Mục tiêu của luận án là sàng lọc các đột biến trên gen CYP11B1 trên các bệnh nhân TSTTBS do thiếu 11β-hydroxylase. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới hoạt lực 11βhydroxylase trong tế bào động vật nuôi cấy. Phân tích sự ảnh hưởng của các đột biến mới trong mô hình cấu trúc 3 chiều của 11β-hydroxylase
VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Huy Hồng PGS.TS Nơng Văn Hải Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành chia sẻ tới bệnh nhân gia đình họ Đó người ngày đêm phải chống chọi với bệnh tật Họ động lực giúp tơi ln có khát khao giúp đỡ, sẻ chia phấn đấu nghiên cứu khoa học Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Huy Hồng PGS TS Nơng Văn Hải, người thầy hướng dẫn khoa học, tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm vô q báu để tơi hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ sinh học; ThS Bùi Thị Hải Hà - phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh học; Viện Nghiên cứu hệ gen, Phòng nghiên cứu hệ gen học chức năng- Viện Nghiên cứu hệ gen, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành nghiên cứu thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn tới GS Rita Bernhardt, mơn Hóa sinh, trường ĐHTH Saarlandes, CHLB Đức giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tơi tiến hành thí nghiệm Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc, phòng ban chức Bệnh viện Nhi trung ương, Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền Khoa Di truyền Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương, toàn thể đồng nghiệp khoa, nơi công tác, đồng hành chia sẻ, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS BS Vũ Chí Dũng, trưởng khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền TS BS Ngơ Diễm Ngọc, trưởng khoa Di truyền Sinh học phân tử giúp đỡ, tạo điều kiện chia sẻ kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận án i Tơi xin bày tỏ kính trọng, tình u thương vơ bờ bến bố mẹ, gia đình, Minh Anh bạn bè tơi, ủng hộ cổ vũ cho suốt thời gian học tập làm việc Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tình u thương sâu sắc tới chồng tôi, BS Đào Trung Dũng hai gái, Phương Linh-Minh Châu Tình yêu, chia sẻ, ủng hộ hy sinh thầm lặng họ chỗ dựa vững chắc, giúp tơi thêm nghị lực để hồn thành luận án Lời cuối cùng, xin dành tặng tới Người Người cho thấy ai, đường đi, để tơi thấy tơi ln có tình u thương vô điều kiện nhiệt huyết sống công việc Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nguyễn Thị Phương Mai ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Phương Mai iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU…………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… 1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……… 1.1.1 Tình hình nghiên cứu giới……………………… 1.1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam…………………… 1.1.3 Dịch tễ học bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase…………… 1.2 Định nghĩa, sở hóa sinh sinh lý bệnh học TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase………………………………… 12 1.2.1 Định nghĩa TSTTBS enzyme tham gia tổng hợp cortisol…………………………………………………… 12 1.2.2 Cơ sở hóa sinh bệnh TSTTBS……………………… 13 1.2.3 Sinh lý bệnh TSTTBS thiếu 11β-hydroxylase……… 15 1.3 Di truyền phân tử bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase…… 16 1.3.1 Gen CYP11B1………………………………………………… 16 1.3.2 11β-hydroxylase………………………………………… 18 1.4 Đặc điểm lâm sàng bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……… 22 1.4.1 Thể cổ điển……………………………………………… 22 1.4.2 Thể không cổ điển……………………………………… 26 1.4.3 Người mang gen/dị hợp tử……………………………… 27 1.4.4 Một số đặc điểm lâm sàng khác…………………… 27 1.5 Điều trị bệnh thiếu hụt 11 β hydroxylase…………………… 34 1.5.1 Liệu pháp thay glucocorticoid……………………… 34 1.5.2 Điều trị hạ huyết áp……………………………………… 35 1.5.3 Chẩn đoán điều trị trước sinh………………………… 35 1.6 Các phương pháp phân tích đột biến gen CYP11B1………… 36 1.6.1 Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1……………… 36 1.6.2 Phương pháp phân tích ảnh hưởng đột biến iv tới cấu trúc chức enzyme CYP11B1……… 37 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Đối tượng nghiên cứu………………………………………… 39 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân……………………………… 39 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ……………………………………… 40 2.2 Đạo đức nghiên cứu…………………………………… 40 2.