Untitled 94 Soá 11 naêm 2019 KH&CN nước ngoài Một vài nét về kỹ thuật PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction PCR) là kỹ thuật cho phép khuếch đại một đoạn gen trong ống nghiệm dựa và[.]
KH&CN nước Một số giải PháP để tối ưu tăng tốc Phản ứng Pcr Kỹ thuật PCR tiến hành hàng ngày hầu hết phịng thí nghiệm toàn giới PCR phương pháp nhanh an toàn để khuếch đại ADN, nhiên phương pháp chịu ảnh hưởng số yếu tố ADN mẫu làm khuôn, chất lượng enzyme ADN polymerase, chất lượng mồi, đặc biệt thiết bị dụng cụ Do đó, nhu cầu tăng tốc tối ưu hóa phản ứng PCR lớn tiếp cận theo nhiều cách khác Bài viết giới thiệu số giải pháp giúp tối ưu tăng tốc phản ứng PCR Một vài nét kỹ thuật PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction PCR) kỹ thuật cho phép khuếch đại đoạn gen ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt Dựa vào thành phần phản ứng cần thiết, đoạn gen mục tiêu nhân hàng triệu giống nhau, từ phục vụ mục đích nghiên cứu Đây xem trình cho việc phát triển hàng loạt công nghệ phân tích gen hệ gen sau Kỹ thuật PCR nhà hóa sinh học người Hoa Kỳ Kary Mullis (1944-2019) phát triển vào năm 1985 dựa ý tưởng muốn xây dựng quy trình giúp đoạn ADN nhân lên nhiều lần cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ phản ứng thông qua xúc tác enzyme ADN polymerase Ý tưởng ấp ủ ông muốn khuyếch đại (tạo nhiều sao) đoạn ADN mà không cần sử dụng sinh vật sống vi khuẩn E coli hay nấm men để tách sợi đôi ADN thành hai mạch đơn, sau sử dụng 94 cặp mồi bổ sung để bắt cặp với mạch đơn, tái nhờ enzyme ADN polymerase Khó khăn lớn trước việc phân tích gen chỗ chúng mục tiêu đơn lẻ nhỏ hệ gen phức tạp, khổng lồ Kỹ thuật PCR đời thay đổi tất cả, giúp tạo số lượng lớn đoạn ADN mong muốn Kết mang lại cho Kary Mullis Giải thưởng Nobel hóa học năm 1993 Thành công Kary Mullis việc phát triển kỹ thuật PCR có đóng góp lớn loạt nghiên cứu từ năm 50 kỷ trước Cụ thể, Arthur Komberg, nhà hóa sinh người Hoa Kỳ bắt đầu nghiên cứu chế chép ADN phát enzyme ADN polymerase vào khoảng năm 50 Đến năm 1953, James D Watson (Hoa Kỳ) Francis Crikc (Anh) tìm cấu trúc mạch đôi phân tử ADN Họ cho với cấu trúc vậy, thông tin di truyền chép nhân lên Đến năm 60, phương pháp tương tự cho phép nhân đơi mạch ADN Số 11 năm 2019 nhờ cặp mồi ADN polymerase xây dựng Kjell Kleppe (Na Uy) Har Gobind Khorana (Hoa Kỳ) Tuy nhiên, Kary Mullis với kỹ thuật PCR tỏ ưu hẳn nhờ sử dụng chu kỳ nhiệt, cho phép nhân sợi ADN cách nhanh chóng với số lượng lớn Một điểm thú vị enzyme ADN polymerase phân lập từ E coli không bền nhiệt, cần bổ sung sau giai đoạn nung nóng chu kỳ nhiệt, quy trình chậm, tốn nhiều công sức Vấn đề giải nhà vi sinh vật học Thomas Brock (Hoa Kỳ) tình cờ phát vi khuẩn chịu nhiệt Thermophilus aquaticus (hay Taq) khu vực suối nước nóng (>70oC) Cơng viên quốc gia Yellowstone, Hoa Kỳ vào đầu năm 60 Việc phát enzyme Taq polymerase giúp PCR trở thành cách mạng di truyền học phân tử, kỹ thuật ứng dụng tất phịng thí nghiệm giới KH&CN nước Ứng dụng kỹ thuật PCR Hiện nay, kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhau, từ y học, cổ sinh vật học đến pháp y Một ứng dụng phổ biến PCR lĩnh vực khoa học pháp y Trước đời kỹ thuật PCR, mẫu ADN nhỏ khơng đủ để thực xét nghiệm xác