Xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ duchenne ở mức độ mrna và phát hiện người lành mang gen bệnh

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD) bệnh lý di truyền thường gặp nhất, phát tất chủng tộc khác giới Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai Hầu hết trẻ trai mắc bệnh có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ, biểu khó lại, khó đứng lên ngồi xuống khó khăn leo cầu thang Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, khả lại vào lứa tuổi 12 thường tử vong 20 tuổi tổn thương tim rối loạn hô hấp [62], [146] DMD bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên đột biến gen dystrophin Gen nằm nhiễm sắc thể (NST) X locus Xp21, có chiều dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với promotor khác Đây gen lớn người phát Gen mã mRNA 14kb tổng hợp sản phẩm protein tương ứng dystrophin Protein có mặt màng bào tương tế bào có chức việc trì ổn định màng, bảo vệ tế bào khỏi bị tổn thương trình co Khi gen bị đột biến, trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu tế bào bệnh nhân bị thối hóa dần gây nên bệnh DMD [96], [109] Hiện nay, đồ đột biến gen dystrophin gần xác định Dạng đột biến đoạn gen phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60% Đột biến điểm đứng thứ hai mức độ thường gặp, chiếm 20-30% Đột biến lặp đoạn, khoảng 10-15% [106] Nhiều cơng trình nghiên cứu cho thấy đột biến đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) vùng trung tâm gen (exon 43-60) vùng tận 5’ (exon 1-19) [91], [107] Vì vậy, để tiết kiệm kinh phí thời gian việc phát đột biến đoạn gen, tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho 19-25 exon vùng hay xảy đoạn [7], [20], [69] Những năm gần đây, nhờ vào phát triển ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học nước nước tiến hành nghiên cứu phát đột biến gen dystrophin bệnh nhân DMD Tuy nhiên Việt Nam, nghiên cứu thường tập trung vào xác định dạng đột biến đoạn gen mức độ DNA thường ưu tiên xác định đột biến vùng trọng điểm [1], [7], [10] Trong đột biến gen dystrophin rải rác khắp 79 exon Do vậy, nghiên cứu thường bỏ sót đột biến exon khác đột biến xảy trình hoàn thiện tiền mRNA Một điều cần lưu ý để xác định đột biến xảy gen dystrophin phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) mức độ DNA, phải khuếch đại toàn chiều dài gen, có nghĩa phải khuếch đại tồn 79 exon để xác định đột biến Trên phân tử DNA, exon lại nằm xen kẽ với intron có kích thước q lớn nên để khuếch đại 79 exon mức độ DNA người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu hai đầu exon Điều gây tốn tài lẫn thời gian Ngược lại, cấu trúc mRNA, đoạn intron bị cắt bỏ 79 exon nằm liên tục Do vậy, để khuếch đại toàn chiều dài đoạn mRNA chứa 79 exon này, người ta cần dùng 15 cặp mồi đặc hiệu khuếch đại chiều dài đoạn gen dystrophin [9], [77], [129] Như vậy, việc xác định đột biến mức độ RNA giúp tiết kiệm nhiều cơng sức, thời gian hóa chất Với biểu lâm sàng nặng nề rối loạn tinh thần tử vong sớm chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, bệnh loạn dưỡng Duchenne thực tai họa thân người bệnh gánh nặng gia đình cộng đồng Theo nhiều nghiên cứu, 2/3 bệnh nhân DMD nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân bị đột biến phát sinh [66] Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán trước sinh phát thai nhi bất thường phòng bệnh phương pháp phá thai chủ động lựa chọn nhiều người đồng thuận, từ giảm tỉ lệ mắc bệnh DMD cộng đồng [93], [107] Ở Việt Nam, năm 1996, Nguyễn Thị Trang CS nghiên cứu lâm sàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ creatine kinase (CK) chẩn đoán người mang gen bệnh phát khoảng 50% trường hợp nghiên cứu có khả người mang gen bệnh [20] Trong nghiên cứu khác, năm 2006, Nguyễn Văn Quyệt cho rằng, phối hợp phân tích phả hệ định lượng hoạt độ CK phát 50% bà mẹ dị hợp tử [16] Tuy nhiên, kết mang tính chất gợi ý, khơng có sở tổn thương di truyền chưa đủ sức thuyết phục để thực tư vấn di truyền Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Xác định đột biến đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng Duchenne mức độ mRNA phát người lành mang gen bệnh” tiến hành với mục tiêu sau: Xác định đột biến đoạn gen bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne mức độ mRNA Chẩn đoán