Mục tiêu: Phân tích kiểu gen bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase thể mất muối nặng và các thành viên gia đình bằng phương pháp giải trình tự gen và MLPA. Đối tượng và phương pháp: Phân tích đột biến gen CYP21A2 cho 27 bệnh nhân và 60 thành viên gia đình bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối nặng bằng phương pháp giải trình tự gen và MLPA. Lập phả hệ cho từng gia đình.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐẶC ĐIỂM KIỂU GEN CYP21A2 CỦA GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH THỂ THIẾU 21-HYDROXYLASE THỂ MẤT MUỐI NẶNG Ngô Thị Thu Hương1, Nguyễn Phú Đạt1, Trần Huy Thịnh1, Vũ Chí Dũng1,2, Trần Vân Khánh1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu hụt enzym 21-hydroxylase bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đột biến gen CYP21A2 Mục tiêu: Phân tích kiểu gen bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase thể muối nặng thành viên gia đình phương pháp giải trình tự gen MLPA Đối tượng phương pháp: Phân tích đột biến gen CYP21A2 cho 27 bệnh nhân 60 thành viên gia đình bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể muối nặng phương pháp giải trình tự gen MLPA Lập phả hệ cho gia đình Kết quả: 100% bệnh nhân tìm thấy đột biến, loại đột biến phát hiện, đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao 61,1%, đột biến R356W chiếm tỷ lệ cao 40,7%, IVS2 - 13A/C > G chiếm 9,3%, Q318X chiếm 7,4% S125X chiếm 3,7%; Đột biến đoạn chiếm tỉ lệ 38,9% 96,7% (58/60) thành viên gia đình mang gen đột biến dị hợp tử 100% phả hệ hệ bị mắc bệnh, khơng có gia đình có hai bị bệnh Từ khóa: Tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến gen CYP21A2, thể muối khác giới tỷ lệ chung người mang I ĐẶT VẤN ĐỀ gen dị hợp tử 1/55 [4; 5] Trong xã hội, phần Tăng sản thượng thận bẩm sinh lớn bố mẹ người lành mang gen bệnh (congenital adrenal hyperplasia) thể thiếu khả sinh bị bệnh 25%, 50% enzym 21-OH bệnh lý di truyền đột biến người lành mang gen bệnh Đến nay, có gen lặn nằm nhiễm sắc thể số 6, bệnh 100 đột biến công bố gây bệnh gây nên rối loạn trình sinh tổng hợp gen CYP21A2 thường gặp đột biến hormon vỏ thượng thận gây bệnh cảnh lâm đoạn, chuyển đoạn, nhân đoạn, đột biến điểm sàng suy thượng thận cấp nam hóa đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao [2] trẻ gái, dậy sớm giả trẻ trai [1; 2] Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu Theo nghiên cứu Lee cộng có bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, ước tính tỷ lệ người mang gen bệnh tăng sản nghiên cứu gen công bố thượng thận bẩm sinh thể dị hợp tử 11,2- năm gần Tăng sản thượng 12,6%/1.000 hay tỷ lệ 1/83 quần thể thận bẩm sinh thể muối nặng, không người Trung Quốc [3] Trong báo cáo chẩn đoán sớm điều trị kịp thời làm tăng nguy tử vong trẻ di chứng Địa liên hệ: Ngô Thị Thu Hương, Bộ môn Nhi, Trường Đại học Y Hà Nội bại não sau Nhờ phát triển kỹ thuật khoa học nên phương pháp PCR, MLPA Email: thuhuong0380@gmail.com giúp phát đột biến đoạn Ngày nhận: 26/7/2018 giải trình tự gen để phát đột biến điểm Ngày chấp thuận: 30/8/2018 giúp cho việc phát sớm bệnh để điều trị TCNCYH 115 (6) - 2018 45 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC cho bệnh nhân, với thành viên gia đình vi theo quy trình phenol/chloroform Các mẫu kết chứng y học để tư vấn di DNA tiến hành đo nồng độ độ tinh truyền chẩn đoán trước sinh cho gia máy Nano- Drop, mẫu DNA đình họ mang thai giúp cho điều trị đạt chuẩn OD280/OD260 ≥ 1,8 sử dụng quản lý bệnh đạt hiệu cao, tránh tử vong để phân tích gen cho trẻ giảm tỷ lệ mắc bệnh cộng Kỹ thuật PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu đồng Xuất phát từ thực tiễn trên, nghiên cứu cho gen CYP21A2 cho vị trí đột biến được thực với mục tiêu: Phân tích kiểu xác định trước từ bệnh nhân bị bệnh tăng sản gen CYP21A2 thành viên gia đình thượng thận bẩm sinh gia đình, để bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh khuếch đại vị trí đột biến Chu trình nhiệt phản thể thiếu 21-hydroxylase thể muối nặng ứng PCR: 90o - 10 giây, [58o - 10 giây, 55o - phương pháp giải trình tự gen MLPA 15 giây, 72o - phút] x 30 chu kỳ II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Kỹ thuật MLPA: Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) sàng lọc 06 đột biến Đối tượng: gồm 27 gia đình thường gặp: P30L (Exon 1), đoạn 8bp 27 bệnh nhân bị tăng sản thượng thận (Exon 3), I172N (Exon 4), exon Cluster bẩm sinh thể muối nặng điều trị nội (Exon 6), Q318 (Exon 8), toàn gene ngoại trú Khoa Nội tiết - Chuyển hóa- Di CYP21A2, đoạn 30Kb (Exon hybrid) truyền Bệnh viện Nhi Trung ương Probe hỗn hợp P050 - B2 bao gồm probe 60 thành viên gia đình gồm 27 người bố, 27 người mẹ anh, chị, em ruột bệnh nhân cho exon 1, 3, 4, gene CYP21A2, tương đương với đột biến đoạn 8bp, I172, E6 cluster Q318 Sản phẩm khuếch đại probe, điện di mao quản huỳnh Tiêu chuẩn chẩn đoán quang máy giải trình tự để phân tích kết Bệnh nhân có biểu muối, nước mạn tính, xạm da, Biểu mơ hồ giới Kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing): tính sau sinh trẻ gái dậy sớm trẻ Sản phẩm PCR tinh giải trai Điện giải đồ máu có rối loạn: Na+ giảm trình tự máy ABI -3100 Trung tâm K+ tăng; Nồng độ 17 - OH tăng 10.000 nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y ng/dl Testosterone tăng > 1ng/ml Hà Nội Kết phân tích phần Phương pháp Lập phả hệ cho gia đình: Phỏng mềm CLC Đạo đức nghiên cứu vấn để lập phả hệ cho gia đình Sử dụng Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo ký hiệu vẽ phả hệ theo qui định quốc tế đức nghiên cứu Y học Bệnh nhân gia đình hội nghị di truyền người lần thứ 19 bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào Tách chiết DNA: Mỗi thành viên lấy nghiên cứu có quyền rút lui khỏi nghiên 2ml máu ngoại vi chống đông EDTA; cứu không đồng ý tiếp tục tham gia Bệnh DNA chiết tách từ bạch cầu lympho máu ngoại nhân gia đình thông báo kết 46 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC xét nghiệm gen tư vấn di truyền Các enzym 21 - OH thể muối nặng thể thông tin cá nhân, kết chẩn đốn hồn bảng sau tồn đảm bảo bí mật Kết phân tích gen bảng cho thấy dạng đột biến R356W có tỷ lệ cao 40,7%, III KẾT QUẢ IVS2 - 13A/C > G tỷ lệ: 9,3%, đột biến đoạn Phân tích kết kiểu gen 27 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu lớn tỷ lệ: 38,9% Có bệnh nhân mang gen dị hợp tử alen Q318X R356W Bảng Kiểu gen đột biến phát nhóm bệnh nhân Số lượng alen mang đột biến Exon/ intron Các dạng đột biến Đồng hợp tử (n) Dị hợp tử (n) % alen đột biến 2(4) (1) (9,3) Intron IVS2 - 13A/C > G Ex8 R356W (18) (4) 22 (40,7) Ex8 Q318X 3*(4) 4(7,4) Ex3 S125X 1(2) 2(3,7) - Xóa đoạn lớn 10 (20) 1(1) 21 (38,9) Tổng số đột biến 22(44) 