đưa kết luận chắn Tuy nhiên, cách sử dụng kỹ thuật PCR, nhà nghiên cứu tạo đủ lượng ADN để xác định hài cốt từ vụ tai nạn hay thảm họa khứ Tương tự, mẫu ADN nhỏ phục hồi từ trường vụ án chép PCR sau kiểm tra để xác định giúp loại trừ nghi phạm Trong y học đại, PCR trở thành công cụ quan trọng lĩnh vực nghiên cứu ung thư PCR sử dụng để phát số bệnh ung thư virus gây ung thư cổ tử cung (gây virus u nhú người - HPV), ung thư da, ung thư miệng Một ứng dụng y tế quan trọng khác PCR quy trình phân loại mô để xem xét khả tương hợp mô người hiến tạng bệnh nhân cần trải qua cấy ghép nội tạng; lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân, xét nghiệm quan hệ di truyền; xác định sớm bệnh truyền nhiễm theo dõi lây lan bệnh truyền nhiễm người động vật Ngồi ra, PCR xác định nhiễm nấm ký sinh trùng (có thể phát nhiễm HIV trước kháng thể tạo ra) Khuếch đại ADN sử dụng thường xuyên để sàng lọc máu hiến nhằm ngăn máu nhiễm bệnh xâm nhập vào ngân hàng máu Trong lĩnh vực cổ sinh vật học, PCR sử dụng để khếch đại mẫu vật ADN tồn mô trăm ngàn năm tuổi Kỹ thuật sử dụng mẫu mô xác ướp, hệ thực vật động vật cổ đại, hóa thạch Do đó, việc sử dụng PCR lĩnh vực giúp xác định tìm hiểu sinh vật tuyệt chủng q trình hóa thạch tiến hóa Kỹ thuật PCR cịn tỏ hữu ích số khía cạnh vi sinh vật môi trường Chúng sử dụng để giúp phát hiện, xác định vi khuẩn mầm bệnh có hại nguồn nước công cộng; phát vi sinh vật thối hóa, nơi chất thải độc hại cố ô nhiễm xảy Tại Việt Nam, PCR kỹ thuật dựa tảng PCR ứng dụng phổ biến nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác y học (phát bệnh di truyền, nhận dạng vân tay ADN xác định huyết thống), nơng nghiệp (chọn dịng cá thể lai nhờ thị phân tử, xác định bệnh kiểm định giống) Nguyên tắc số giải pháp nâng cao chất lượng kỹ thuật PCR Nguyên tắc phương pháp PCR tạo lượng lớn đoạn ADN đặc thù từ ADN khuôn dựa sở hoạt động enzyme Taq polymerase để tổng hợp sợi bổ sung Các yếu tố để thực phản ứng PCR (tổng thể tích dao động khoảng 20-50 µl) bao gồm: i) Sợi khn ADN (chỉ cần biết trình tự nucleotide đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide); ii) Hai đoạn mồi ngắn để xác định điểm bắt đầu tổng hợp ADN (mồi dài khoảng 20 nucleotide nucleotide hai đầu mồi không tự kết hợp với theo nguyên tắc bổ sung); iii) Có đầy đủ loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP; iv) Mơi Số 11 năm 2019 95 KH&CN nước ngồi trường đệm cung cấp ion Mg nước tinh khiết khơng có enzyme RNAse ADNse; v) Enzyme chịu nhiệt Taq Trong phản ứng PCR, thường dựa vào kit hoá chất thương mại có khả mang lại suất tối ưu với quy trình nhanh Tuy nhiên, việc chuẩn bị mẫu, thiết bị vật tư tiêu hao quy trình làm PCR ảnh hưởng đến kết phản ứng theo cách khơng đánh giá thường xun Vì vậy, số giải pháp đưa nhằm cải thiện tăng tốc độ phản ứng PCR Thứ nhất, cải thiện vật liệu block nhiệt phù hợp làm tăng tốc độ gia nhiệt hạ nhiệt Các vật liệu dẫn nhiệt sử dụng làm hợp kim cho block nhiệt bên thiết bị PCR có tác dụng tăng hạ nhiệt Nhôm vật liệu tiêu chuẩn thường sử dụng, nhiên block nhiệt cấu tạo từ hợp kim bạc đạt tốc độ gia nhiệt nhanh gấp đôi Tốc độ gia nhiệt hạ nhiệt nhanh giúp phản ứng PCR diễn nhanh Điều quan trọng nhiệt độ phải đạt cách đáng tin cậy, với độ lệch