người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái dì) gia đình bệnh nhân xác định đột biến đoạn gen Bước đầu thực chẩn đoán trước sinh cho bà mẹ dị hợp tử CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD - Tháng 12-1851, Meryon, thầy thuốc người Anh mô tả chi tiết trẻ gia đình mắc bệnh mà sau gọi bệnh loạn dưỡng Duchenne Ông cho nguyên nhân bệnh giảm yếu tố dinh dưỡng [49] - Năm 1861, Duchenne, nhà thần kinh học người Pháp có cơng mơ tả dạng giả phì đại bệnh loạn dưỡng thường gặp trẻ trai Năm 1868, Duchenne thực nghiên cứu quy mô bệnh lý này, ơng đưa tiêu chuẩn chẩn đốn bệnh dựa kết giải phẫu bệnh kích thích điện Duchenne nhận thấy có thay mơ mô xơ mô liên kết tiêu sinh thiết Sau ơng sử dụng thủy trị liệu kết hợp với xoa bóp để điều trị cho bệnh nhân nhận thấy có cải thiện bệnh số bệnh nhân Chính nhờ phát quan trọng mà sau bệnh mang tên ông [34] - Năm 1879, Gowers thu thập bệnh án 220 bệnh nhân mô tả cách kỹ lưỡng bệnh với hình ảnh lâm sàng điển hình chi tiết Ơng phát phụ nữ có đứa trai khác cha bị bệnh Gowers nhận thấy trẻ mắc bệnh có đặc điểm giống thay đổi tư từ nằm sang đứng Từ đó, dấu hiệu xem dấu hiệu điển hình bệnh DMD mang tên ông: dấu hiệu Gowers [62] - Nếu tính từ thời Meryon bệnh DMD biết 150 năm Tuy nhiên, suốt thời gian dài, bệnh chủ yếu đánh giá mức độ lâm sàng điều trị tập trung vào chăm sóc hỗ trợ q trình bệnh [140] - Trong năm 1980, nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán đặc biệt chẩn đốn sớm bệnh DMD chưa có biểu lâm sàng, phát dị hợp tử bệnh DMD đo hoạt độ enzym CK, phục vụ cho điều trị tư vấn di truyền [58], [102] - Năm 1981, Zatz CS phát gen dystrophin nằm vị trí Xp21.1 nhờ quan sát trẻ gái mắc bệnh DMD Những bệnh nhân nữ mang chuyển đoạn NST X NST thường [140] - Năm 1984-1987, Hoffman CS phát gen dystrophin sản phẩm protein tương ứng gen [38], [65] - Những năm sau 1987, số nước tiên tiến, phương pháp di truyền phân tử phát triển mạnh giúp việc phát đột biến gen dystrophin, tiến tới chẩn đoán trước sinh phát người nữ lành mang gen bệnh để tư vấn di truyền nhằm hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh DMD [29], [38] - Năm 1987-1988, nhà nghiên cứu cho biết gen dystrophin gồm 60 exon - Năm 1989, gen dystrophin phát với kích thước 2300 kb [47] - Năm 1993, thành phần cấu trúc gen dystrophin phát đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 2400 kb [106], [112] - Từ năm 1993 trở lại đây, chế sinh học phân tử bệnh ngày làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm giải pháp tốt khắc phục hậu nặng nề bệnh gây [92], [109] 1.2 Đặc điểm bệnh DMD 1.2.1 Biểu lâm sàng DMD Bệnh DMD biểu qua giai đoạn: - Giai đoạn (3-5 tuổi): trẻ có dấu hiệu chậm biết lại hay vấp ngã chưa có biểu teo - Giai đoạn (6-7 tuổi): trẻ có biểu yếu xuất dấu hiệu Gowers rõ Khi trẻ ngồi xổm muốn đứng thẳng lên nằm muốn ngồi dậy, trẻ phải quay người sang bên, gấp đầu gối lại, hai tay chống nạng đỡ lấy thân để giữ tư quỳ bắn; sau cách tỳ hai tay lên cẳng chân, đầu gối đùi, trẻ đẩy cho thân thẳng dậy Sự tiếp nối động tác xem đặc hiệu bệnh loạn dưỡng tuần tiến - Giai đoạn (12-15 tuổi): trẻ thường khả lại lúc 12 tuổi Sau dấu hiệu teo xuất trẻ không lại Cuối trẻ thường tử vong tuổi 20-25 tổn thương tim rối loạn hô hấp [62], [96] 1.2.2 Xét nghiệm cận lâm sàng 1.2.2.1 Định lượng hoạt độ CK toàn phần CK Lohman phát vào năm 1934 CK enzym xúc tác tạo lượng giúp cho trình co, duỗi trình chuyển hóa chất tế bào Năm 1959, Ebashi CS người áp dụng việc định lượng hoạt độ CK huyết chẩn đoán bệnh lý tổn thương Các tác giả nhận thấy hoạt độ CK tăng cao gấp hàng chục lần bệnh nhân loạn dưỡng tiến triển Manhoney (1977), Edward (1984) phát CK tăng máu thai nhi bị bệnh DMD [48], [104] Ở bệnh nhân DMD, hoạt độ CK huyết thường tăng cao trước có dấu hiệu lâm sàng, chí tăng từ thời kỳ sơ sinh Hoạt độ CK huyết bệnh nhân DMD khoảng từ 10000 đến 35000 UI/L (bình thường 160 UI/L) Theo Matsuo (2002), hoạt độ CK huyết bình thường loại trừ chẩn đoán DMD Tuy nhiên, giai đoạn muộn trình bệnh, hoạt độ enzym giảm thấp Lý tượng vào giai đoạn cuối, khối cịn lại q ít, mặt khác bệnh nhân giảm vận động nên lượng thối hóa [4], [91], [102] 1.2.2.2 Phương pháp thăm dò điện sinh lý Ghi điện phương pháp nghiên cứu hoạt động điện cách ghi lại điện hoạt động sợi trạng thái khác Nhờ nghiên cứu Kugelberg (1947), Buchtbal (1953), phương pháp ghi điện ứng dụng để chẩn đoán sớm bệnh loạn dưỡng tiến triển trước có biểu lâm sàng Năm 1979, Stalberg Trontelj mơ tả chi tiết hình ảnh tổn thương điện đồ bệnh nhân loạn dưỡng [103] Trên bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne, điện đồ cho thấy biến đổi đặc trưng bệnh lý không đặc hiệu cho DMD, khơng có chứng tượng suy giảm phân bố thần kinh cơ, tốc độ dẫn truyền thần kinh cảm giác vận động bình thường [34] 1.2.2.3 Sinh thiết Vào kỷ 19, Meryon (1852) Duchenne (1868) áp dụng phương pháp sinh thiết để chẩn đoán bệnh DMD [34] Trong nhiều năm sau đó, phương pháp xem cơng cụ đắc lực để chẩn đoán xác định bệnh DMD chẩn đoán phân biệt với bệnh lý khác Sinh thiết có tác dụng chẩn đốn xác định dựa vào thay đổi đặc trưng mô sinh thiết Biến đổi mô bệnh học đặc trưng bao gồm tăng sinh tổ chức liên kết mô bọc sợi cơ, sợi bị thối hóa tái sinh rải rác Mô bệnh học cho thấy ổ thâm nhiễm tế bào viêm đơn nhân, hậu phản ứng viêm khởi động trình hoại tử sợi cơ; song song sợi có chức bình thường biểu thay đổi nhẹ mặt cấu trúc Ngồi ra, mơ sinh thiết cịn có nhiều sợi đậm đặc; sợi co rút thái hậu hoại tử vị trí khác chiều dài sợi cơ, trình hoại tử tạo điều kiện cho canxi vào nội bào qua chỗ tổn thương màng sợi vân, luồng canxi vào khởi động q trình co rút tồn chiều dài sợi [34] Vị trí sinh thiết thường sử dụng lâm sàng rộng tứ đầu đùi sinh đơi ngồi [62] 1.2.2.4 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (MDHQ) Protein dystrophin định vị màng sợi Bởi với phương pháp miễn dịch huỳnh quang tiêu sinh thiết, đường viền sợi bình thường xuất phát sáng huỳnh quang liên tục, không ngắt quãng; tiêu sinh thiết bệnh nhân DMD khơng có bắt màu, không thấy rõ ranh giới màng tế bào cơ, phản ánh vắng mặt protein dystrophin màng tế bào bệnh nhân DMD [62], [89] Một thể bệnh nhẹ DMD hay gặp loạn dưỡng Becker (BMD) Triệu chứng lâm sàng bệnh nhân BMD xuất muộn so với bệnh nhân DMD, mức độ biểu nhẹ thời gian tiến triển chậm Trên tiêu sinh thiết cơ, protein dystrophin giảm đáng kể màng tế bào sợi song khơng vắng mặt hồn tồn thể nặng DMD [28] Người thường bình Bệnh nhân BMD Bệnh nhân DMD Hình 1.1 Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang protein dystrophin (Nguồn: Matsuo, 2002) 1.2.2.5 Phương pháp di truyền phân tử xác định gen đột biến Sự thành công Kunkel CS (1985) việc phát đoạn lớn NST X bệnh nhân nam DMD khởi đầu cho loạt nghiên cứu xác định gen bệnh nhân DMD Hiện nay, có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định đột biến gen dystrophin kỹ thuật PCR, Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR), Fluorescence in situ Hybridization (FISH), Southern blot, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) [90], [91], [107] Các kỹ thuật trình bày phần 1.4 1.2.3 Tần số bệnh DMD bệnh di truyền phổ biến, có tần suất cao nhóm bệnh loạn dưỡng tuần tiến với tỉ lệ 1/3500 trẻ trai [34] Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu rõ ràng tần suất mắc bệnh DMD Theo Nguyễn Thu Nhạn CS năm 1981-1990 có 131 bệnh nhân vào điều trị Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền, Bệnh Viện Nhi Trung Ương, chiếm 0,6% tổng số bệnh nhân vào điều trị [13] Theo Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng giai đoạn 1991-1996 có 88 bệnh nhân DMD vào điều trị viện Bệnh Viện Nhi Trung Ương, chiếm 19,4% bệnh di truyền Khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền chiếm khoảng 0,11% tổng số bệnh nhân vào điều trị bệnh viện [14] 1.2.4 Di truyền học bệnh DMD DMD bệnh di truyền đơn gen, tuân theo quy luật di truyền lặn liên kết NST X khơng có alen tương ứng NST Y Bệnh thường gặp trẻ trai mà gặp trẻ gái Trẻ trai cần nhận gen bệnh NST X người mẹ mang gen (XDXd) có biểu bệnh, trẻ gái địi hỏi phải nhận gen X mang bệnh, gen bệnh từ mẹ gen bệnh từ bố có khả biểu bệnh Tuy nhiên, trẻ trai bị bệnh DMD thường chết sớm tuổi từ 20 đến 25 nên khơng có khả lập gia đình Do vậy, sáu trường hợp bảng 1.1, khả thứ hai hay gặp nhất, người mẹ mang gen bệnh có khả truyền bệnh cho 50% số trai truyền gen bệnh cho 50% số gái họ [96] Trong vài trường hợp, người nữ mang gen có biểu bệnh NST X khơng mang gen bệnh bị bất hoạt dẫn đến NST X lại mang gen bệnh biểu bệnh [54], [56] multiplex PCR Mặc khác, phản ứng PCR, khuếch đại đồng thời exon