Luận án nghiên cứu xác định đột biến gen cyb11b1 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11 beta hydroxylase

1 MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) nhóm bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường khiếm khuyết phần hoàn toàn số enzyme tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol tuyến thượng thận Đặc điểm lâm sàng hoá sinh bệnh phụ thuộc vào khiếm khuyết enzyme đặc hiệu (Speiser cs, 2010) Những nghiên cứu bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh nhà giải phẫu học người Italy, Luigi Crecchio, đưa vào cuối kỉ XIX ông phát biểu nam hóa bệnh nhân nữ mà ông tiến hành phẫu thuật (Delle Piane cs, 2015) Những bệnh nhân khơng có đường cong nữ giới, có râu, bắp phát triển, âm vật bị biến đổi nhiên họ có âm đạo, tử cung, ống dẫn trứng buồng trứng bình thường Vào kỉ XX, nhiều nghiên cứu hormone tuyến thượng thận thể người tiến hành thuật ngữ “tăng sản thượng thận bẩm sinh” (Congenital Adrenal Hyperplasia CAH) đời để giảm mơ hồ bệnh nhấn mạnh biến đổi sinh lý bệnh gây Khoảng 90-95% trường hợp mắc TSTTBS thiếu hụt 21hydroxylase; 5-8% trường hợp TSTTBS bắt nguồn từ suy giảm 11βhydroxylase (Zachmann cs, 1983) Còn lại trường hợp TSTTBS suy giảm enzyme gặp khác 17- hydroxylase (17-OH), 3βhydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) 20/22 Desmolase Bệnh TSTTBS với dấu hiệu suy thượng thận cấp dẫn đến tử vong thể muối hay trẻ có biểu nam tính hố trẻ gái, giả dậy sớm trẻ trai gây ảnh hưởng nặng nề đến phát triển chiều cao, chức sinh dục, sinh sản tâm lý (Arlt Krone, 2007, Merke Bornstein, 2005, Ogilvie cs, 2006, White Speiser, 2000) TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase bệnh gặp di truyền lặn nhiễm sắc thể thường Bệnh thiếu hụt hồn tồn hoạt tính enzyme 11β-hydroxylase (CYP11B1) dẫn đến thiếu hụt hormone tuyến thượng thận Đặc điểm lâm sàng phổ biến hội chứng thiếu hụt 11β-hydroxylase bất thường phận sinh dục ngoài, tăng nhanh phát triển xương dẫn đến tình trạng lùn trẻ, dậy sớm ngoại biên, hạ kali máu tăng huyết áp Các xét nghiệm hoá sinh thường dựa mức độ tăng lên 11-deoxycortisol 11-deoxycorticosterol huyết kết hợp với gia tăng nồng độ adrogen thượng thận TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase có dấu hiệu đặc trưng nhiều thách thức vấn đề chẩn đoán điều trị Sự đa dạng kiểu hình, tỷ lệ phát thấp lý làm chậm chẩn đoán 11βhydroxylase Hiện nay, giới Việt Nam cịn nghiên cứu ảnh hưởng loại đột biến tới chức hoạt động 11βhydroxylase Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP11B1 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu hụt 11 beta hydroxylase” thực nhằm góp phần phát làm sáng tỏ nguyên nhân gây bệnh rối loạn chuyển hoá 11β-hydroxylase người Việt Nam Nghiên cứu giúp cho nhà nghiên cứu di truyền học giải thích chế gây bệnh bác sĩ lâm sàng điều trị bệnh hiệu quả, hướng để nâng cao chất lượng sống Hơn nữa, kết nghiên cứu ứng dụng phịng bệnh thơng qua thực hành tư vấn di truyền, sở cho chẩn đoán điều trị trước sinh có định Mục tiêu đề tài: Sàng lọc đột biến gen CYP11B1 bệnh nhân TSTTBS thiếu 