MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một nhóm các bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường do sự khiếm khuyết một phần hoặc hoàn toàn của một trong số các enzyme tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở tuyến thượng thận. Đặc điểm lâm sàng và hoá sinh của bệnh phụ thuộc vào khiếm khuyết enzyme đặc hiệu (Speiser và cs, 2010). Những nghiên cứu đầu tiên về bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh được nhà giải phẫu học người Italy, Luigi Crecchio, đưa ra vào cuối thế kỉ XIX khi ông phát hiện ra những biểu hiện nam hóa ở những bệnh nhân nữ mà ông tiến hành phẫu thuật (Delle Piane và cs, 2015). Những bệnh nhân đó không có đường cong ở nữ giới, có râu, cơ bắp phát triển, âm vật bị biến đổi tuy nhiên họ vẫn có âm đạo, tử cung, ống dẫn trứng và buồng trứng bình thường. Vào giữa thế kỉ XX, nhiều nghiên cứu về hormone tuyến thượng thận trong cơ thể người đã được tiến hành và thuật ngữ “tăng sản thượng thận bẩm sinh” (Congenital Adrenal Hyperplasia - CAH) đã ra đời để giảm đi sự mơ hồ về bệnh này và nhấn mạnh những biến đổi sinh lý do bệnh gây ra. Khoảng 90-95% các trường hợp mắc TSTTBS là do thiếu hụt 21- hydroxylase; 5-8% trường hợp TSTTBS bắt nguồn từ sự suy giảm 11βhydroxylase (Zachmann và cs, 1983). Còn lại là các trường hợp TSTTBS do sự suy giảm các enzyme hiếm gặp khác như 17- hydroxylase (17-OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) và 20/22 Desmolase. Bệnh TSTTBS với các dấu hiệu suy thượng thận cấp có thể dẫn đến tử vong ở thể mất muối hay trẻ có các biểu hiện nam tính hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai gây ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển chiều cao, chức năng sinh dục, sinh sản và tâm lý (Arlt và Krone, 2007, Merke và Bornstein, 2005, Ogilvie và cs, 2006, White và Speiser, 2000).
VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2018 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU…………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… 1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……… 1.1.1 Tình hình nghiên cứu giới……………………… 1.1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam…………………… 1.1.3 Dịch tễ học bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase…………… 1.2 Định nghĩa, sở hóa sinh sinh lý bệnh học TSTTBS thiếu hụt 11β-hydroxylase………………………………… 12 1.2.1 Định nghĩa TSTTBS enzyme tham gia tổng hợp cortisol…………………………………………………… 12 1.2.2 Cơ sở hóa sinh bệnh TSTTBS……………………… 13 1.2.3 Sinh lý bệnh TSTTBS thiếu 11β-hydroxylase……… 15 1.3 Di truyền phân tử bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase…… 16 1.3.1 Gen CYP11B1………………………………………………… 16 1.3.2 11β-hydroxylase………………………………………… 18 1.4 Đặc điểm lâm sàng bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……… 22 1.4.1 Thể cổ điển……………………………………………… 22 1.4.2 Thể không cổ điển……………………………………… 26 1.4.3 Người mang gen/dị hợp tử……………………………… 27 1.4.4 Một số đặc điểm lâm sàng khác…………………… 27 1.5 Điều trị bệnh thiếu hụt 11 β hydroxylase…………………… 34 1.5.1 Liệu pháp thay glucocorticoid……………………… 34 1.5.2 Điều trị hạ huyết áp……………………………………… 35 1.5.3 Chẩn đoán điều trị trước sinh………………………… 35 1.6 Các phương pháp phân tích đột biến gen CYP11B1………… 36 1.6.1 Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1……………… 36 1.6.2 Phương pháp phân tích ảnh hưởng đột biến iv tới cấu trúc chức enzyme CYP11B1……… 37 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Đối tượng nghiên cứu………………………………………… 39 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân……………………………… 39 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ……………………………………… 40 2.2 Đạo đức nghiên cứu…………………………………… 40 2.