Nghiên cứu độc tính cấp các sản phẩm giảm cân của axit hydroxycitric

ISSN 1859 1531 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 3(88) 2015 95 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP CÁC SẢN PHẨM GIẢM CÂN CỦA AXIT HYDROXYCITRIC A STUDY OF TOXICITY OF WEIGHT LOSING SUPPLEMENTS CON[.]

ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 3(88).2015 95 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP CÁC SẢN PHẨM GIẢM CÂN CỦA AXIT HYDROXYCITRIC A STUDY OF TOXICITY OF WEIGHT LOSING SUPPLEMENTS CONTAINING HYDROXYCITRIC ACID Đào Hùng Cường1, Phan Thảo Thơ1, Vũ Thị Hạnh Yến2 Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng; cuongdh1949@gmail.com Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương Tóm tắt - Dịch chiết từ lá, vỏ bứa tròn Việt Nam muối hợp chất không gây hại đến sức khỏe người Với HCA, liều không gây chết chuột 5,0 ml/kg chuột có giá trị LD50 = 10,81 ml/kg chuột Với HCCa, tất các liều thử nghiệm không gây chết chuột có giá trị LD0= 20,0 g/kg chuột.Với HCK, liều không gây chết chuột 5,0g/ kg chuột có giá trị LD50 = 8,66 g/kg chuột ml/kg chuột Với HCMg, liều không gây chết chuột 15,0g / kg chuột có giá trị LD50 = 26,20 g/kg chuột Theo phân loại độc tính GHS, hợp chất có giá trị độc tính cấp LD50 > 5000 mg/kg chuột theo đường uống coi chất không độc Như vậy, dựa kết thu thử nghiệm kết luận tất mẫu thử không độc Abstract - The extract from the leaves of the Vietnam round hammer pod and its salts are compounds that are not harmful to human health Specifically, rats are safe with a HCA dose of 5.0 ml/kg weight and an effective specimen is LD50 of 10,81 ml/kg weight All of HCCa doses are not harmful to rats and an effective specimen is LD0 of 20,0 g/kg weight Allowable doses are in HCK and HCMg of 5.0 g/kg weight, 15,0 g/kg weight and their effective specimens are LD50 of 8.66 g/kg weight, 26.20 g/kg weight respectively According to GHS’s conventional classification for whether a substance is toxic or not, a substance is assigned to a non-toxic one if its LD50 is higher than 5000 mg/kg weight in oral route The results show that all of our research samples are nontoxic because they are in GHS’s allowable band Từ khóa - bứa trịn; HCA; HCK; HCCa; HCMg Key words - garcinia oblongifolia; HCA; HCK; HCCa; HCMg Mở đầu Theo nghiên cứu Viện toàn cầu McKinsey (MGI) có gần 1/3 dân số giới bị thừa cân béo phì tiêu tốn 2.000 tỉ USD/năm kinh tế giới Chi phí dành cho béo phì bao gồm phí chăm sóc y tế, khoản chi để giảm thiểu tác động suất lao động Đặc biệt kinh tế phát triển nhất, béo phì nằm nhóm gánh nặng kinh tế hàng đầu người tạo ra, sau thuốc xung đột vũ trang Tác động kinh tế toàn cầu bệnh béo phì ngày gia tăng khiến cho phủ nhiều nước đau đầu để đưa biện pháp ứng phó, sách mang lại hiệu Một giải pháp mà đại đa số ngưới bị bệnh béo phì ưa thích sử dụng thực phẩm chức giảm cân, đặc biệt sản phẩm axit hydroxycitric (HCA) muối canxi hydroxycitrat (HCCa), kali hydroxycitrat (HCK), magie hydroxycitrat (HCMg) Hiệu giảm cân sản phẩm chứng minh tác dụng làm tăng nồng độ serotonin, giảm tích tụ mỡ thừa giảm cảm giác thèm ăn [2] Trong nghiên cứu này, chiết xuất HCA từ lá, vỏ bứa, nguồn nguyên liệu