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu……………………………… 41 2.3.1 Hóa chất nghiên cứu…………………………………… 41 2.3.2 Thiết bị nghiên cứu……………………………………… 41 2.4 Phương pháp nghiên cứu……………………………………… 43 2.4.1 Quy trình thu thập tách chiết mẫu nghiên cứu……… 45 2.4.2 Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1………………… 46 2.4.3 Phương pháp phân tích đột biến mới…………………… 47 2.4.4 Các phương pháp tin sinh học…………………………… 52 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………… 54 3.1 Kết xác định đột biến gen CYP11B1…………………… 54 3.1.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu………………… 54 3.1.2 Kết khuếch đại gen CYP11B1……………………… 54 3.1.3 Kết xác định đột biến gen CYP11B1………………… 56 3.1.4 Mối tương quan kiểu gen- kiểu hình đột biến mới… 58 3.1.5 Mối tương quan kiểu gen p.R43Q- kiểu hình…………… 68 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng đột biến gen CYP11B1 tới hoạt tính enzyme CYP11B1…………………… 73 3.2.1 Đột biến p.R51K………………………………………… 73 3.2.2 Đột biến p.E147D-p.N152K…………………………… 75 3.3 Phân tích ảnh hưởng đột biến gen CYP11B1 tới cấu trúc enzyme CYP11B1……………………………… 77 3.3.1 Kết mơ hình cấu trúc chiều enzyme CYP11B1 77 3.3.2 Ảnh hưởng đột biến tới cấu trúc enzyme CYP11B1………………………………………………… v 80 3.3.3 Đột biến vùng trượt gen IVS6+5G>T…………………… 83 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ……………………………… 84 4.1 Các đột biến phát gen CYP11B1 bệnh nhân nghiên cứu……………………………………………………… 84 4.2 Sự ảnh hưởng đột biến tới hoạt tính enzyme CYP11B1……………………………………………………… 88 4.2.1 Đột biến p.R51K………………………………………… 88 4.2.2 Đột biến p.E147D/p.N152K…………………………… 89 4.2.3 Đột biến Y395X………………………………………… 91 4.3 Sự ảnh hưởng đột biến tới cấu trúc enzyme CYP11B1……………………………………………………… 92 4.3.1 Đột biến thay axit amin……………………………… 93 4.3.2 Đột biến vùng trượt gen………………………………… 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………… 104 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN………………………… 106 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH……………………… 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………… 115 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách bệnh nhân nghiên cứu…………………… Phụ lục Mẫu bệnh án nghiên cứu………………………………… Phụ lục Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA tách từ máu ngoại vi bệnh nhân………………………… Phụ lục Kiểu gen kiểu hình bệnh nhân nghiên cứu…………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 11βOH 11β-hydroxylase, enzyme CYP11B1, 11-beta-hydroxylase 11βOHD 11β-hydroxylase deficiency Thiếu hụt 11β-hydroxylase 17-CS 17-cetosteroid 17-OH 17-hydroxyl 17-OHCS 17-hydroxycorticosteroid 17-OHP 17-hydroxyprogesterone 21OH 21-hydroxylase 21OHD 21-hydroxylase deficiency Thiếu hụt 21-hydroxylase 3D Dimension Ba chiều ACTH Adrenocorticotrophin hormone Hormone kích thích vỏ thượng thận AD Andreostenedione Cl Cloride CMO corticosterone methyloxidase CMO I Corticosterone CMO II 18-hydroxycorticosterone CRH corticotropin releasing hormone Hormone giải phóng corticotropin CVS chorionic villus sampling CYP Cytochrome P450 DHEA Dehydroepiandrosterone DHEAS DHEA sulfate DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium vii Gai rau DMSO Dimethysulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxy-NTPs DOC 11-Deoxycorticosterone E.Coli Escherichia coli EDTA Ethylenedinitrilotetraacetic acid F Cortisol FBS Fetal Bonvine serum ffDNA Fetal free-DNA DNA thai nhi lưu hành tự máu mẹ FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng GC-MS Gas chromatography-mass spectrometry HGMD Human gene mutations database Dữ liệu đột biến gene người Hc11B1 Human CYP11B1 Trình tự CYP11B1 người Hc11B2 Human CYP11B2 Trình tự CYP11B2 người HPTLC High performance thin layer Sắc ký lớp mỏng cao áp chromatography K Kali LDL Low-density lipoprotein LH Luteinizing hormone MaxENT Maximum entropy model MDD Maximum dependence Lipoprotein phân tử thấp decomposition model MM Salt wasting Mất muối Na Natri NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide viii ... NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE Chuyên ngành: Di... kiểu hình bệnh nhân nghiên cứu ………… 54 Hình 3.2 Sản phẩm PCR khuếch đại gen CYP11B1 55 Hình 3.3 Phân bố đột biến gen CYP11B1 nghiên cứu 56 Hình 3.4 Đột biến p.R51K bệnh nhân MS CYP11B1- 010………... IVS6+5G>T bệnh nhân MS CYP11B1- 006…… 63 Hình 3.9 Bệnh nhân MS CYP11B1- 006…………………………… 64 Hình 3.10 Đột biến IVS6+5G>T bệnh nhân MS CYP11B1- 008… 65 Hình 3 .11 Đột biến p.Y395X bệnh nhân MS CYP11B1- 004…………