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu……………………………… 41 2.3.1 Hóa chất nghiên cứu…………………………………… 41 2.3.2 Thiết bị nghiên cứu……………………………………… 41 2.4 Phương pháp nghiên cứu……………………………………… 43 2.4.1 Quy trình thu thập tách chiết mẫu nghiên cứu……… 45 2.4.2 Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1………………… 46 2.4.3 Phương pháp phân tích đột biến mới…………………… 47 2.4.4 Các phương pháp tin sinh học…………………………… 52 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………… 54 3.1 Kết xác định đột biến gen CYP11B1…………………… 54 3.1.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu………………… 54 3.1.2 Kết khuếch đại gen CYP11B1……………………… 54 3.1.3 Kết xác định đột biến gen CYP11B1………………… 56 3.1.4 Mối tương quan kiểu gen- kiểu hình đột biến mới… 58 3.1.5 Mối tương quan kiểu gen p.R43Q- kiểu hình…………… 68 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng đột biến gen CYP11B1 tới hoạt tính enzyme CYP11B1…………………… 73 3.2.1 Đột biến p.R51K………………………………………… 73 3.2.2 Đột biến p.E147D-p.N152K…………………………… 75 3.3 Phân tích ảnh hưởng đột biến gen CYP11B1 tới cấu trúc enzyme CYP11B1……………………………… 77 3.3.1 Kết mơ hình cấu trúc chiều enzyme CYP11B1 77 3.3.2 Ảnh hưởng đột biến tới cấu trúc enzyme CYP11B1………………………………………………… v 80 3.3.3 Đột biến vùng trượt gen IVS6+5G>T…………………… 83 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ……………………………… 84 4.1 Các đột biến phát gen CYP11B1 bệnh nhân nghiên cứu……………………………………………………… 84 4.2 Sự ảnh hưởng đột biến tới hoạt tính enzyme CYP11B1……………………………………………………… 88 4.2.1 Đột biến p.R51K………………………………………… 88 4.2.2 Đột biến p.E147D/p.N152K…………………………… 89 4.2.3 Đột biến Y395X………………………………………… 91 4.3 Sự ảnh hưởng đột biến tới cấu trúc enzyme CYP11B1……………………………………………………… 92 4.3.1 Đột biến thay axit amin……………………………… 93 4.3.2 Đột biến vùng trượt gen………………………………… 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………… 104 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN………………………… 106 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH……………………… 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………… 115 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách bệnh nhân nghiên cứu…………………… Phụ lục Mẫu bệnh án nghiên cứu………………………………… Phụ lục Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA tách từ máu ngoại vi bệnh nhân………………………… Phụ lục Kiểu gen kiểu hình bệnh nhân nghiên cứu…………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 11βOH 11β-hydroxylase, enzyme CYP11B1, 11-beta-hydroxylase 11βOHD 11β-hydroxylase deficiency Thiếu hụt 11β-hydroxylase 17-CS 17-cetosteroid 17-OH 17-hydroxyl 17-OHCS 17-hydroxycorticosteroid 17-OHP 17-hydroxyprogesterone 21OH 21-hydroxylase 21OHD 21-hydroxylase deficiency Thiếu hụt 21-hydroxylase 3D Dimension Ba chiều ACTH Adrenocorticotrophin hormone Hormone kích thích vỏ thượng thận AD Andreostenedione Cl Cloride CMO corticosterone methyloxidase CMO I Corticosterone CMO II 18-hydroxycorticosterone CRH corticotropin releasing hormone Hormone giải phóng corticotropin CVS chorionic villus sampling CYP Cytochrome P450 DHEA Dehydroepiandrosterone DHEAS DHEA sulfate DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium vii Gai rau DMSO Dimethysulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxy-NTPs DOC 11-Deoxycorticosterone E.Coli Escherichia coli EDTA Ethylenedinitrilotetraacetic acid F Cortisol FBS Fetal Bonvine serum ffDNA Fetal free-DNA DNA thai nhi lưu hành tự máu mẹ FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng GC-MS Gas chromatography-mass spectrometry HGMD Human gene mutations database Dữ liệu đột biến gene người Hc11B1 Human CYP11B1 Trình tự CYP11B1 người Hc11B2 Human CYP11B2 Trình tự CYP11B2 người HPTLC High performance thin layer Sắc ký lớp mỏng cao áp chromatography K Kali LDL Low-density lipoprotein LH Luteinizing