dồi có gần miền đất nước ta thực chuyển hóa HCA thành muối kim loại Me (nhóm nhóm 2) theo phản ứng [3]: nên để có sở khoa học cho việc ứng dụng vào sản xuất sản phẩm thực phẩm chức giảm cân cần phải thử độc tính sinh học Đây nhóm hoạt chất giảm cân tạo lần từ nguồn nguyên liệu lá, vỏ bứa tròn Việt Nam, Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu HCA: Chất lỏng màu vàng nhạt; HCK: Bột màu vàng nâu; HCCa: Bột màu trắng; HCMg: Bột màu be 2.2 Đợng vật thí nghiệm Lồi chuột nhắt trắng giống Swiss; cân nặng: 18-20g; Số lượng: 80 con; nguồn gốc cung cấp: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương; điều kiện chăm sóc: động vật thí nghiệm (ĐVTN) ni điều kiện chuồng thống mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu chuột; cân nặng: Tất ĐVTN để ổn định trước tiến hành thử nghiệm theo dõi cân nặng tiến hành thử nghiệm 2.3 Phương pháp xác định độc tính cấp Cho lô chuột nhắt trắng uống chế phẩm thử với liều tăng dần Thể tích cho uống 0,2 – 0,4 ml/10 g chuột; Theo dõi tình trạng chung động vật thực nghiệm tỷ lệ chết 72 Xác định LD 50 (nếu có) theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon [4], [5] 2.3.1 Thử sơ Pha loãng dịch chiết gốc với nước cất thành dung dịch có độ pha loãng cách xa để thử sơ Thử nghiệm thăm dị mức liều khơng làm chết chuột thí nghiệm Tử nghiệm thăm dị mức liều làm chết 100% số chuột thí nghiệm 2.3.2 Thử nghiệm thức Thử nghiệm với mức liều khác khoảng từ LD0 đến LD100 Đào Hùng Cường, Phan Thảo Thơ, Vũ Thị Hạnh Yến 96 2.3.3 Cách tiến hành thử nghiệm Cho chuột nhịn ăn 15 trước thí nghiệm, nước uống theo nhu cầu Kiểm tra cân nặng trước thử nghiệm Chuột đạt yêu cầu cân nặng đưa vào thử nghiệm Lấy thể tích mẫu thử theo quy định đưa thẳng vào dày chuột kim cong đầu tù Dựa kết thăm dò thử nghiệm sơ bộ, tiến hành thử nghiệm thức 50 chuột, chia thành nhóm, mỡi nhóm cho uống mức liều Theo dõi biểu chuột sau uống 24 đầu theo dõi hoạt động ĐVTN thời gian ngày sau uống 2.3.4 Tính kết - Tính LD50 theo Behrens (50 − 𝑎) × 𝑑 𝐿𝐷50 = 𝐴 + (1) 𝑏−𝑎 Trong đó: A - Liều gây chết a% ĐVTN; a - % ĐVTN chết sát 50% cho a < 50%; b - % ĐVTN chết sát 50% cho b >50%; d - khoảng cách liều (ml) Kết nghiên cứu bàn luận 3.1 Kêt nghiên cứu đợc tính cấp HCA 3.1.1 Thử nghiệm sơ - Mức liều không làm chết chuột: Cho 10 chuột uống dung dịch mẫu thử HCA với mỗi chuột mức liều 5,0 ml mẫu thử/kg chuột Sau 24 theo dõi khơng có chuột thí nghiệm bị chết - Mức liều làm 100% chết chuột: Cho 10 chuột uống dung dịch mẫu thử HCA với mỗi chuột mức liều 15,0 ml mẫu thử/kg chuột Sau 24 theo dõi 100% chuột thí nghiệm bị chết 3.1.2 Thử nghiệm thức a Các mức liều thử nghiệm Mức liều 1: 5,0 ml mẫu thử/kg chuột; mức liều 2: 7,5 ml mẫu thử/kg chuột; mức liều 3: 10,0 ml mẫu thử/kg chuột; mức liều 4: 12,5 ml mẫu thử/kg chuột; mức liều 5: 15,0 ml mẫu thử/kg chuột Thực nghiêm theo dõi 24 biểu ngày hoạt động chuột sau uống thu kết sau: b Tiêu thụ thức ăn uống chuột Sau uống dung dịch thử mức liều không nhận thấy biểu ngộ độc, chuột ăn uống, hoạt động bình thường Ở mức liều 2, 3, chuột có biểu giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn nước uống thời gian theo dõi so với nhóm chứng Chuột chết khoảng thời gian từ đến 24 