gen dystrophin, có exon mà bệnh nhân không bị đột biến nhằm làm đối chứng nội hỗn hợp master mix chung cho tất ống PCR Với việc sử dụng hai lần đối chứng, kết phân tích có độ xác cao Theo Hung (2006) Hwa (2007), độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp lên đến 100% [66], [69] Hình 3.6 biểu kết điện di gel agarose nhóm chứng, nam giới đậm độ vạch điện di (tương ứng với nồng độ) exon chứng nam ½ so với chứng nữ Kết tương tự phân tích định lượng máy Agilent 2100 Bioanalyzer (hình 3.7), nồng độ exon (tương ứng với chiều cao) gen dystrophin sau khuếch đại đối chứng nam luôn 1/2 so với exon tương ứng đối chứng nữ Kết hồn tồn phù hợp gen dystrophin nằm NST giới tính X Nam giới mang NST X, nữ giới mang NST X Do vậy, dùng cặp mồi nồng độ để khuếch đại exon nam nữ nồng độ chúng sản phẩm PCR nữ gấp đôi nam Kết phù hợp với nghiên cứu Hung (2006), phân tích 38 exon gen dystrophin nhóm chứng gồm 50 nam 50 nữ bình thường; tác giả nhận thấy đỉnh exon nam ln ½ so với đỉnh exon tương ứng nữ [66] 4.3.2 Kết phân tích gia đình có mẹ khơng mang gen bệnh Phân tích kết điện di agarose gia đình bệnh nhân mã số thấy đậm độ exon khuếch đại người mẹ em gái bệnh nhân với đậm độ exon tương ứng chứng nữ gấp đôi đậm độ exon tương ứng chứng nam Kết khẳng định cách định lượng nồng độ exon Hình ảnh điện di mao quản cho thấy nồng độ exon (kể exon bị đột biến đoạn bệnh nhân exon 46 49) mẹ em gái bệnh nhân với nồng độ exon chứng nữ Như gia đình này, người mẹ mang gen dystrophin hồn tồn bình thường nên em gái bệnh nhân mang gen dystrophin bình thường Điều chứng tỏ đột biến đoạn gen bệnh nhân đột biến phát sinh Theo Fortina, tỷ lệ đột biến xuất trẻ DMD 1/3, 2/3 bệnh nhân DMD nhận gen bị đột biến từ người mẹ Nghiên cứu Abbs Hussey đưa kết tương tự [23], [52], [67] Quan sát hình ảnh điện di bệnh nhân mã số agarose, xuất hai vạch tương ứng với hai exon không bị đột biến Kết tương tự điện di định lượng, xuất hai đỉnh hai exon 41 exon 51 hai exon không bị đột biến, đỉnh hai exon 46 49 không xuất chúng bị đột biến đoạn Hiện nay, tiến hành phân tích đột biến gen dystrophin, tác giả thường sử dụng phương pháp multiplex PCR định lượng máy điện di mao quản thay phương pháp PCR đơn điện di agarose [66], [69] Ngoài việc phát đột biến đoạn, phương pháp PCR định lượng giúp phát đột biến lặp đoạn gen phát trường hợp dị hợp tử mà phương pháp điện di agarose khó thực xác Theo Hung, đỉnh điện di mao quản exon bệnh nhân cao gấp đôi so với mẫu đối chứng nam, tức với mẫu đối chứng nữ bệnh nhân bị đột biến lặp đoạn exon [66] Phân tích tương tự với gia đình bệnh nhân mã số 8, kết điện di cho thấy, sau khuếch đại phản ứng PCR, nồng độ bốn exon gen dystrophin người mẹ em gái bệnh nhân exon tương ứng đối chứng nữ gấp đôi exon tương ứng chứng nam Như vậy, mẹ bệnh nhân người bình thường, khơng mang gen bệnh đột biến bệnh nhân đột biến phát sinh 4.3.3 Kết phân tích gia đình có mẹ mang gen bệnh Hình 3.10 biểu kết phân tích gia đình bệnh nhân mã số Bệnh nhân xác định có đột biến đoạn exon 42, 43 exon 44 Phân tích hình ảnh điện di agarose điện di định lượng mẫu đối chứng nam nữ, thấy nồng độ exon đối chứng nam 1/2 nồng độ exon tương ứng đối chứng nữ Mặc khác, kết điện di mẹ bệnh nhân cho thấy: nồng hai exon không bị đột biến (exon 41, 46) với nồng độ exon tương ứng chứng nữ Đây hai exon sử dụng để làm đối chứng nội cho phản ứng PCR, với kết khẳng định khơng có khác biệt điều kiện thực phản ứng PCR mẫu phân tích kết phân tích hồn tồn đáng tin cậy Với hai exon mà bệnh nhân bị đột biến đoạn (exon 42 43), đậm độ màu chúng người mẹ nhạt nhiều so với chứng nữ, điều biểu rõ điện di máy Agilent 2100 Bioanalyzer, độ cao hai exon bị đột biến người mẹ 1/2 so với chứng nữ Hwa (2007), cho đỉnh exon bị đột biến người mẹ 1/2 so với chứng nữ người mẹ mang gen bị đột biến đoạn, chiều cao exon bị đột biến người mẹ  1,5 lần so với chứng nữ người mẹ mang gen bị đột biến lặp đoạn gen [69] Nghiên cứu Lai cho chiều cao đỉnh điện di mao quản mẹ bệnh nhân giảm từ 35-50% so với chứng nữ người mẹ mang gen bị đột biến đoạn exon tương ứng với đỉnh điện di Nếu chiều cao đỉnh điện di tăng từ 30-50% so với chứng nữ mẹ bệnh nhân mang gen bị đột biến lặp đoạn exon tương ứng [76] Năm 2004, Joncourt nghiên cứu 44 thành viên nữ 23 gia đình có bệnh nhân đột biến đoạn đưa kết luận: tỷ lệ nồng độ exon thành viên nữ so với chứng nữ 0,520,12 người nữ bị đột biến đoạn exon [70] Như vậy, kết luận: mẹ bệnh nhân mã số mang gen dystrophin bị đột biến đoạn từ exon 42 đến exon 44 Bởi vậy, khuếch đại hai exon 42 43 (nằm vùng bị đoạn) có NST X bình thường người mẹ chứa hai exon nhân lên NST X lại bị đột biến hai exon 42 43 nên chúng không khuếch đại Trong chứng nữ chứa hai NST X bình thường nên exon 42 43 nằm hai NST X chứng nữ khuếch đại, nồng độ hai exon chứng nữ gấp đôi so với người mẹ bệnh nhân Phân tích kết tương tự với gia đình bệnh nhân mã số bị đột biến đoạn exon 51 Tiến hành khuếch đại exon 51 với hai exon bệnh nhân không bị đột biến exon 13 exon 41 nhằm làm đối chứng Kết điện di agarose cho thấy đậm độ hai exon 13, exon 41 mẹ với đậm độ exon tương ứng chứng nữ, đậm độ exon 51 mẹ nhạt nhiều so với chứng nữ Điều gợi ý mẹ bệnh nhân dạng dị hợp tử Kết khẳng định định lượng máy điện di mao quản, nồng độ hai exon đối chứng (exon 13, 41) mẹ bệnh nhân với mẫu chứng nữ, nồng độ exon 51 (là exon bệnh nhân bị đột biến đoạn) mẹ ½ so với đối chứng nữ Từ đó, chúng tơi kết luận mẹ bệnh nhân người mang gen bệnh Ở gia đình bệnh nhân mã số cịn có hai chị gái bệnh nhân, kết phân tích cho thấy hai người chị gái mang gen bệnh Như bà mẹ bệnh nhân mã số truyền gen bệnh cho 100% có bà Kết đưa lời cảnh báo, người mẹ dị hợp tử có khả lan truyền gen bệnh với tỷ lệ cao, nhanh cộng đồng Do vậy, việc phát người mẹ mang gen đột biến để tiến hành chẩn đoán trước sinh, đưa lời khuyên di truyền nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh cộng đồng vấn đề cấp thiết Chỉ có làm giảm tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh di truyền nói chung hay bệnh DMD nói riêng Gia đình thứ ba nhóm gia đình mang gen bệnh mà chúng tơi muốn phân tích gia đình bệnh nhân mã số 11 Bệnh nhân có đột biến đoạn gen từ exon 34 đến exon 43 Tiến hành khuếch đại bốn exon bảy thành viên gia đình bệnh nhân gồm mẹ, dì gái người dì bệnh nhân Trong bốn exon này, có hai exon mà bệnh nhân bị đoạn exon 37, exon 41 hai exon mà bệnh nhân không bị đột biến exon 49 51 Kết phân tích hình ảnh điện di agarose máy Agilent 2100 Bioanalyzer cho thấy người mẹ bệnh nhân (mã số 11), người dì thứ (mã số 13) gái người dì (mã số 17) có mang gen bị đột biến đậm độ vạch điện di giảm độ cao (tương ứng với nồng độ) hai exon bị đột biến 1/2 so với chứng nữ thành viên lại gia đình Trong đó, nồng độ hai exon không bị đột biến đồng thành viên gia đình có giá trị với chứng nữ Phân tích phả hệ gia đình thấy bệnh nhân có người cậu bị chết chẩn đoán DMD Người dì thứ sinh người trai vừa chết bệnh DMD Điều chứng tỏ có yếu tố di truyền gia đình Như vậy, người mẹ dì bệnh nhân (mã số 13) dị hợp tử bắt buộc gen bệnh trai họ thừa hưởng từ mẹ Tuy nhiên phân tích phả hệ xác định người em họ bệnh nhân (mã số 17) có mang gen bệnh hay khơng người em cịn nhỏ tuổi, chưa lập gia đình, xét nghiệm định lượng hoạt độ CK hồn tồn bình thường Tuy nhiên phân tích định lượng máy Agilent 2100 Bioanalyzer cho thấy em bé có kiểu gen dị hợp tử Kết khẳng định người dì bệnh nhân (mã số 13) có mang gen đột biến truyền gen bệnh cho người trai (đã biến chứng suy hô hấp DMD) cho gái bà Lời khuyên di truyền cho gia đình bệnh nhân thực hiện, cần tiến hành chẩn đoán trước sinh người mẹ, người dì bệnh nhận mang thai người em gái họ bệnh nhân (mã số 17) đến tuổi lập gia đình chuẩn bị sinh 4.3.4 Tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh Trong 48 thành viên nữ 30 gia đình bệnh nhân có đột biến gen dystrophin, phát 21 người dạng dị hợp tử, chiếm tỷ lệ 43,8% Trong gồm 15 người mẹ, người chị em ruột bệnh nhân, người dì người em họ bệnh nhân Như vậy, có 50% bà mẹ bệnh nhân dạng dị hợp tử 50% người mẹ hồn tồn bình thường, có nghĩa tỷ lệ đột biến phát sinh bệnh nhân DMD nghiên cứu 50% Theo Ligon, tỷ lệ bệnh nhân DMD thừa hưởng gen bệnh từ người mẹ 2/3, có 1/3 trường hợp đột biến phát sinh [84] Kết luận tương tự nghiên cứu Gatta (2005) Hung (2006) [55], [66] Kết nghiên cứu chứng tỏ tỷ lệ đột biến phát sinh bệnh nhân DMD Việt Nam tương đối cao, chiếm 50% Điều giải thích yếu tố chủng tộc, yếu tố bên tác động lên trình phát sinh giao tử thể bố mẹ điều kiện môi trường sống, tập quán ăn uống, chiến tranh để lại nhiều chất độc hại môi trường, Theo Fortina, Mukherjee nhiều tác