hormone MaxENT Maximum entropy model MDD Maximum dependence Lipoprotein phân tử thấp decomposition model MM Salt wasting Mất muối Na Natri NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide viii phosphate NC Non-classic Thể không cổ điển NHĐT Simple virilization Nam hoá đơn Pc11B1 Pig CYP11B1 Trình tự CYP11B1 lợn POR P450 oxidoreductase PWM Position weight matrix Rc11B1 Rat CYP11B1 Trình tự CYP11B1 chuột Rc11B2 Rat CYP11B2 Trình tự CYP11B2 chuột RNA Ribonucleic acid S 11-deoxycortisol SCRs Structurally conserved regions SDS Sodium dodecylsulfate SRS Subtrate recognition site Vùng nhận biết chất StAR Steroidogenic acute regulatory Protein điều hòa sản xuất protein steroid cấp tính T Testosterone TART Testicular adrenal rest tumors Vùng bảo thủ U tinh hoàn xuất phát từ tế bào có nguồn gốc thượng thận Taq Thermus aquaticus TEMED N,N,N’,N’tetramethylethylenediaminel THS Tetrahydro-11-decortisol TSTTBS Congenital adrenal hyperplasia Tăng sản thượng thận bẩm (CAH) sinh WT Wild type ix DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các thể bệnh TSTTBS thiếu hụt tổng hợp cortisol thiếu enzyme vỏ thượng thận……………………………………… Bảng 1.2 Phân loại đột biến gen CYP11B1 dựa nghiên cứu in-vitro…………………………………………………… Bảng 1.3 19 Các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm hoá sinh đặc điểm di truyền bệnh liên quan tới thiếu hụt isozyme 11βhydroxylase…………………………………………………… 33 Bảng 2.1 Trình tự đoạn Oligonucleotides……………………………… 42 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch đệm RF1, RF2……………………… 48 Bảng 2.3 Thành phần gel tách/gel cô polyacrilamide………………… 50 Bảng 3.1 Kiểu đột biến gen CYP11B1 phát bệnh nhân nghiên cứu…………………………………………………… 56 Bảng 3.2 Kiểu gen- kiểu hình bệnh nhân có đột biến mới…… 57 Bảng 3.3 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-010………… 59 Bảng 3.4 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-011………… 62 Bảng 3.5 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-006 MS CYP11B1-008……………………………………………… 64 Bảng 3.6 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-004………… 67 Bảng 3.7 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-012………… 69 Bảng 3.8 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-005………… 71 Bảng 3.9 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1-002………… 73 Bảng 4.1 Một số đột biến thay amino acid gen CYP11B1 dẫn đến ảnh hưởng hoạt tính 11β-hydroxylase tế bào động vật………………………………………… 97 Bảng 4.2 Đột biến trượt gen phát gen CYP11B1… 98 Bảng 4.3 Chỉ số đánh giá trượt gen đột biến vùng splicing phát gen CYP11B1………………………… x 101 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Con đường tổng hợp hormone steroid từ cholesterol vỏ thượng thận…………………………………………… 14 Hình 1.2 Các phản ứng xúc tác enzyme CYP11B1……………… 15 Hình 1.3 Vị trí gen CYP11B1 gen CYP11B2 NST số 8……… 17 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu………………………………………… 44 Hình 2.2 Sơ đồ nhân đoạn gen CYP11B1…………………………… 46 Hình 2.3 Cấu trúc vector pSVL………………………………… 47 Hình 3.1 Phân loại kiểu hình bệnh nhân nghiên cứu…………… 54 Hình 3.2 Sản phẩm PCR khuếch đại gen CYP11B1… 55 Hình 3.3 Phân bố đột biến gen CYP11B1 nghiên cứu 56 Hình 3.4 Đột biến p.R51K bệnh nhân MS CYP11B1-010……… 58 Hình 3.5 Bệnh nhân MS.CYP11B1-010…………………………… 59 Hình 3.6 Đột biến p.E147D p.N152K bệnh nhân MS CYP11B1-011……………………………………………… 60 Hình 3.7 Bệnh nhân MS CYP11B1-011…………………………… 61 Hình 3.8 Đột biến IVS6+5G>T bệnh nhân MS CYP11B1-006…… 63 Hình 3.9 Bệnh nhân MS CYP11B1-006…………………………… 64 Hình 3.10 Đột biến IVS6+5G>T bệnh nhân MS CYP11B1-008… 65 Hình 3.11 Đột biến p.Y395X bệnh nhân MS CYP11B1-004………… 66 Hình 3.12 Bệnh nhân MS CYP11B1-004…………………………… 67 Hình 3.13 Kiểu hình bệnh nhân có đột biến dị hợp tử p.R43Q…… 68 