sau uống dung dịch thử c Quan sát dấu hiệu ngộ độc Ở mức liều 2, 3, 5, sau uống dung dịch thử, chuột có biểu mệt mỏi, giảm hoạt động, nằm mệt, tốt mồ Chuột chết khoảng thời gian từ đến 24 theo dõi Số chuột không chết mức liều có biểu giảm hoạt động, mệt mỏi thời gian theo dõi so với nhóm chứng Chuột mức liều khơng nhận thấy có biểu ngộ độc d Theo dõi tỷ lệ chết/sống Kết theo dõi tỷ lệ chuột chết/ sống uống dung dịch thử mức liều thử nghiệm thể Bảng1 Bảng Tỷ lệ chuột chết/sống các mức liều thử nghiệm Mức liều Liều thử (ml mẫu thử/kg chuột) 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 Số chuột chết/ sống thực tế 0/10 1/9 4/6 7/3 10/0 Số chuột chết/ sống kỳ vọng 0/28 1/18 5/9 12/3 22/0 % chết 5,26 35,71 80,0 100 e Tính LD50 theo Behrens Thay giá trị từ Bảng 1: a = 35,71%; b = 80,0%; A = 10,0 ml mẫu thử/ kg chuột; d = 2,5 ml mẫu thử/ kg chuột vào cơng thức (1) tính LD50 theo Behrens: (50 - 30, 71)* 2,5 LD50  10,   10,806 80, - 30, 71 Kết nghiên cứu độc tính cấp HCA cho thấy sau cho chuột uống thuốc, mức liều thấp (5,0 ml/kg chuột) khơng nhận thấy có biểu ngộ độc, mức liều khoảng từ 7,5 ml đến 15,0 ml mẫu thử/ kg chuột, chuột có biểu mệt mỏi, giảm hoạt động, nằm mệt, tốt mồ Chuột bị chết khoảng thời gian đến 24 theo dõi tỷ lệ chết tùy theo mức liều uống Liều không gây chết chuột 5,0 ml mẫu thử/ kg chuột LD50 = 10,81 ml mẫu thử/ kg chuột Theo phân loại độc tính GHS kết luận mẫu thử HCA không độc [1] 3.2 Kết nghiên cứu đợc tính cấp HCCa 3.2.1 Thử nghiệm sơ Cho mỡi nhóm chuột uống dung dịch HCCa với nồng độ tương ứng theo dõi số chuột bị chết 24 sau uống Kết thử nghiệm thể Bảng Bảng Số chuột bị chết sau thử nghiệm sơ Số Nhóm chuột thử Nồng độ HCCa (mg/ml) Thể tích uống Liều tương Số (ml dung ứng chuột dịch/ 20 g thể (g HCCa/kg chết trọng) thể trọng) 4,0 0,5 0,1 40,0 0,5 1,0 3 80,0 0,5 2,0 200,0 0,5 5,0 400,0 0,5 10,0 3.2.2 Thử nghiệm thức a Các mức liều HCCa thử nghiệm Mức liều 1: nồng độ 400,0 mg/ml; mức liều 2: nồng độ 500,0 mg/ml; mức liều 3: nồng độ 600,0 mg/ml; Mức liều 4: nồng độ 700,0 mg/ml; mức liều 5: nồng độ 800,0 mg/ml Kết theo dõi tỷ lệ chuột chết/sống ngày uống dung dịch thử mức liều thử nghiệm trình bày Bảng ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 3(88).2015 Bảng Tỷ lệ chuột chết/sống các mức liều thử nghiệm Nhóm Thể tích uống Liều tương Nồng độ Số Số (ml dung dịch/ ứng (g chuột HCCa chuột 100 g thể HCCa/kg thử (mg/ml) chết trọng) thể trọng) 10 400 2,5 10,0 10 500 2,5 12,5 10 600 2,5 15,0 10 700 2,5 17,5 10 800 2,5 20,0 Kết thử nghiệm Bảng cho thấy tất nồng độ thử nghiệm, khơng có chuột bị chết, tất chuột khơng có biểu bất thường, suy LD0 mẫu HCCa thử nghiệm = 20,0 g/kg chuột Không xác định LD50 mẫu HCCa thử nghiệm giới hạn liều thử nghiệm hay LD50 mẫu HCCa thử nghiệm > 20,0 g/kg chuột Như vậy, mẫu canxi hydroxycitrat thử nghiệm có độ an tồn cao 3.3 Kết nghiên cứu đợc tính cấp HCK 3.3.1 Thử nghiệm sơ Cho mỡi nhóm chuột uống dung dịch HCK với nồng độ tương ứng theo dõi số chuột bị chết 24 sau uống Kết thử nghiệm thể Bảng Bảng Số chuột bị chết sau thử nghiệm sơ Nhóm Số chuột thử 3 3 Liều tương Nồng độ Thể tích uống Số ứng (g HCK (ml dung dịch/ chuột HCK/kg (mg/ml) 20g thể trọng) chết thể trọng) 