9(10) 56/54 alen đột biến (100%) Tổng số bệnh nhân 27 (54) *: Hai đột biến dị hợp tử alen Bảng Kiểu gen đột biến phát nhóm thành viên gia đình bệnh nhân Thành viên gia đình Mang gen Khơng mang gen Tổng số Bố 27 27 Mẹ 27 27 Anh trai Chị gái 1 Em gái 1 Tổng số 58 60 Trong nghiên cứu này, 60 thành viên gia đình người hồn tồn bình thường lâm sàng xét nghiệm tìm đột biến gen, có 58/60 (96,7%) thành viên phát có mang gen đột biến; 2/60 (3,3%) thành viên không mang gen đột biến TCNCYH 115 (6) - 2018 47 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Các dạng đột biến thành viên gia đình bệnh nhân Điểm đột biến Bố Mẹ Chị gái IVS2 - 13A/C > G R356W 12 11 Q318X S125X Em gái Anh trai Tổng số 0 1 25 0 1 0 Mất đoạn 10 11 1 23 Tổng 28 28 1 60 Nghiên cứu phát loại đột biến 58 thành viên gia đình bệnh nhân Trong đột biến điểm chiếm 37/60 (61,7%), đột biến đoạn chiếm 38,3% người bố người mẹ mang đột biến dị hợp tử R356W Q318X alen Trong số loại đột biến, đột biến R356W có tỷ lệ cao 25/60 (41,7%) thành viên có đột biến Bảng Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân Đặc điểm Nam Nữ Tổng Xạm da Cơn suy thượng thận cấp 0 Dậy sớm Hội chứng cường androgen 2 Âm vật phì đại ( sau phẫu thuật) 1 Gia đình có bị bệnh 0 27 Gia đình có bị bệnh 0 Thăm khám phân tích phả hệ 27 gia đình có bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể muối, 100% gia đình có bị bệnh hệ, khơng có gia đình có bị bệnh Tất 27 bệnh nhân khám theo dõi ngoại trú; trường hợp xạm da, dậy sớm điều trị, trẻ nữ có dấu hiệu cường androgen, trẻ có dấu hiệu phì đại nhẹ âm vật, khơng có trẻ bị suy thượng thận cấp 48 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC c.656A/C IVS2 - 13A/C > G Mẹ bệnh nhân II4 c.656A/C c.IVS2 - 13A/C > G Mẹ bệnh nhân III4 c.1996C > T P.Q138X Bố bệnh nhân II3 c.1996C > T P.Q138X Bố bệnh nhân III4 c.2110C > T p.R356W Bố bệnh nhân II3 c.2110C > T p.R356W Bố bệnh nhân III4 Hình Phả hệ kiểu gen gia đình mang đột biến dị hợp tử kép IVS2 - 13A/C > G/Q318X&R356W Phân tích phả hệ hệ 2, không mắc bệnh giống bệnh nhân Ở hệ thứ gia đình có hai gái đầu bị thời kỳ sơ sinh, trai tuổi bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể muối với kiểu gen I2g đột biến alen p.Q138X & R356W Bố mẹ chị gái (III.3) có kiểu hình bình thường Phân tích gen cho gia đình: đột biến I2g, p.Q318X&p.R356W Bố mang đột biến dị hợp tử kép p.Q318X p.R356W mẹ mang gen dị hợp tử I2g Bệnh nhân nhận alen p.Q318X p.R356W từ bố alen I2g từ mẹ TCNCYH 115 (6) - 2018 49 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC IV BÀN LUẬN Phân tích gen kỹ thuật MLPA giải trình tự gen cho 27 bệnh nhân chẩn đốn tăng sản thượng thận bẩm sinh thể muối nặng khám điều trị ngoại trú Phân tích phả hệ 27 gia đình mang gen đột biến CYP21A2, nhận thấy 100% bố, mẹ mang gen dị hợp tử Có anh, chị, em, bệnh nhân phân tích gen có trường hợp mang gen dị hợp tử, có ca khoa Nội tiết- Di truyền- Chuyển hóa Bệnh khơng mang gen bệnh Có gia đình, có bố, mẹ mang gen dị hợp tử kép Q318X viện Nhi Trung ương, chúng tơi nhận thấy R356W Trong gia đình có bố mang dị dạng đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao 61,1%, hợp tử kép Q318X R356W, mẹ mang gen I2g, bệnh nhân bị tăng sản thượng thận bẩm kiểu gen hay gặp R356W có tỷ lệ 40,7%, đột biến đoạn chiếm tỷ lệ cao 38,9% Đột biến gen CYP21A2 nghiên cứu sinh thể nặng Bệnh