Hình 3.14 Bệnh nhân MS CYP11B1-012…………………………… 70 Hình 3.15 Bệnh nhân MS CYP11B1-005…………………………… 71 Hình 3.16 Bệnh nhân MS CYP11B1-002…………………………… 72 Hình 3.17 Đột biến p.R51K biểu tế bào động vật COS-1… 74 xi Hình 3.18 Phân tích hoạt tính 11-hydroxylase có đột biến p.R51K tế bào động vật COS-1…………………………………… Hình 3.19 Đột biến p.E147D p.N125K biểu tế bào động vật COS-1………………………………………………… Hình 3.20 74 75 Phân tích hoạt tính 11β-hydroxylase có đột biến p.E147D p.N152K tế bào động vật COS-1…………… 76 Hình 3.21A So sánh trình tự axit amin CYP11B1 CYP11B2 người, bò, chuột, lợn chương trình CLUSTALW1 77 Hình 3.21B So sánh trình tự axit amin CYP11B1 CYP11B2 người, bò, chuột, lợn chương trình CLUSTALW1 78 Hình 3.21C So sánh trình tự axit amin CYP11B1 CYP11B2 người, bò, chuột, lợn chương trình CLUSTALW1 79 Hình 3.21D So sánh trình tự axit amin CYP11B1 CYP11B2 người, bò, chuột, lợn chương trình CLUSTALW1 80 Hình 3.22 Mơ hình cấu trúc 3D đột biến p.R51K………………… 81 Hình 3.23 Mơ hình cấu trúc 3D đột biến p.E147D……………… 82 Hình 3.24 Mơ hình cấu trúc 3D đột biến p.N152K……………… 83 Hình 4.1 Vị trí đột biến p.R43Q mơ hình protein CYP11B1…… 85 Hình 4.2 Vị trí đột biến gen CYP11B1 công bố giới…………………………………………………… Hình 4.3 Hình 4.4 86 Mơ hình cấu trúc khơng gian enzyme CYP11B1 vị trí đột biến phát nghiên cứu………… 94 Mơ hình cấu trúc 3D CYP11B1 người………………… 95 xii 136 CYP11B1 mutation with the phenotype of non-classical congenital adrenal hyperplasia in a consanguineous family Horm Res 4(67): 18993 141 Polat S, Kulle A, Karaca Z, Akkurt I, Kurtoglu S, Kelestimur F, Grotzinger J, Holterhus PM and Riepe F (2014) Characterisation of three novel CYP11B1 mutation in Classic and Non-Classic 11betahydroxylase deficiency Eur J Endocrinol 5(170): 697-706 142 Rainey WE (1999) Adrenal zonation: clues from 11beta-hydroxylase and aldosterone synthase Mol Cell Endocrinol 1-2(151): 151-60 143 Reisch N, Scherr M, Flade L, Bidlingmaier M, Schwarz HP, MullerLisse U, Reincke M, Quinkler M and Beuschlein F (2010) Total adrenal volume but not testicular adrenal rest tumor volume is associated with hormonal control in patients with 21-hydroxylase deficiency J Clin Endocrinol Metab 5(95): 2065-72 144 Reisch N., Högler W., Parajes S., Rose I.T., Dhir V., Götzinger J., Arlt W and N K (2013) A diagnosis not to be missed: Non-classic steroid 11β-hydroxylase deficiency presenting with premature adrenarche and hirsutism J Clin Endocrinol Metab 98(10):1620-1625 145 Riedl S, Nguyen HH, Clausmeyer S, Schulze E, Waldhauser F and Bernhardt R (2008) A homozygous L299P mutation in the CYP11B1 gene leads to complete virilization in 46,XX individuals with 11-betahydroxylase deficiency Horm Res 3(70): 145-9 146 Rosler A and Cohen H (1995) Absence of steroid biosynthetic defects in heterozygote individuals for classic 11 beta-hydroxylase deficiency due to a R448H mutation in the CYP11B1 gene J Clin Endocrinol Metab 12(80): 3771-3 137 147 Rosler A, Leiberman E and Cohen T (1992) High frequency of congenital adrenal hyperplasia (classic 11 beta-hydroxylase deficiency) among Jews from Morocco Am J Med Genet 6(42): 827-34 148 Rosler A, Leiberman E, Rosenmann A, Ben-Uzilio R and Weidenfeld J (1979) Prenatal diagnosis of 11beta-hydroxylase deficiency congenital adrenal hyperplasia J Clin Endocrinol Metab 4(49): 546-51 149 Rosler A, Leiberman E, Sack J, Landau H, Benderly A, Moses SW and Cohen T (1982) Clinical variability of congenital adrenal hyperplasia due to 11 beta-hydroxylase deficiency Horm Res 3(16): 133-41 150 Rosler A and White PC (1993) Mutations in human 11 beta-hydroxylase genes: 11 beta-hydroxylase deficiency in Jews of Morocco and corticosterone methyl-oxidase II deficiency in Jews of Iran J Steroid