Nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá của cao quả nhàu trên thỏ bị chiếu xạ và trên 2 mô hình gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid và paracetamol ở chuột nhắt trắng

1 Đặt vấn đề Miễn dịch học lĩnh vực ngày phát triển có nhiều ứng dụng réng r·i y, sinh häc Mét c¸c híng nghiên cứu quan trọng miễn dịch tìm hiểu yếu tố mạng lới điều hoà, kiểm soát hoạt động hệ thống Trong trình hoạt ®éng cđa hƯ thèng miƠn dÞch, cã sù tham gia nhiều chất đóng vai trò truyền đạt thông tin tế bào Các chất có tác dụng kích thích hay kìm hÃm trởng thành hoạt động chức tế bào miễn dịch Những chất đợc gọi chất kích thích miễn dịch làm tăng cờng đáp ứng miễn dịch ngợc lại có tác dụng gây suy giảm đáp ứng miễn dịch đợc gọi chất ức chế miễn dịch [3] [8] [9] Trên lâm sàng tình trạng bệnh lý liên quan đến suy giảm miễn dịch, đặc biệt suy giảm miễn dịch thứ phát phổ biến nhiễm trùng cấp, mạn tính, nhiễm độc hoá chất, sau trị liệu ung th tia xạ, AIDS Điều trị bệnh lý việc điều trị nguyên nhân cần dùng thêm biện pháp kích thích miễn dịch thích hợp Các chất kích thích miễn dịch có nguồn gốc khác nhau, quan trọng phải kể đến chất kích thích miễn dịch nội sinh (đây sản phẩm chế tiết tế bào miễn dÞch) nh: interleukin (IL) 1, 2, 35, interferon (IFN) gọi chung cytokin [53] Các chất kích thÝch miƠn dÞch cã ngn gèc tõ vi khn, virus, ký sinh trïng, nÊm nh BCG, bronchovaxom, lentinan [3], [9], [29], [62], [90] C¸c chÊt kÝch thÝch miễn dịch có nguồn gốc hoá học đợc tổng hợp bán tổng hợp đà đợc sử dụng nh levamisol, imuthiol Hiệu mang lại việc sử dụng chất kích thích miễn dịch khả quan, nhiên nhiều tồn nh chi phí cho đợt điều trị cao sử dụng thuốc kích thích miễn dịch có nguồn gốc nội sinh, không phù hợp với điều kiện kinh tế phần lớn ngời bệnh Trong thuốc có nguồn gốc hoá học lại có độc tính cao, ảnh hởng xấu tới chức gan, thận Vì vậy, việc tìm kiếm đa vào sử dụng chất kích thích miễn dịch có nguồn gốc từ thực vật, đặc biệt dợc liệu có sẵn nớc vấn đề cấp thiết đợc đặt Cây nhàu (Morinda citrifolia L Rubiaceae), dợc liệu đợc nhân dân sử dụng lâu đời với mục đích nâng cao sức đề kháng thể [5], [28] Đặc biệt gần nhiều nhà khoa học giới đà nghiên cứu sâu nhàu trồng Hawaii đa nhiều kết nghiên cứu khả quan tác dụng chống ung th, chống oxyhóa kích thích miễn dịch [46], [75], [81], [97].[98], [99], [100], [101], [102], [116], [175], [218] Trong nghiên cứu trớc đà chứng minh cao nhàu có tác dụng kích thích miễn dịch thông qua t¸c dơng kÝch thÝch håi phơc c¸c chØ sè miƠn dịch súc vật thực nghiệm bị suy giảm miễn dịch chiếu tia gamma tiêm cyclophosphamid [2] Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm nghiên cứu tác dụng chống oxyhóa đánh giá sâu tác dụng kích thích miễn dịch thực nghiệm cao nhàu Việt Nam Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch in vitro in vivo cao nhàu chuột nhắt trắng Nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá cao nhàu thỏ bị chiếu xạ mô hình gây tổn thơng gan carbon tetraclorid paracetamol chuột nhắt trắng Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 suy giảm miễn dịch lâm sàng 1.1.1 Khái niệm suy giảm miễn dịch Suy giảm miễn dịch trạng thái hoạt động hệ miễn dịch không đủ mạnh để chống lại kháng nguyên nhằm bảo vệ thể Hậu suy giảm miễn dịch dễ mắc bệnh nhiễm khuẩn, tái nhiễm nhiều lần loại tác nhân gây bệnh, mắc bệnh mạn tính Suy giảm miễn dịch đợc chia làm nhóm: bẩm sinh mắc phải Suy giảm miễn dịch bẩm sinh hậu nhiều khiếm khuyết trình phát triển bào thai Suy giảm miễn dịch bẩm sinh thờng khó điều trị, biểu lâm sàng nặng nề tỷ lệ tử vong cao [63], [64], [77] Suy giảm miễn dịch mắc phải không bắt nguồn từ khiếm khuyết di truyền mà thờng yếu tố từ môi trờng sống gây Điều trị suy giảm miễn dịch mắc phải bên cạnh việc điều trị nguyên