nhân có người chị gái thời kỳ sơ sinh không rõ chẩn có 150 đột biến khác đoán, chị gái lớn lấy chồng xa Bệnh nhân có nhiều lần vào viện cấp cứu báo cáo [2; 5] Tăng sản thượng thận suy thượng thận cấp nguy hiểm đến tính mạng bẩm sinh thể muối nặng 100% Trong nghiên cứu Ai Cập dạng đột biến exon R356W, Q318X, (2018), phân tích kiểu gen kiểu hình cho exon S125X, vị trí intron 2, 14 bệnh nhân gia đình có người bị bệnh đoạn lớn làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu gen CYP21A2 dẫn đến không tổng hợp enzym 21 - OH nhận thấy tỷ lệ dạng đột enzym 21 - OH Kết nghiên cứu biến điểm chiếm tỷ lệ cao, phân tích chúng tơi nhóm bệnh nhân tăng sản ca lâm sàng có nhiều trường hợp kiểu thượng thận bẩm sinh thể muối nặng nên gen kiểu hình khơng tương xứng với tỷ lệ đột biến đoạn có tăng cao Nghiên cứu rõ kiểu gen IVS2 - 13/A/C > G nghiên cứu khác dạng đột biến có kiều hình muối nam hóa phức tạp 100% gây thể muối Trong đó, tỷ đơn thuần, kiểu gen Q318X đồng hợp tử lệ gặp đột biến nước Iraq 19,3%, ln có kiểu hình muối, vài Châu Á, Trung Quốc (20%), Nhật Bản trường hợp dị hợp tử kép lại có kiểu hình (18%) [2; 7; 8] Tăng sản thượng thận bẩm nam hóa đơn [9] Kiểu gen kiểu hình sinh thể muối thể nặng bệnh, bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm có nguy tử vong suy thượng thận sinh có nhiều nghiên cứu báo cấp, 27 bệnh nhân nghiên cứu cáo, để bổ sung vào liệu di truyền giúp cho chúng tơi, khơng có bệnh nhân tái khám bị suy bác sĩ tư vấn chẩn đốn trước sinh thượng thận, có trường hợp quản lý bệnh nhân Đây bước tiền đề để điều trị dậy sớm khoa, trường hợp chúng tơi chẩn đốn trước sinh cho mẹ, dấu hiệu xạm da, trường hợp nữ chị, em gái bệnh nhân mang thai, để dấu hiệu cường androgen kèm bệnh nhân tránh sinh đứa trẻ bị bệnh có kế phì đại nhẹ âm vật, bệnh nhân xa, không hoạch điều trị sớm cho bệnh nhân tuân thủ tái khám hẹn điều trị thuốc chẩn đoán sớm từ thời kỳ bào thai [10; 11] với liều chưa Trong số 27 gia đình tiến rộng rãi nhiều nước giới, 50 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC hành chẩn đốn trước sinh cho thai phụ nal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency) in có kết bước đầu phát thai nhi a Middle European population The journal of mang gen dị hợp tử clinical Endocrinology & Metabolism, 90(2), 775 - 778 Phát đột biến gen CYP21A2 bệnh nhân thành viên gia đình có giá trị cao giúp bác sĩ chẩn đoán trước sinh cho thai nhi từ tháng đầu mang thai để điều trị sớm tư vấn tiền hôn nhân, cung cấp liệu cho trung tâm di truyền để quản lý người mang gen làm giảm tỷ lệ mắc bệnh cho Anastasovska.V., Kocova M (2010) Detected heterozygouts during the molecular analysis of the common CYP21A2 point mutations in Macedonian patients with congenital adrenal hyperplasia and their relatives Sec, Biol.Med.Sci, MASA, XXXI, 2, 71 - 82 cộng đồng Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử Nhà xuất Y IV KẾT LUẬN học, 28 - 32 Sử dụng kỹ thuật PCR, MLPA giải trình tự gen phát 96,7 % người lành mang gen bệnh thành viên gia đình bệnh nhân Trong số đột biến điểm đột biến R356W chiếm tỉ lệ cao với 40,7%, đột biến Q318X chiếm 9,3% IVS2 - 13A/C > G chiếm 7,4% Đột biến đoạn chiếm 38,9% dạng đột biến biểu kiểu hình thể muối nặng cho bệnh nhân TÀI LIỆU THAM KHẢO Saroj N, New M I (2011) Congenital adrenal hyperplasia due to 21 – hydroxylase