Biochem Mol Biol 1-3(45): 99-106 151 Roumen L., Sanders M P., Pieterse K., Hilbers P A., Plate R., Custers E., de Gooyer M, Smits J F., Beugels I., Emmen J., Ottenheijm H C., Leysen D and J HJ (2007) Construction of 3D models of the CYP11B family as a tool to predict ligand binding characteristics J Comput Aided Mol Des 8(21): 455-71 152 Russell AJ, Wallace AM, Forest MG, Donaldson MD, Edwards CR and Sutcliffe RG (1994) Mutation in the human gene for betahydroxysteroid dehydrogenase type II leading to male pseudohermaphroditism without salt loss J Mol Endocrinol 2(12): 22537 153 Sartorato P, Zulian E, Benedini S, Mariniello B, Schiavi F, Bilora F, Pozzan G, Greggio N, Pagnan A, Mantero F and Scaroni C (2007) Cardiovascular risk factors and ultrasound evaluation of intima-media thickness at common carotids, carotid bulbs, and femoral and abdominal 138 aorta arteries in patients with classic congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency J Clin Endocrinol Metab 3(92): 1015-8 154 Sathya A, Ganesan R and Kumar A (2012) Congenital adrenal hyperplasia masquerading as periodic paralysis in an adolescent girl Singapore Med J 7(53): 148-9 155 Schiffer L, Anderko S, Hannemann F, Eiden-Plach A and Bernhardt R (2015) The CYP11B subfamily J Steroid Biochem Mol Biol 1(151): 3851 156 Shammas C, Byrou S, Phelan MM, Toumba M, Stylianou C, Skordis N, Neocleous V and Phylactou LA (2016) Genetic screening of non-classic CAH females with hyperandrogenemia identifies a novel CYP11B1 gene mutation Hormones (Athens) 2(15): 235-42 157 Shepard TH and Clausen SW (1951) Case of adrenogenital syndrome with hypertension treated with cortisone Pediatrics 6(8): 805-11 158 Simm PJ and Zacharin MR (2007) Successful pregnancy in a patient with severe 11-beta-hydroxylase deficiency and novel mutations in CYP11B1 gene Horm Res 6(68): 294-7 159 Skinner CA, Rumsby G and Honour JW (1996) Single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis for the detection of mutations in the CYP11B1 gene J Clin Endocrinol Metab 6(81): 238993 160 Speiser PW, Azziz R, Baskin LS, Ghizzoni L, Hensle TW, Merke DP, Meyer-Bahlburg HF, Miller WL, Montori VM, Oberfield SE, Ritzen M and White PC (2010) Congenital adrenal hyperplasia due to steroid 21hydroxylase deficiency: an Endocrine Society clinical practice guideline J Clin Endocrinol Metab 9(95): 4133-60 139 161 Stikkelbroeck NM, Hermus AR, Suliman HM, Jager GJ and Otten BJ (2004) Asymptomatic testicular adrenal rest tumours in adolescent and adult males with congenital adrenal hyperplasia: basal and follow-up investigation after 2.6 years J Pediatr Endocrinol Metab 4(17): 645-53 162 Stikkelbroeck NM, Otten BJ, Pasic A, Jager GJ, Sweep CG, Noordam K and Hermus AR (2001) High prevalence of testicular adrenal rest tumors, impaired spermatogenesis, and Leydig cell failure in adolescent and adult males with congenital adrenal hyperplasia J Clin Endocrinol Metab 12(86): 5721-8 163 Strandqvist A, Falhammar H, Lichtenstein P, Hirschberg AL, Wedell A, Norrby C, Nordenskjold A, Frisen L and Nordenstrom A (2014) Suboptimal psychosocial outcomes in patients with congenital adrenal hyperplasia: epidemiological studies in a nonbiased national cohort in Sweden J Clin Endocrinol Metab 4(99): 1425-32 164 Thái Thiên Nam NTP, Võ Thương Lan (2002) Phát đột biến gene CYP21 tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzyme 21hydroxylase trẻ em gia đình trẻ bị bệnh viện Nhi Nhi Khoa 1(10): 500-505 165 Toaff ME, Toaff R and Chayen R (1975) Congenital adrenal hyperplasia caused by 11 beta-hydroxylase deficiency with onset of symptoms after one spontaneous pregnancy Am J Obstet Gynecol 2(121): 202-4 166 Touitou Y, Lecomte P, Auzeby A, Bogdan A