4,0 0,5 0,1 40,0 0,5 1,0 80,0 0,5 2,0 200,0 0,5 5,0 400,0 0,5 10,0 3.3.2 Thử nghiệm thức a Các mức liều HCK thử nghiệm Mức liều 1: nồng độ 200,0 mg/ml; mức liều 2: nồng độ 270,0 mg/ml; mức liều 3: nồng độ 340,0 mg/ml; mức liều 4: nồng độ 410,0 mg/ml; mức liều 5: nồng độ 480,0 mg/ml Thực nghiệm theo dõi ngày hoạt động chuột sau uống thu kết sau: b Tiêu thụ thức ăn uống chuột Sau uống dung dich thử mức liều không nhận thấy biểu ngộ độc, chuột ăn uống, hoạt động bình thường Ở mức liều 2, 3, 5, chuột có biểu giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn nước uống thời gian theo dõi so với nhóm chứng Chuột chết khoảng thời gian từ đến 24 sau uống dung dịch thử c Quan sát dấu hiệu ngộ độc Ở mức liều 2, 3, 5, sau uống dung dịch thử, chuột có biểu mệt mỏi, giảm hoạt động, nằm mệt, tốt mồ Chuột chết khoảng thời gian từ đến 24 theo dõi Số chuột không chết mức liều có biểu giảm hoạt động, mệt mỏi thời gian theo dõi so với nhóm chứng Chuột mức liều khơng nhận thấy có biểu ngộ độc 97 d Theo dõi tỷ lệ chết/sống Kết theo dõi tỷ lệ chuột chết/ sống uống dung dịch thử mức liều thử nghiệm trình bày Bảng Bảng Tỷ lệ chuột chết/sống các mức liều thử nghiệm Nhóm Số chuột thử Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm 10 10 10 10 10 Liều tương Số chuột Số chuột ứng (g chết/sống chết/sống HCK/kg thực tế kỳ vọng thể trọng) 5,0 0/10 0/26 6,75 2/8 2/16 8,5 5/5 7/8 10,25 7/3 14/3 12,0 10/0 24/0 Tỷ lệ chết (%) 11,1 46,67 82,35 100 e Tính LD50 theo Behrens Thay giá trị từ Bảng 5: a = 46,67%, b = 82,35% A = 8,5 mg/ kg chuột, d = 1,75 g/ kg chuột vào cơng thức (1) tính LD50 theo Behrens: (50 - 46, 67) *1, 75 LD50  8,   8, 663 82, 35 - 46, Kết nghiên cứu độc tính cấp HCK cho thấy sau cho chuột uống thuốc, mức liều 2, 3, chuột có biểu mệt mỏi, giảm hoạt động, nằm mệt, tốt mồ Chuột chết khoảng thời gian từ đến 24 theo dõi Số chuột không chết mức liều có biểu giảm hoạt động, mệt mỏi thời gian theo dõi so với nhóm chứng LD50 mẫu HCK nghiên cứu 8,663 g/kg chuột Theo phân loại độc tính GHS kết luận mẫu thử kali hydroxycitrat có độ an tồn cao [1] 3.4 Kêt nghiên cứu đợc tính cấp HCMg 3.4.1 Thử nghiệm sơ Cho mỡi nhóm chuột uống dung dịch HCMg với nồng độ tương ứng theo dõi số chuột bị chết 24 sau uống Kết thử nghiệm thể Bảng Bảng Số chuột bị chết sau thử nghiệm sơ HCMg Nhóm Số chuột thử 5 5 5 Liều tương Nồng độ Thể tích uống ứng (g HCMg (ml dung dịch/ HCMg/kg (mg/ml) 20 g thể trọng) thể trọng) 200 0,5 5,0 400 0,5 10,0 600 0,5 15,0 800 0,5 20,0 1400 0,5 35,0 Số chuột chết 0 3.4.2 Thử nghiệm thức a Các mức liều HCK thử nghiệm Mức liều 1: nồng độ 600,0 mg/ml; mức liều 2: nồng độ 800,0 mg/ml; mức liều 3: nồng độ 1000,0 mg/ml; mức liều 4: nồng độ 1200,0 mg/ml; mức liều 5: nồng độ 140,0 mg/ml Thực nghiêm theo dõi 24 biểu ngày hoạt động chuột sau uống thu kết trình bày Đào Hùng Cường, Phan Thảo Thơ, Vũ Thị Hạnh Yến 98 b Tiêu thụ thức ăn uống chuột Sau uống dung dich thử mức liều chuột ăn uống, hoạt động bình thường Ở mức liều 2, 3, 5, sau uống dung dịch thử, chuột có biểu bất thường: giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn, nước uống so với nhóm chứng thời gian theo dõi c Quan sát dấu hiệu ngộ độc Ở mức liều 2, 3, 5, sau uống