giả, đột biến phát sinh gây bệnh loạn dưỡng Duchenne thường xảy trình tạo giao tử tác động yếu tố bên [2], [52], [72], [97] Đây nghiên cứu xác định người lành mang gen dystrophin đột biến thực Việt Nam Nghiên cứu đóng vai trị quan trọng hầu hết thành viên nữ mang gen bệnh lứa tuổi sinh đẻ, kết sở giúp chẩn đoán trước sinh tư vấn di truyền 4.3.5 Phân tích phả hệ gia đình nghiên cứu Phả hệ có tiền sử gia đình phả hệ có từ bị bệnh trở lên có hai hệ bị bệnh trở lên, có từ hai chị em gái sinh bị bệnh trở lên [79], [118] Trong 30 gia đình bệnh nhân bị đột biến đoạn, có người mẹ có tiền sử gia đình, chiếm 16,7% Theo thống kê Lane, tỷ lệ bà mẹ sinh mắc bệnh DMD có tiền sử gia đình Ireland Hà Lan 22%, Anh 3540% [79] Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Phượng nghiên cứu 148 gia đình có bệnh nhân DMD phát 38 gia đình (chiếm tỷ lệ 25,5%) có tiền sử di truyền Năm 2001, Nguyễn Thị Trang phân tích 107 phả hệ bệnh nhân DMD đưa kết luận: 26,2% người mẹ có tiền sử gia đình Như vậy, tỷ lệ phả hệ có tiền sử gia đình nghiên cứu thấp tác giả khác Điều số lượng mẫu nghiên cứu chúng tơi hạn chế, chúng tơi phân tích phả hệ gia đình có bệnh nhân DMD, mà tất bệnh nhân xác định có đột biến đoạn gen Mặt khác, theo Hutton, hỏi tiền sử, có nhiều người mẹ khơng biết hệ trước gia đình có người bị bệnh DMD hay không, họ không muốn cho gia đình chồng người lạ biết vấn đề bệnh tật di truyền dịng họ [68] Chỉ với 16,7% người mẹ có tiền sử gia đình bị DMD thông số thật quan trọng kết cho thấy, người mẹ người mang gen bệnh Như kết luận, phân tích phả hệ giúp phát người mẹ dị hợp tử Trên thực tế, có nhiều nghiên cứu phát người mẹ mang gen thơng qua phương pháp phân tích phả hệ nghiên cứu Nguyễn Đăng Quyệt, Hutton, Lane, Sibert,…[16], [68], [79], [118] 4.3.6 Kết định lượng hoạt độ enzym CK Bảng 3.7 mô tả hoạt độ enzym CK 48 thành viên nữ 30 gia đình bệnh nhân có đột biến gen Nghiên cứu cho thấy 18 thành viên có hoạt độ CK tăng lần giới hạn trị số bình thường Trong có 14 người xác định có mang gen đột biến người không mang gen bệnh Như vậy, 21 người nữ dị hợp tử, 66,7% trường hợp có hoạt độ CK máu tăng cao Kết phù hợp với nghiên cứu Norman Sibert: khoảng 2/3 người nữ dị hợp tử bắt buộc có hoạt độ CK máu tăng cao [99], [118] Nghiên cứu Passor cho kết tương tự [102] Nghiên cứu cho thấy 28 thành viên nữ khơng mang gen bệnh, có thành viên có hoạt độ CK máu tăng cao, chiếm 14,8% Theo Hutton 1 Sibert, định lượng hoạt độ CK thật xác bệnh nhân khơng hoạt động thể lực vịng 48 trước lấy máu Khi bệnh nhân làm việc nặng, hoạt độ CK máu tăng cao [68], [118] Các thành viên nữ chủ yếu nơng dân, việc ngưng lao động vịng 48 khó kiểm sốt Hơn nữa, thành viên lấy máu Bệnh viện Nhi Trung Ương phần lớn gia đình họ xa Hà Nội, việc lại vất vả ảnh hưởng đến hoạt độ CK máu Ngoài ra, theo Meltzer, hoạt độ CK máu kiểm soát hệ thống di truyền độc lập Khi nghiên cứu quần thể người bình thường ơng nhận thấy, có gia đình có hoạt độ CK máu cao số gia đình lại có hoạt độ CK máu thấp [95] Vì vậy, nhà khoa học khuyến khích khơng sử dụng hoạt độ CK máu đơn để chẩn đoán người lành mang bệnh mà phải phối hợp với phân tích phả hệ phân tích gen [95], [123] Nghiên cứu Prior (2005) cho có đến 40-50% người nữ dị hợp tử có hoạt độ CK bình thường [107] Hiện nay, với phát triển sinh học phân tử, có nhiều kỹ thuật đại giúp chẩn đốn dị hợp tử phương pháp PCR định lượng, Southern blot, MLPA, FISH,… Do vậy, tác giả hạn chế sử dụng phương pháp định lượng hoạt độ CK máu để xác định người lành mang gen bệnh [66], [88] 4.4 Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD Việc phát người lành mang gen bệnh sở quan trọng để tiến hành chẩn đoán trước sinh nhằm tầm soát thai nhi mắc bệnh Hiện Việt Nam, phương thức lấy mẫu chẩn đoán trước sinh bệnh lý di truyền chủ yếu chọc hút dịch ối sinh thiết nhung mao màng nuôi Cả hai phương pháp lấy mẫu ảnh hưởng đến an toàn thai nhi 1 cho mẹ, gây biến chứng sẩy thai, rỉ ối, thai chết lưu,… [120], [123] Do vậy, vấn đề sàng lọc trước sinh nhà khoa học tiến hành Có ba yếu tố giúp sàng lọc thai phụ tham gia chẩn đoán trước sinh bệnh DMD phân tích phả hệ, định lượng hoạt độ enzym CK huyết mẹ xác định người mẹ dị hợp tử kỹ thuật SHPT [123] Trong yếu tố sàng lọc việc chẩn đốn xác định thai phụ có mang gen đột biến hay không yếu tố quan