and Besnier Y (1989) Evidence of 11 beta-hydroxylase deficiency in a patient with cortical adrenal adenoma Horm Metab Res 5(21): 272-4 167 Trần Kiêm Hảo NTP, Võ Thị Thương Lan cộng (2006) Ứng dụng kỹ thuật PCR phát số đột biến gene CYP21 gây bệnh tăng sản 140 thượng thận bẩm sinh thiếu 21-hydroxylase Nhi Khoa 1(14): 184188 168 Turcu AF and Auchus RJ (2015) The next 150 years of congenital adrenal hyperplasia J Steroid Biochem Mol Biol 1(153): 63-71 169 Ulmschneider S., Muller-Vieira U., Mitrenga M., Hartmann R W., Oberwinkler-Marchais S., Klein C D., Bureik M., Bernhardt R., Antes I and T L (2005) Synthesis and evaluation imidazolylmethylenetetrahydronaphthalenes of and imidazolylmethyleneindanes: potent inhibitors of aldosterone synthase J Med Chem 6(48): 1796-805 170 Vinson GP (2011) The mislabelling of deoxycorticosterone: making sense of corticosteroid structure and function J Endocrinol 1(211): 3-16 171 Võ Kim Huệ NTN, Nguyễn Thị Phượng cộng (2000) Nghiên cứu chẩn đoán bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-hydroxylase trẻ em Nhi Khoa 1(10): 285-293 172 Vũ Chí Dũng BPT, Nguyễn Ngọc Khánh, Cấn Thị Bích Ngọc (2015) Updated registry of congenital adrenal hyperplasia at the north pediatric referral centre of Vietnam Int J Ped Endocrinol 1(2015): 427-435 173 Vũ Chí Dũng BPT, Nguyễn Ngọc Khánh, et al (2015) Phenotype, genotype of congenital adrenal hyperplasia due to mutation in the type II 3-hydroxysteroid dehydrogenase gene: a report of two Vietnamese families Int J Ped Endocrinol 1(2015): 1-2 174 White P.C, Mornet E, Dupont J and A V (1989) Characterization of two genes encoding human steroid 11 beta-hydroxylase (P-450(11) beta) J Biol Chem 35(264): 20961-7 175 White PC (2001) Steroid 11 beta-hydroxylase deficiency and related disorders Endocrinol Metab Clin North Am 1(30): 61-79 141 176 White PC, Curnow KM and Pascoe L (1994) Disorders of steroid 11 beta-hydroxylase isozymes Endocr Rev 4(15): 421-38 177 White PC, Dupont J, New MI, Leiberman E, Hochberg Z and Rosler A (1991) A mutation in CYP11B1 (Arg-448 His) associated with steroid 11 beta-hydroxylase deficiency in Jews of Moroccan origin J Clin Invest 5(87): 1664-7 178 White PC, New MI and Dupont B (1987) Congenital adrenal hyperplasia (2) N Engl J Med 25(316): 1580-6 179 White PC and Speiser PW (2000) Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency Endocr Rev 3(21): 245-91 180 Wilkins L, Crigler JF, Jr., Silverman SH, Gardner LI and Migeon CJ (1952) Further studies on the treatment of congenital adrenal hyperplasia with cortisone III The control of hypertension with cortisone, with a discussion of variations in the type of congenital adrenal hyperplasia and report of a case with probable defect of carbohydrate-regulating hormones J Clin Endocrinol Metab 8(12): 1015-30 181 Wilkins L, Lewis RA, Klein R, Gardner LI, Crigler JF, Jr., Rosemberg E and Migeon CJ (1951) Treatment of congenital adrenal hyperplasia with cortisone J Clin Endocrinol Metab 1(11): 1-25 182 Willi U, Atares M, Prader A and Zachmann M (1991) Testicular adrenallike tissue (TALT) in congenital adrenal hyperplasia: detection by ultrasonography Pediatr Radiol 4(21): 284-7 183 Williams RM, Deeb A, Ong KK, Bich W, Murgatroyd PR, Hughes IA and Acerini CL (2010) Insulin sensitivity and body composition in children with classical and nonclassical congenital adrenal hyperplasia Clin Endocrinol (Oxf) 2(72): 155-60 142 184 Wu C, Zhou Q, Wan L, Ni L, Zheng C, Qian Y and Jin J (2011) Novel homozygous p.R454C mutation in the CYP11B1 gene leads to 11betahydroxylase deficiency in a Chinese patient Fertil Steril 3(95): 11223-6 185 Xu C, Qiao J, Liu W, Jiang X, Yan F, Wu J, Han B, Zhang H, Guan Q, Gao L and Zhao