dung dịch thử, chuột có biểu tăng hoạt động, sau mệt mỏi, giảm hoạt động, nằm mệt, tốt mồ Chuột chết khoảng thời gian từ đến 24 theo dõi Số chuột không chết mức liều có biểu giảm hoạt động, mệt mỏi thời gian theo dõi Chuột mức liều không nhận thấy có biểu ngộ độc d Tỷ lệ chuột chết/sống mức liều thử nghiệm Kết theo dõi tỷ lệ chuột chết/sống uống dung dịch thử mức liều thử nghiệm thể Bảng Bảng Tỷ lệ chuột chết/sống các mức liều thử nghiệm HCMg Mức liều Liều thử (g mẫu thử/kg chuột) 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 Số chuột chết/ sống thực tế 0/10 1/9 4/6 8/2 10/0 Số chuột chết/ sống kỳ vọng 0/27 1/17 5/8 13/2 23/0 % Chết 5,56 38,46 86,67 100 e Tính LD50 theo Behrens Thay giá trị từ Bảng 7: a = 38,46 %; b = 86,67 %; A = 25,0 g mẫu thử/ kg chuột; d = 5,0 g mẫu thử/ kg chuột vào cơng thức (1) tính LD50 theo Behrens: (50 - 38, 46)*5,0 LD50  8,5   26, 20 86,67 - 38, 46 Kết nghiên cứu độc tính cấp HCMg cho thấy sau cho chuột uống thuốc, mức liều thấp (15,0 g/kg chuột) không nhận thấy có biểu ngộ độc, mức liều khoảng từ 20,0 g đến 35,0 g mẫu thử/ kg chuột, chuột có biểu tăng hoạt động, sau mệt mỏi, giảm hoạt động, tốt mồ Chuột bị chết khoảng thời gian đến 24 theo dõi tỷ lệ chết tùy theo mức liều uống LD50 = 26,20 g mẫu thử/ kg chuột Theo phân loại độc tính GHS kết luận mẫu thử HCMg không độc [1] Kết luận Đã nghiên cứu thử nghiệm thành cơng độc tính cấp HCA chiết tách từ lá, vỏ bứa tròn Việt Nam muối HCK, HCCa, HCMg Đã xác định đượcLD50 (HCA) = 10,81 ml/kg chuột, LD50(HCCA) > 20,0 g/kg chuột, LD50(HCK) = 8,663 g/kg chuột, LD50 (HCMg) = 26,20 g/kg chuột Theo phân loại độc tính GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, 2003), chất hợp chất có giá trị độc tính cấp LD50 > 5000 mg/kg chuột theo đường uống, coi chất không độc Như vậy, tất chất thử nghiệm kết luận khơng độc TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] GHS, A Guide to The Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals United Nations, New York, 2011 [2] Lewis Y S., Isolation and properties of hydroxycitric acid, In Methods in Enzymology; Colowick, S P., Kaplan, N O., Eds.; Academic Press: New York; Vol 13, pp 613-619, 1969 [3] Muhammed Majeed, Vladimir Badmaev, Ramaswamy Rajendran (2004), Process for the production of potassium hydroxy citric acid, and compositions containing the potassium hydroxy citric acid, United States Patent US 6,770,782 B1 [4] OECD Guidelines for testing of chemicals, Section 4, No 423, 2001 [5] Viện Dược liệu, Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 2006 (BBT nhận bài: 29/12/2014, phản biện xong: 22/01/2015) ...  10,   10,806 80, - 30, 71 Kết nghiên cứu độc tính cấp HCA cho thấy sau cho chuột uống thuốc, mức liều thấp (5,0 ml/kg chuột) không nhận thấy có biểu ngộ độc, mức liều khoảng từ 7,5 ml đến... thử/ kg chuột LD50 = 10,81 ml mẫu thử/ kg chuột Theo phân loại độc tính GHS kết luận mẫu thử HCA không độc [1] 3.2 Kết nghiên cứu đợc tính cấp HCCa 3.2.1 Thử nghiệm sơ Cho mỡi nhóm chuột uống... *1, 75 LD50  8,   8, 663 82, 35 - 46, Kết nghiên cứu độc tính cấp HCK cho thấy sau cho chuột uống thuốc, mức liều 2, 3, chuột có biểu mệt mỏi, giảm hoạt động, nằm mệt, tốt mồ Chuột chết khoảng