deficiency Annals of the new york academy of sciences, 1192, - 11 White P.C, Speiser.P.W (2000) Congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency Endocrine reviews, 21 (3), 245 - 291 Lee H H (2004) The chimeric CYP21P/ CYP21 gene and 21-hydroxylase deficiency Ruqayah G Y.A, Bassam M S.A (2016) Molecular analysis of CYP21A2 gene mutations among Iraqi patients with congenital adrenal Hindawi Publishing Corporation Enzyme Research, 4, 117 - 124 Angel.O.K Chan, But.M.W (2011) Molecular analysis of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency in Hong Kong Chinese patients Steroids, 76, 1057 - 1062 Fatma E, Sahar S, Mona H et al (2018) CYP21A2 genetic profile in 14 Egyptian children with suspected congenital adrenal hyperplasia: a diagnostic challenge Annals of the new York academy of sciences, 1415, 11 - 20 10 Fernanda B Coeli., Fernanda C Soardi et al (2010) Novel deletion alleles carrying CYP21A1P/A2 chimeric genes in Brazilian patients with 21-hydroxylase deficiency BMC medical Genetics, - 11 Finkielstain GP., Chen W., Mehta SP., Fujimura FK et al (2011) Comprehensive genetic analysis of 182 unrelated families Journal Hum Genet, 49, 65 - 72 Baumgartner-Parzer S.M, Nowotny P with congenital adrenal hyperplasia due to 21- (2004) Carrier frequency of congenital adre- tab, 96 (1), 161 - 172 TCNCYH 115 (6) - 2018 hydroxylase deficiency, J Clin Endocrinol Me- 51 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary CYP21A2 GENOTYPE STUDY IN PATIENTS AND THEIR FAMILY MEMBER WITH CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA DUE TO 21-OH DEFICIENCY Congenital adrenal hyperplasia (CAH) caused x by 21- hydroxylase deficiency (CAH-21OH) is an autosomal recessive genetic disorder due to mutation in the CYP21A2 gene Objective: to identify CYP21A2 genotype of patients and the familly members using sequencing and MLPA methods Patients and method: Mutation analysis of the CYP21A2 was performed on 27 patients and 60 family members with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency 100% of CAH patients were found to have mutation in CYP21A2 gene types of mutations have been detected Point mutation is accounted for 61.1%, the most commont point mutation was R356W (40.7%), following are IVS2-13A/C > G (9.3%), Q318X (9.3%), S125X (3.7%) We also detected 38.9% large deletion mutation in patient group 96.7% (58/60) of the family members were detected to have heterozygous mutation Only one generation of the whole pedigrees will be diagnosed with CAH and only one out of two children from the same family with have this disorder Keywords: congenital adrenal hyperplasia,salt wasting, CYP21A2 gene 52 TCNCYH 115 (6) - 2018 ... CYP21A2 thành viên gia đình thượng thận bẩm sinh gia đình, để bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh khuếch đại vị trí đột biến Chu trình nhiệt phản thể thiếu 21- hydroxylase thể muối nặng ứng PCR:... Gia đình có bị bệnh 0 Thăm khám phân tích phả hệ 27 gia đình có bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể muối, 100% gia đình có bị bệnh hệ, khơng có gia đình có bị bệnh Tất 27 bệnh nhân khám theo... Phân tích kết kiểu gen 27 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu lớn tỷ lệ: 38,9% Có bệnh nhân mang gen dị hợp tử alen Q318X R356W Bảng Kiểu gen đột biến phát nhóm bệnh nhân Số lượng