J (2012) Identification and functional characterization of a large deletion of the CYP11B1 gene causing an 11beta-Hydroxylase deficiency in a Chinese pedigree Horm Res Paediatr 4(78): 212-7 186 Yanagibashi K, Haniu M, Shively JE, Shen WH and Hall P (1986) The synthesis of aldosterone by the adrenal cortex Two zones (fasciculata and glomerulosa) possess one enzyme for 11 beta-, 18-hydroxylation, and aldehyde synthesis J Biol Chem 8(261): 3556-62 187 Yang L X., Toda K., Miyahara K., Nomoto S., Kinoshita E., Baba T., Yoshimoto M., Araki K., Kurashige T and Hashimoto K (1995) Classic steroid 11 beta-hydroxylase deficiency caused by a C >G transversion in exon of CYP11B1 Biochem Biophys Res Commun 2(216): 723-8 188 Yau M, Khattab A and New MI (2016) Prenatal Diagnosis of Congenital Adrenal Hyperplasia Endocrinol Metab Clin North Am 2(45): 267-81 189 Ye ZQ, Zhang MN, Zhang HJ, Jiang JJ, Li XY and Zhang KQ (2010) A novel missense mutation, GGC(Arg454) > TGC(Cys), of CYP11B1 gene identified in a Chinese family with steroid 11beta-hydroxylase deficiency Chin Med J (Engl) 10(123): 1264-8 190 Yeo G and Burge CB (2004) Maximum entropy modeling of short sequence motifs with applications to RNA splicing signals J Comput Biol 2-3(11): 377-94 143 191 Zachmann M and Prader A (1975) Letter: Gynecomastia with congenital virilizing adrenal hyperplasia (11beta-hydroxylase deficiency) J Pediatr 5(87): 839-40 192 Zachmann M, Tassinari D and Prader A (1983) Clinical and biochemical variability of congenital adrenal hyperplasia due to 11 beta-hydroxylase deficiency A study of 25 patients J Clin Endocrinol Metab 2(56): 2229 193 Zadik Z, Pertzelan A, Kaufman H, Levin S and Laron Z (1979) Gynaecomastia in two prepubertal boys with congenital adrenal hyperplasia due to 11-beta-hydroxylase deficiency Helv Paediatr Acta 2(34): 185-7 194 Zhang M, Liu Y, Sun S, Zhang H, Wang W, Ning G and Li X (2013) A prevalent and three novel mutations in CYP11B1 gene identified in Chinese patients with 11-beta hydroxylase deficiency J Steroid Biochem Mol Biol 133: 25-9 195 Zhu W, Chen Z, Li Q, Tan G and Hu G (2016) Inhibitors of 11betaHydroxylase (CYP11B1) for Treating Diseases Related to Excess Cortisol Curr Med Chem 6(23): 623-33 PHỤ LỤC 01 DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU STT MSBV Họ tên Năm sinh Giới tính CYP11B1-001 Trần Thị Minh N 2002 Nữ CYP11B1-001F Trần Công T 1973 Nam CYP11B1-001M Phùng Thị N 1977 Nữ CYP11B1-002 Khuất Thế A 1993 Nam CYP11B1-002F Khuất Văn V 1969 Nam CYP11B1-002M Đỗ Thị P 1969 Nữ CYP11B1-002YB Khuất Văn N 1996 Nam 040-75108 MS Lab 01-50826 120308545 CYP11B1-003 Lý Hải H 2010 Nữ 125ST- 181760 CYP11B1-004 Lê Văn T 1996 Nam 10 090-105638 CYP11B1-005 Phạm Ngọc A 1995 Nữ 11 040-88696 CYP11B1-006 Trần Quang H 1998 Nam 12 CYP11B1-006F Trần Trọng H 1972 Nam 13 CYP11B1-006M Trần Thị L 1975 Nữ 14 CYP11B1-006OB Trần Việt H 1995 Nam 15 130102666 CYP11B1-007 Trịnh Hữu T 2011 Nam 16 12205993 CYP11B1-008 Vũ Quỳnh P 2012 Nữ 17 CYP11B1-008F Vũ Anh T 1983 Nam 18 CYP11B1-008M Nguyễn Thị Hồng S 1984 Nữ CYP11B1-009 Trần Hải Đ 2006 Nam 20 CYP11B1-009F Trần Trọng Q 1968 Nam 21 CYP11B1-009M Đỗ Thị N 1968 Nữ 19 110283397 22 83ST-156324 CYP11B1-010 Nguyễn Thị B 1995 Nữ 23 11345550 CYP11B1-011 Nguyễn Kim Hoàng N 1991 Nam CYP11B1-011M Lê Thị H 1961 Nữ CYP11B1-012 Nguyễn Thiên T 2016 Nam CYP11B1-012F Nguyễn Thế D 1991 Nam 24 25 26 160462372 CYP11B1-012M Vũ Thị Kim T 1995 Nữ CYP11B1-013 Nguyễn Việt H 2014 Nam 29 CYP11B1-013F Nguyễn Thế H 1979 Nam 30 CYP11B1-013M Bùi Thanh L 1983 Nữ 27 28 160493319 31 110612488 CYP11B1-014 Đàm Hưng T 2011 Nam 32 159871321 CYP11B1-015 Nguyễn Tiến Đ 2012 Nam Chú thích: F: Bố; M: Mẹ; OB: Anh trai; YB: Em trai Hà Nội, ngày Cán hướng dẫn