trọng Nếu người mẹ có kiểu gen dị hợp tử bắt buộc phải tiến hành lấy mẫu tế bào thai nhi để chẩn đoán di truyền cho dù nguy xảy tai biến xác định [122], [124] Ngược lại, thai phụ khơng mang gen phải khun gia đình khơng nên tiến hành chẩn đốn trước sinh theo phương pháp lấy mẫu xâm phạm thai Trong 21 người nữ chúng tơi phát có kiểu gen dị hợp tử, có hai thành viên tiếp tục mang thai, hai người mẹ bệnh nhân mã số 20 (đột biến đoạn gen từ exon 3-8) bệnh nhân mã số 39 (đột biến đoạn exon 46-50) Hai thai phụ tư vấn phải tiến hành chẩn đoán trước sinh Chọc hút dịch ối tiến hành vào tuần lễ thứ 14 (đối với mẹ bệnh nhân mã số 20) vào tuần lễ thứ 16 (cho mẹ bệnh nhân mã số 39) Sau đó, chúng tơi tiến hành ni cấy tế bào ối vịng tuần Ngồi mục đích làm tăng số lượng tế bào thai nhi thu thập được, nuôi cấy tế bào ối giúp loại bỏ tế bào máu mẹ lẫn vào mẫu bệnh phẩm thai nhi Sau thu hoạch tế bào nuôi cấy, tiến hành tách chiết DNA tế bào thai nhi theo phương pháp phenol/chloroform để tiến hành phân tích di truyền Đặc điểm di truyền bệnh DMD di truyền lặn liên kết NST giới tính X mà khơng có allen tương ứng NST Y Do vậy, người nam cần 1 nhận NST X bị bệnh từ người mẹ bị bệnh DMD Trong người nữ phải nhận hai NST X đột biến, từ bố từ mẹ biểu bệnh Tuy nhiên, bệnh nhân nam DMD thường tử vong trước tuổi lập gia đình, khả người nam truyền bệnh cho gái xảy Bởi vậy, lâm sàng thường gặp bệnh nhân DMD nam mà gặp bệnh trẻ em nữ Xác định giới tính thai nhi bước cần thực sau trình tách chiết DNA mẫu tế bào ối thai nhi Sử dụng cặp mồi cho phép khuếch đại đoạn gen xác định giới tính SRY nằm NST Y, trình tự nucleotid cặp mồi chọn tương tự nghiên cứu Hussey [67] Phản ứng PCR tiến hành với mẫu DNA thai nhi, kèm theo chứng nam, chứng nữ DNA bệnh nhân DMD (là anh trai thai nhi) Sản phẩm PCR điện di gel agarose nồng độ 1,5% Xác định giới tính thai nhi dựa vào xuất vạch điện di đặc hiệu có kích thước 254 bp, so sánh với mẫu đối chứng nam Mỗi mẫu DNA thai nhi, lặp lại phản ứng lần để tránh nhầm lẫn Với mẫu DNA thai nhi gia đình bệnh nhân mã số 20, kết điện di cho thấy xuất vạch có kích thước với vạch mẫu đối chứng nam anh trai bệnh nhân, kích thước đoạn DNA khoảng 254 bp Trong mẫu đối chứng âm (nước) đối chứng nữ không xuất vạch DNA tương ứng Điều chứng tỏ có diện NST Y tế bào thai nhi chúng tơi khẳng định giới tính thai nhi nam Theo tác giả, người mẹ dị hợp tử có khả truyền bệnh cho 50% trai họ [34] Như vậy, khả mắc bệnh DMD thai nhi gia đình mã số 20 cao, với tần suất 50% 1 Trên sở biết vị trí đột biến anh trai thai nhi người mẹ đoạn gen dystrophin từ exon 3-8, tiến hành phân tích đoạn gen dystrophin từ exon đến exon thai nhi phản ứng PCR Kết điện di hình 3.17 cho thấy, exon 2, vạch điện di xuất tất mẫu phân tích (trừ mẫu chứng âm) mẫu đối chứng dương, mẫu tế bào ối mẫu bệnh nhân Nhưng với cặp mồi khuếch đại exon 3, vạch DNA tương ứng xuất mẫu chứng dương mẫu DNA thai nhi mà không xuất bệnh nhân Điều phù hợp bệnh nhân bị đột biến đoạn exon nên không xuất vạch DNA tương ứng với exon Kết rằng, thai nhi không bị đột biến đoạn exon Tiến hành tương tự với exon từ đến đưa kết luận, thai nhi nam hồn tồn bình thường, khơng mang gen đột biến gia đình khuyên giữ thai Hiện nay, thai nhi tháng chắn sau sinh, em bé lấy máu, tách chiết DNA để khẳng định chẩn đoán Gia đình thứ hai tham gia chẩn đốn trước sinh gia đình bệnh nhân mã số 39 Sau tách DNA tế bào ối, tiến hành xác định giới tính thai nhi Kết điện di cho thấy: mẫu đối chứng nam mẫu bệnh nhân (anh trai thai nhi) xuất đoạn DNA có kích thước 254 bp Trong mẫu đối chứng nữ mẫu DNA thai nhi không xuất vạch tương ứng Kết chứng tỏ thai nhi nữ Khả thai nhi mắc bệnh bố thai nhi hồn tồn bình thường Tuy nhiên, theo thuyết Lyon, tượng DMD xuất trẻ em nữ NST X bình thường bé gái bị bất hoạt lúc này, NST mang gen bệnh lại hoạt động Mặt khác, số trẻ gái mắc hội chứng Turner, tồn NST X NST X mang gen dystrophin đột biến trẻ gái biểu bệnh [96] 1 Để khẳng định chắn thai nhi không bị bệnh, tiến hành phân tích gen dystrophin thai nhi Vì anh trai thai nhi có đột biến đoạn gen từ exon 46-50 nên tiến hành khuếch đại exon thai nhi để kiểm chứng Kết biểu hình 3.20, với cặp mồi khuếch đại exon 46, vạch DNA thu bệnh nhân có kích thước với đoạn DNA khuếch đại từ mẫu đối chứng dương Chứng tỏ bệnh nhân không bị