11β-hydroxylase Nghiên cứu ảnh hưởng đột biến tới hoạt lực 11βhydroxylase tế bào động vật nuôi cấy Phân tích ảnh hưởng đột biến mơ hình cấu trúc chiều 11β-hydroxylase Nội dung nghiên cứu: Giải trình tự gen CYP11B1 bệnh nhân nghi ngờ mắc TSTTBS thể thiếu 11β-hydroxylase Chứng minh biểu 11β-hydroxylase tế bào động vật phương pháp Western blot Tách chiết hormone steroid, đánh giá hoạt tính 11β-hydroxylase Sử dụng phần mềm spdbv, ViewerLite, MAXent phân tích vị trí đột biến Những đóng góp luận án: Phát 06 đột biến gen CYP11B1 bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng TSTTBS thể thiếu 11β-hydroxylase có 05 đột biến p.R51K, p.E147D, p.N152K, IVS6+5G>T, p.Y395X Các đột biến p.R51K, p.E147D, p,N152K làm giảm hoạt tính 11βhydroxylase tương ứng 29%, 48% 36% Dự báo đột biến IVS6+5G>T có khả ảnh hưởng tới cấu trúc mRNA phần mềm MaxEnt 03 đột biến p.R51K, p.E147D, p.N152K có ảnh hưởng đến liên kết hydro với axit amin bên cạnh mô hình cấu trúc ba chiều 11βhydroxylase CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE 1.1.1 Tình hình nghiên cứu giới Năm 1951, nhà khoa học nhận thấy có số lượng bệnh nhân TSTTBS có dấu hiệu tăng huyết áp, có triệu chứng thiếu hụt aldosterone, tăng natri, hạ kali máu Các bệnh nhân sau phát có thiếu hụt 11- hydroxylase Đây dấu hiệu phân biệt bệnh nhân TSTTBS thiếu hụt 11- hydroxylase với bệnh nhân TSTTBS thiếu hụt 21 hydroxylase (Eberlein Bongiovanni, 1955, Shepard Clausen, 1951, Wilkins cs, 1952, Wilkins cs, 1951) Năm 1956, Eberlein Bongiovanni miêu tả tượng TSTTBS có kèm theo triệu chứng cao huyết áp (Eberlein Bongiovanni, 1955) Glenthoj cộng chẩn đoán bệnh nhân TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase mà trước đó, bệnh nhân chẩn đoán TSTTBS thiếu hụt 21hydroxylase (Glenthoj cs, 1979) Năm 1982, Rosler cộng báo cáo 26 bệnh nhân TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase 18 gia đình Do Thái từ Morocco, Tunis, Thổ Nhĩ Kỳ Iran Trong có gia đình kết cận huyết Các bệnh nhân có triệu chứng tăng huyết áp nặng Các bệnh nhân nữ có triệu chứng lâm sàng đa dạng, từ âm vật phì đại đến thể nam hố nặng 10/14 bệnh nhân nữ nuôi dưỡng giống trẻ trai việc chẩn đốn muộn giai đoạn dậy (Rosler cs, 1982) Triệu chứng tăng huyết áp dẫn đến tình trạng tử vong bệnh tim mạch xuất bệnh nhân nam hoá mức độ trung bình, thể nam hóa nặng có ngoại hình giống hồn tồn người nam bệnh nhân nữ đơi lại có huyết áp bình thường Sáu bệnh nhân có hạ kali máu Năm 1985, Hochberg cộng mô tả 15 trẻ gái trẻ trai có thiếu hụt 11β-hydroxylase Các bệnh nhân người Do thái di cư từ Morocco Iran Chiều cao cuối bệnh nhân bị ảnh hưởng nghiêm trọng Trẻ trai có tượng dậy sớm, phát triển tuyến vú Tất bệnh nhân nuôi dưỡng bé trai, có bệnh nhân có kết nhiễm sắc thể 46,XX (Hochberg cs, 1985) Năm 1992, Rosler cộng mô tả đặc điểm 38 bệnh nhân thiếu hụt 11β-hydroxylase từ 25 gia đình vịng 39 năm 19 gia đình đến từ Morocco, gia đình khác có bố mẹ đến từ Morocco (Rosler cs, 1992) Cũng năm 1992, Helmberg báo cáo ca bệnh trẻ trai tuổi người Thổ Nhĩ Kỳ, bố mẹ kết hôn cận huyết Bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase Bệnh nhân có tăng huyết áp, giả dậy sớm, chiều cao cân nặng 97 bách phân vị, nam hố hồn tồn (Prader type IV, lỗ đái thấp, phì đại âm vật) Bốn anh chị bệnh nhân tử vong sau đẻ (Helmberg cs, 1992) Năm 1995, Al-Jurayyan báo cáo 78 trẻ Ả rập mắc TSTTBS vịng 10 năm Trong số đó, có 20 (25,6%) bệnh nhân từ 11 gia đình có tiền sử mắc TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase Hiện tượng dậy sớm giả trẻ nam mức độ nam hoá trẻ gái dẫn đến bệnh nhân bị chẩn đốn nhầm giới tính (58,3%) trẻ sơ sinh thể muối trước điều trị (Al-Jurayyan, 1995) Năm 2000, Clark mô tả bệnh nhân mắc TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase thể không cổ điển (P A Clark, 2000) với tỷ lệ nam hoá bào thai cao huyết áp thấp so với thể cổ điển Bệnh nhân trẻ trai tuổi có triệu chứng dậy sớm ngoại biên Bệnh nhân có chiều cao trung bình so với tuổi có huyết áp giới hạn bình thường Bệnh nhân thứ trẻ gái tháng tuổi với triệu chứng âm vật phì đại khơng có bìu chẻ đơi Bệnh nhân có huyết áp bình thường so với tuổi có nồng độ 11-deoxycortisol tăng 1.1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Từ năm 2000, số tác giả ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để sàng lọc đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS tác giả Võ Kim Huệ, Thái Thiên Nam ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc đột biến 8bp bệnh nhân mắc TSTTBS Việt Nam thành viên gia đình bệnh nhân (Thái Thiên Nam, 2002, Võ Kim Huệ, 2000) Năm 2006, tác giả Trần Kiêm Hảo ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc số đột biến phổ biến bệnh nhân TSTTBS Bệnh viện Nhi trung ương (Trần Kiêm Hảo, 2006) Năm 2017, tác giả Vũ Chí Dũng cơng bố chẩn đốn phân loại thể thiếu enzyme đặc hiệu khác 715 bệnh nhân TSTTBS bao gồm 375 (52%) trẻ trai 340 (48%) trẻ gái bệnh viện Nhi trung ương (Bùi Phương Thảo Vũ Chí Dũng, Nguyễn Ngọc Khánh, Cấn Thị Bích Ngọc, 2015) Trong đó, thể thiếu 21-hydroxylase 703 (98,3%) bệnh nhân; thiếu 11β-hydroxylase (1,3%) bệnh nhân; thiếu 3β-hydsroxysteroid dehydrogenase type (0,4%) bệnh nhân Nghiên cứu cho thấy, số bệnh nhân mắc TSTTBS Việt Nam lớn Đa số bệnh nhân mắc bệnh TSTTBS thể thiếu 21-hydroxylase Tuy nhiên, cịn nghiên cứu TSTTBS thể gặp Gần đây, có số nghiên cứu TSTTBS thể gặp phương pháp sinh học phân tử phân tích ảnh hưởng đột biến Năm 2012, tác giả Lê Bắc Việt mô tả bệnh nhân mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase Bệnh nhân có đột biến dị hợp tử kép R43Q A386V (Lê Bắc Việt, 2012) Đột biến A386V đột biến làm thay đổi axit amin Alanine thành Valine Đột biến xảy vị trí axit amin thứ 386 không nằm vùng quan trọng Hai axit amin axit amin trung tính, khơng làm thay đổi liên kết hydro phân tử protein Vì thế, tác giả dự đốn rằng, đột biến khơng làm ảnh hưởng đến hoạt tính protein Những nghiên cứu sau tác giả biểu đột biến cho thấy, đột biến hoàn tồn khơng làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 11βhydroxylase Năm 2015, tác giả Vũ Chí Dũng cộng công bố bệnh nhân TSTTBS thể thiếu 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type khẳng định phân tích đột biến