] Yang Yu, Huiyuan Gao, Zhishu Tang, Xiaomei Song, Lijun Wu (2006), Several phenolic acids from the fruit of Capparis spinosa, Asian Journal of Traditional Medicines, 1, 1−4 [23] Takeo Yoshioka, Tomohisa Inokuchi , Shozo Fujioka, Yasuo Kimura (2004), Phenolic compounds and flavonoids as plant growth regulators from fruit and leaf of Vitex rotundifolia, Z.Naturforsch 59c, 509-514 [24] Sacha Legrand, Goran Nordlander, Henrik Nordenhem, Anna Karin Borg Karlson, C Rikard Unelius (2004), Hydroxy-Methoxybenzoic Methyl Esters: Synthesis and Antifeedant Activity on the Pine Weevil, Hylobius abietis, Z.Naturforsch 59b, 829-835 [25] Luu Huynh Van Long, Mai Thi Hao, Vo Thanh Giang, Nguyen Kim Phi Phung (2017), Chemical constituents from the mangrove plant, Aegiceras floridum, Vietnam Journal of Chemistry 55(3e), 243-247 [26] Ziia Zhang, Liping Liao, Jeffrey Moore, Tao Wu, Zhengtao Wang (2009), Antioxidant phenolic compounds from walnut kernels (Juglans regia L), Food chemistry 113, 160-165 31 PHỤ LỤC