đột biến exon 46 Phân tích tương tự exon khác đưa kết luận thai nhi không bị bệnh DMD Vấn đề cân nhắc đưa có nên phân tích gen để xác định xem thai nhi nữ mang gen bệnh hay không Theo chế di truyền, người phụ nữ mang gen có khả truyền gen bệnh cho 50% người họ, đến tuổi lập gia đình, tần suất truyền gen bệnh cộng đồng thai nhi nữ cao Một số nhà nghiên cứu cho rằng, xác định thai nhi nữ mang gen bệnh, cần tư vấn di truyền cho gia đình, thai phụ đơng có ý muốn hủy bỏ thai nên tiến hành phá bỏ thai nhi dị hợp tử để hạn chế khả lan truyền gen đột biến cho hệ sau Trong trường hợp nghiên cứu chúng tôi, lần mang thai thứ hai thai phụ, lần người mẹ sinh trai bị bệnh DMD Do thống đưa đến kết luận không tiến hành xác định khả dị hợp tử thai nhi, cho dù thai có mang gen bệnh khuyên thai phụ giữ thai, huỷ bỏ thai chắn để lại tâm lý không tốt cho thai phụ lẫn thành viên khác gia đình Hơn nữa, tương lai, kỹ thuật SHPT ngày hoàn thiện phát triển nên vấn đề phát người mẹ dị hợp tử, chẩn đốn trước sinh khơng cịn vấn đề khó khăn Như vậy, thai nhi nữ thật mang gen đột biến đến tuổi lập gia đình 1 tư vấn tiến hành chẩn đoán trước sinh chắn hạn chế việc sinh bị bệnh DMD Đối với trường hợp này, tư vấn thai phụ sau phải đưa em bé đến khám phân tích gen, trước em bé lập gia đình Các bệnh lý di truyền chiếm khoảng 20% trường hợp tử vong giai đoạn sơ sinh chiếm tỉ lệ cao bệnh lý gặp phải thời kỳ nhũ nhi trẻ nhỏ [40] Tần suất mức độ nặng bệnh lý di truyền đơn gen thay đổi tùy theo chủng tộc chiếm đến 2% tất trẻ sơ sinh [105] Theo thống kê Nguyễn Văn Đông, tỷ lệ thai dị tật bẩm sinh Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương ba năm 20012003 2,7% [3] Việc điều trị bệnh lý di truyền thách thức lớn y học Phần lớn bệnh nhân tử vong, để lại hậu nặng nề cho gia đình xã hội Hiện nay, nhờ tiến y học đặc biệt ngành SHPT, số bệnh lý di truyền điều trị khả quan Tuy nhiên, trước có phương pháp điều trị triệt để bệnh lý di truyền liệu pháp gen việc chẩn đốn trước sinh phòng bệnh phương pháp phá thai chủ động thai nhi mắc phải bệnh lý nặng nề lựa chọn nhiều người đồng thuận Chính lý mà tầm quan trọng cơng tác chẩn đốn trước sinh ngày nhấn mạnh Với phát triển nhanh chóng chun ngành sản khoa, nhi khoa, chẩn đốn hình ảnh đặc biệt di truyền phân tử chẩn đoán trước sinh phát triển mạnh mẽ nữa, đạt đồng thuận khoa học đạo đức học để hạn chế lưu hành bệnh lý di truyền, đặc biệt bệnh lý di truyền nặng nề 1 KẾT LUẬN Qua q trình nghiên cứu, chúng tơi đưa kết luận sau: Phát đột biến đoạn gen dystrophin - Sử dụng kỹ thuật xác định đột biến đoạn gen dystrophin mức độ mRNA, phát 20 bệnh nhân có đột biến đoạn, chiếm tỷ lệ 50% bệnh nhân DMD (n  40) - Về phân bố vị trí exon bị đột biến: 13 bệnh nhân đột biến đoạn vùng trung tâm (từ exon 43-60); chiếm tỷ lệ 65% (13/20 bệnh nhân), bệnh nhân đột biến xảy vùng tận 5’, 02 bệnh nhân bị đột biến kéo dài từ vùng tận 5’ đến vùng trung tâm đặc biệt, có 02 bệnh nhân (chiếm 10%) bị đột biến đoạn xảy vùng hotspot Phát người lành mang gen dystrophin bị đột biến - Bằng kỹ thuật multiplex PCR định lượng, phân tích gen dystrophin 48 thành viên nữ 30 gia đình bệnh nhân DMD bị đột biến đoạn gen, 21 thành viên nữ người lành mang gen bệnh phát hiện, chiếm tỷ lệ 43,8% - Trong 30 bà mẹ tham gia phân tích gen, phát 15 người mẹ có kiểu gen dị hợp tử, chiếm tỷ lệ 50% Như có 50% bệnh nhân DMD có đột biến phát sinh mà nhận gen bệnh di truyền từ người mẹ Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne Hai số 15 bà mẹ có kiểu gen dị hợp tử mang thai chẩn đoán trước sinh Bằng kỹ thuật sinh học phân tử cho thấy thai nhi gồm nam nữ, không mắc bệnh DMD Hai bà mẹ khuyên giữ thai ... phát người lành mang gen bệnh? ?? tiến hành với mục tiêu sau: Xác định đột biến đoạn gen bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne mức độ mRNA Chẩn đoán người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái dì) gia đình bệnh. .. DNA điện di agarose để xác định đột biến đoạn gen Mặt khác, 10 đoạn gen tạo dịng giải trình tự để phát dạng đột biến khó xác định gen dystrophin đột biến điểm, đột biến lặp đoạn Các tác giả Tay... việc phát đột biến xóa đoạn, Southern blot cho phép xác định đột biến lặp đoạn gen dystrophin Ở bệnh nhân đột biến đoạn, băng lai exon bị đột biến đoạn dị đặc hiệu khơng xuất phim Đối với bệnh