gen HSD3B2 phát bệnh nhân mang đột biến đồng hợp tử gen (Bùi Phương Thảo Vũ Chí Dũng, Nguyễn Ngọc Khánh, et al, 2015) Những nghiên cứu cần thiết cung cấp thơng tin tồn diện thể bệnh TSTTBS thiếu enzyme khác lưu hành Việt Nam 1.1.3 Dịch tễ học bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase Tỷ lệ mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase thống kê quần thể hạn chế Thông thường, tỷ lệ thiếu hụt 11β-hydroxylase chiếm khoảng 5-8% tổng số bệnh nhân mắc hội chứng TSTTBS (Merke Bornstein, 2005, White Speiser, 2000, Zachmann cs, 1983) Nghiên cứu Anh (Arlt cs, 2010) cho thấy có 3/203 bệnh nhân TSTTBS mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase (1,5%), bệnh nhân chiếm khoảng 3-5% thể cổ điển Tuy nhiên, nghiên cứu quốc gia Thuỵ Điển nghiên cứu 90% bệnh nhân TSTTBS, có 1/612 bệnh nhân TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase (0,2%) (Gidlof cs, 2013, Strandqvist cs, 2014) Sự khác biệt tỷ lệ cách chọn mẫu đặc trưng quần thể nghiên cứu Tần suất bệnh TSTTBS trẻ sơ sinh khoảng 1/200.000 (White cs, 1994) Tần suất bệnh TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase thay đổi từ 0,8-8% nghiên cứu phụ nữ mắc hội chứng rậm lông cường androgen (Azziz cs, 1991, Eldar-Geva cs, 1990) Tần suất trẻ mắc bệnh TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase cao tìm thấy Israel người Do Thái di cư từ Morocco Tần suất mắc bệnh nhóm người khoảng từ 1/5000-7000 trẻ đẻ sống tỷ lệ người mang gen từ 1,2-1,4% (Rosler cs, 1992, Rosler White, 1993) Bảng 1.1 Các thể bệnh TSTTBS thiếu hụt tổng hợp cortisol thiếu enzyme vỏ thượng thận Enzyme thiếu hụt Tỷ lệ mắc Gen/NST chủng tộc Triệu chứng lâm sàng 21-hydroxylase CYP21A2 Cổ điển 1:16000 (P450c21) 6p21.3 Thể khơng cổ điển Phì đại âm vật, suy thượng T/IVS6+5G>T CĐ-NHĐT CYP11-007 Trịnh Hữu T Nor/p.R43Q CĐ-NHĐT CYP11-008 Vũ Quỳnh P IVS6+5G>T/IVS6+5G>T CĐ-NHĐT CYP11-009 Trần Hải Đ Nor/p.R43Q CĐ-NHĐT CYP11-010 Nguyễn Thị B Nor/p.R51K CĐ-NHĐT CYP11-011 Nguyễn Kim Hoàng N p.R43Q/p.E147D-p.N152K CĐ-NHĐT CYP11-012 Nguyễn Thiên T Nor/p.R43Q CĐ-MM CYP11-013 Nguyễn Việt H Nor/p.R43Q CĐ-NHĐT CYP11-014 Đàm Hưng T p.R43Q/p.R43Q CĐ-MM CYP11-015 Nguyễn Tiến Đ Nor/p.R43Q CĐ-NHĐT Ghi chú: Nor: alen khơng phát đột biến; CĐ-NHĐT: Cổ điển-Nam hóa đơn thuần; CĐ-MM: Cổ điển-Mất muối; KCĐ: Không Cổ điển Hà Nội, ngày Cán hướng dẫn PGS TS Nguyễn Huy Hồng PGS.TS Nơng Văn Hải tháng năm 2018 Xác nhận bệnh viện PGS.TS Trần Minh Điển ... CYP11B1 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu hụt 11 beta hydroxylase? ?? thực nhằm góp phần phát làm sáng tỏ nguyên nhân gây bệnh rối loạn chuyển hoá 11? ? -hydroxylase người Việt Nam Nghiên cứu. .. truyền, sở cho chẩn đoán điều trị trước sinh có định Mục tiêu đề tài: Sàng lọc đột biến gen CYP11B1 bệnh nhân TSTTBS thiếu 11? ? -hydroxylase 3 Nghiên cứu ảnh hưởng đột biến tới hoạt lực 11? ?hydroxylase. .. bao gồm thiếu 21 -hydroxylase; thiếu 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type − Loại trừ bệnh nhân suy thượng thận bẩm sinh nguyên nhân khác giảm sản thượng thận bẩm sinh, suy thượng thận bẩm sinh suy