PGS TS Nguyễn Huy Hồng PGS.TS Nơng Văn Hải tháng năm 2018 Xác nhận bệnh viện PGS.TS Trần Minh Điển PHỤ LỤC MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU THÔNG TIN BỆNH NHÂN Mã số bệnh án: Nội trú………………………… Ngoại trú…………………… Họ tên bệnh nhân:…………………………………………………………… Ngày sinh………………………… Giới……………………………………… Địa chỉ:…………………………………………………………………………… Điện thoại liên hệ:………………………………………………………………… Tuổi chẩn đoán/Ngày vào viện:………………………………………………… Mã số lab:………………………………………………………………………… KHÁM LÂM SÀNG Tiền sử bệnh nhân: Cân nặng lúc sinh: Bộ phận sinh dục ngồi lúc sinh Nơn sau sinh: Khám toàn thân: Tăng trưởng nhanh: Mức độ nước: Xạm da: Giọng ồm: Trứng cá: Khám phận sinh dục ngồi: Lơng mu: Mức độ nam hố trẻ gái: Khám dương vật trẻ trai: XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG Nhiễm sắc thể: Phân tích gene CYP21A2: X quang tuổi xương: Chẩn đốn hình ảnh tuyến thượng thận: Chẩn đốn hình ảnh tiểu khung: Xét nghiệm Điện giải đồ nhập viện: Na (mmol/l) K (mmol/l) Cl (mmol/l) Xét nghiệm ACTH, LH, FSH, Steroid: Xét nghiệm Tuổi nghiệm xét Điều kiện ACTH Cortisol 17-OHP Testosterone Progesterone Androstenedione PHẢ HỆ VÀ TIỀN SỬ GIA ĐÌNH Tiền sử gia đình: Bố mẹ có quan hệ huyết thống khơng? Các anh chị em ruột có biểu sau khơng: Mơ hồ giới tính: Xạm da: Dậy sớm: Nơn, khơng tăng cân sau đẻ: Sau ACTH kích thích Sơ đồ phả hệ: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GENE CYP11B1 Allele Bệnh nhân Bố Mẹ Allele Ghi PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐO NỒNG ĐỘ VÀ ĐỘ TINH SẠCH CÁC MẪU DNA TÁCH TỪ MÁU NGOẠI VI CỦA CÁC BỆNH NHÂN Nồng độ DNA Độ tinh (ng/μl) (A260/280) CYP11-001 Trần Thị Minh N 35 1,8 CYP11-002 Khuất Thế A 42 1,9 CYP11-003 Lý Hải H 54 2,0 CYP11-004 Lê Văn T 36 1,8 CYP11-005 Phạm Ngọc A 72 1,9 CYP11-006 Trần Quang H 43 1,8 CYP11-007 Trịnh Hữu T 61 1,7 CYP11-008 Vũ Quỳnh P 25 1,9 CYP11-009 Trần Hải Đ 39 1,8 CYP11-010 Nguyễn Thị B 47 2,1 CYP11-011 Nguyễn Kim Hoàng N 56 2,0 CYP11-012 Nguyễn Thiên T 46 1,8 CYP11-013 Nguyễn Việt H 35 1,9 CYP11-014 Đàm Hưng T 25 1,8 CYP11-015 Nguyễn Tiến Đ 45 1,9 Mã số BN Họ tên BN PHỤ LỤC KIỂU GEN VÀ KIỂU HÌNH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU BN Họ tên BN Kiểu gen Kiểu hình CYP11-001 Trần Thị Minh N Nor/p.R43Q CĐ-NHĐT CYP11-002 Khuất Thế A p.R43Q/p.R43Q CĐ-NHĐT CYP11-003 Lý Hải H Nor/p.R43Q KCĐ CYP11-004 Lê Văn T p.Y395X/p.Y395X CĐ-NHĐT CYP11-005 Phạm Ngọc A Nor/p.R43Q CĐ-NHĐT CYP11-006 Trần Quang H IVS6+5G>T/IVS6+5G>T CĐ-NHĐT CYP11-007 Trịnh Hữu T Nor/p.R43Q CĐ-NHĐT CYP11-008 Vũ Quỳnh P IVS6+5G>T/IVS6+5G>T CĐ-NHĐT CYP11-009 Trần Hải Đ Nor/p.R43Q CĐ-NHĐT CYP11-010 Nguyễn Thị B Nor/p.R51K CĐ-NHĐT CYP11-011 Nguyễn Kim Hoàng N p.R43Q/p.E147D-p.N152K CĐ-NHĐT CYP11-012 Nguyễn Thiên T Nor/p.R43Q CĐ-MM CYP11-013 Nguyễn Việt H Nor/p.R43Q CĐ-NHĐT CYP11-014 Đàm Hưng T p.R43Q/p.R43Q CĐ-MM CYP11-015 Nguyễn Tiến Đ Nor/p.R43Q CĐ-NHĐT Ghi chú: Nor: alen không phát đột biến; CĐ-NHĐT: Cổ điển-Nam hóa đơn thuần; CĐ-MM: Cổ điển-Mất muối; KCĐ: Khơng Cổ điển Hà Nội, ngày Cán hướng dẫn PGS TS Nguyễn Huy Hồng PGS.TS Nơng Văn Hải tháng năm 2018 Xác nhận bệnh viện PGS.TS Trần Minh Điển ... Nam nghiên cứu ảnh hưởng loại đột biến tới chức hoạt động 11βhydroxylase Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP11B1 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu. .. kiểu hình bệnh nhân nghiên cứu ………… 54 Hình 3.2 Sản phẩm PCR khuếch đại gen CYP11B1 55 Hình 3.3 Phân bố đột biến gen CYP11B1 nghiên cứu 56 Hình 3.4 Đột biến p.R51K bệnh nhân MS CYP11B1- 010………... 3.1 Kiểu đột biến gen CYP11B1 phát bệnh nhân nghiên cứu ………………………………………………… 56 Bảng 3.2 Kiểu gen- kiểu hình bệnh nhân có đột biến mới…… 57 Bảng 3.3 Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS CYP11B1- 010…………