tối thiểu, độ vượt giá trị kiểm soát để đảm bảo điều này, cần kiểm tra định kỳ, lý tưởng sử dụng thiết bị kiểm tra nhiệt độ Temperature Verification System (TVS) Thứ hai, công nghệ gradient nhiệt chiều giúp tối ưu hoá phản ứng PCR Công nghệ gradient nhiệt giúp tối ưu nhiệt độ gắn mồi nhanh chóng Tính cách mạng q trình tối ưu hố phản ứng PCR Tuy nhiên để xác định nhiệt độ biến tính tối ưu, phải chạy thêm nhiều phản 96 ứng PCR Một lần nữa, công nghệ 2D-gradient phát triển Theo cách này, nhiệt độ biến tính khác chọn hàng, đồng thời nhiệt độ gắn mồi khác chọn cột Nhiệt độ tối ưu ngăn chặn biến tính gắn mồi khơng hồn chỉnh Tính cho phép xác định nhiệt độ tối ưu dẫn đến suất tối đa kết PCR lặp lại tối ưu Thứ ba, tối ưu hóa vật tư tiêu hao để tăng tốc phản ứng PCR Một cách khác để tăng tốc độ chạy phản ứng PCR việc sử dụng kit hoá chất PCR phát triển đặc biệt kết hợp với ống PCR nhanh Ống PCR nhanh có thành ống mỏng, đồng thời trì ổn định chúng - tính cho phép gia nhiệt hạ nhiệt mẫu nhanh Nhiệt độ bên mẫu đạt đồng với trợ giúp kit PCR nhanh, lần chạy PCR hoàn thành vịng 16 phút Thêm vào đó, việc sử dụng ống PCR nhanh mang lại suất ADN tăng nhiều lần Thứ tư, số lượng mẫu nhiều, kiểm soát tập trung làm giảm thời gian cho quy trình chạy phản ứng PCR Nếu có nhiều máy PCR để chạy chương trình phịng thí nghiệm, kiểm soát tập trung làm giảm thời gian thao tác với máy Với máy PCR Hãng Eppendorf (Đức), 50 máy PCR khác kết nối vào mạng (network) điều khiển phần mềm trung tâm, theo cách dùng 30 máy chạy chương trình thứ 20 máy chạy chương trình thứ hai Đối với phịng thí nghiệm số lượng mẫu thấp hơn, máy PCR kết nối mạng lan Số 11 năm 2019 với điều khiển bảng điều khiển máy Điều giúp tiết kiệm thời gian q trình cài đặt chương trình Ngồi ra, tối ưu hóa kết PCR thơng qua điều chỉnh thiết kế mồi, thành phần hỗn hợp PCR master mix quy trình chuẩn bị mẫu Thêm vào đó, kết nối nhiệt độ biến tính nhiệt độ gắn mồi thời gian kéo dài chuỗi quan trọng lượng ADN cụ thể, độ tinh khiết chất lượng Rất đáng để thử nghiệm tất tùy chọn trước mua đặt hàng mồi Thay lời kết Kể từ phát triển vào đầu năm 80, kỹ thuật PCR mở nhiều khả giúp hiểu rõ giới khứ Tương lai, kỹ thuật PCR cổ sinh vật học phân tử chí sử dụng thám hiểm không gian để giúp xác định liệu sống tồn hành tinh khác hệ mặt trời hay xa Có nhiều cách để cải thiện nâng cao chất lượng rút ngắn thời gian chạy phản ứng PCR bắt đầu việc lựa chọn thiết bị dụng cụ, vật tư hoá chất tiêu hao phù hợp ứng dụng công nghệ Việc phát kết hợp tối ưu thời gian, nỗ lực ban đầu đền đáp xứng đáng dạng tiết kiệm chi phí thời gian ? Trần Việt Dũng, Chu Đức Hà (lược dịch từ Bionews) ... phép xác định nhiệt độ tối ưu dẫn đến suất tối đa kết PCR lặp lại tối ưu Thứ ba, tối ưu hóa vật tư tiêu hao để tăng tốc phản ứng PCR Một cách khác để tăng tốc độ chạy phản ứng PCR việc sử dụng... giúp tối ưu hố phản ứng PCR Cơng nghệ gradient nhiệt giúp tối ưu nhiệt độ gắn mồi nhanh chóng Tính cách mạng q trình tối ưu hố phản ứng PCR Tuy nhiên để xác định nhiệt độ biến tính tối ưu, phải... suất tối ưu với quy trình nhanh Tuy nhiên, việc chuẩn bị mẫu, thiết bị vật tư tiêu hao quy trình làm PCR ảnh hưởng đến kết phản ứng theo cách không đánh giá thường xuyên Vì vậy, số giải pháp