nhân thờng dùng thêm thuốc hỗ trợ điều biến miễn dịch, chất chống oxy ho¸[16], [68], [150], [170], [176], [189], [192], [203] 1.1.2 Suy giảm miễn dịch mắc phải: Đây loại bệnh lý thờng gặp nớc phát triển phát triển [92] Dựa vào nguyên nhân gây tình trạng suy giảm miễn dịch ngời ta chia mét sè nhãm chÝnh sau: - Suy gi¶m miƠn dịch suy dinh dỡng - Suy giảm miƠn dÞch nhiƠm vi sinh vËt: nhiƠm vi khn, nấm, kí sinh trùng, virus Đặc biệt suy giảm miễn dịch nhiễm HIV/AIDS - Suy giảm miễn dịch bệnh lý: bệnh mạn tính kéo dài, đặc biệt bệnh ung th - Suy giảm miễn dịch phóng xạ - Suy giảm miễn dịch thuốc hóa chất - Suy giảm miễn dịch khác nh: tuổi già, chấn thơng [173] * Suy giảm miễn dịch nhiƠm HIV/AIDS NhiƠm HIV/AIDS lµ bƯnh thêi sù cđa thÕ kỷ toàn giới Bệnh AIDS retrovirus HIV-1 hay HIV-2 gây HIV có lực cao với phân tử CD4 đồng thụ thể (Co - receptor) nh CXCR4 có tế bào có thẩm quyền miễn dịch chủ yếu tế bào TCD4+ đại thực bào Thời kỳ ủ bệnh thờng triệu chứng Diễn biến lâm sàng trình nhiễm HIV phản ánh tơng tác phức tạp tác động virus chức tế bào có thẩm quyền miễn dịch đáp ứng miễn dich vật chủ Suy giảm miễn dịch mắc phải nhiễm HIV/AIDS tình trạng nhiễm khuẩn kéo dài, trờng diễn dai dẳng, diễn biến chậm nhng hậu nặng nề dẫn đến thể bị suy giảm miễn dịch đặc biệt suy giảm miễn dịch qua trung gian tế bào Virus công vào tế bào TCD4, chemokin (CCR-5, CXCR-4) tế bào có thơ thĨ víi virus Ngêi nhiƠm HIV bÞ mÊt lympho TCD4 Do thiếu hụt TCD4 dẫn đến tổn thơng miễn dịch kèm theo TCD4 có vai trò to lớn đáp ứng miễn dịch dịch thể vµ qua trung gian tÕ bµo [8], [9], [77], [169] * Suy giảm miễn dịch ung th Ung th lµ mét bƯnh ngµy cµng phỉ biÕn vµ gia tăng toàn giới Về mặt tế bào học tế bào ung th bắt nguồn từ tế bào bình thờng thể nhng nguyên nhân tế bào bị đột biến phát triển vô hạn định làm thể kiểm soát đợc Về mặt gen học, đột biến trình phân bào tợng bình thờng, chúng bị loại trừ theo chế miễn dịch Nh bị mắc ung hệ miễn dịch thể đà bị suy giảm thân bệnh ung th làm hệ miễn dịch bị suy yếu hơn, đặc biệt suy giảm miễn dịch qua trung gian tế bào tế bào lympho T đảm nhận [3], [9], [79] Điều trị miễn dịch có nhiều hớng nhng thời kỳ thử nghiệm Các kháng thể đơn dòng đặc hiệu thuộc loại khác loài nên biến chứng gây mẫn cảm dị loài nghiêm trọng tác dụng diệt tế bào ung th Nhiều trờng hợp sử dụng cytokin kết cha rõ nhng phản ứng toàn thân mạnh mẽ nhiều phải bỏ thuốc INF- đà đợc dùng popilloma, leukose, IL-2 adenocarcinoma melanoma đà tạo đợc thời kỳ thoái lui kéo dài bệnh Rosenberg lần dùng IL-2 ex-vivo nghĩa ủ tế bào lympho bệnh nhân với cytokin thể để tạo LAK, sau tiêm trả lại cho bệnh nhân ung th thu nhỏ lại [3], [8], [9], [73], [205] Trong u lympho phơng pháp điều trị có nhiều hứa hẹn tự ghép tế bào tuỷ xơng tế bào máu cuống rốn Chọn lúc bệnh thoái lui tự nhiên, lấy tuỷ xơng cất đông lạnh sâu, sau dùng tia xạ với liều gây chết tế bào (các tế bào ung th ngoại vi bị tiêu diệt hết), truyền lại lợng tế bào gốc dự trữ cho bệnh nhân Hoặc dùng tế bào máu cuống rốn truyền cho bệnh nhân Các tế bào giúp thể hồi phục hoàn toàn chúng đợc sử lý trớc để có tế bào gốc đợc truyền vào Một hớng đợc ý tác dụng vào vị trí mà trình phát triển tế bào bị phong bế nhằm phục hồi lại trình biệt hóa tế bào Đó dùng chất chống oxyhóa chỗ toàn thân, dùng thực phẩm chức nh chất chống oxyhoá [29], [61],[63],[78], [196] 1.2 Các tác nhân gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm: Các tác nhân gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm đợc chia thành nhiều nhóm khác nhau: Thuốc hóa chất, yếu tố vật lý: phóng xạ, xạ ion, gây ung th thực nghiệm, gây nhiễm c¸c vi sinh vËt: vi khuÈn, nÊm, virus 1.2.1.Thuèc hóa chất: Hoá chất thờng đợc sử dụng cyclophosphamid (CY), cyclosporinA, dexamethason, azathioprin Mỗi chất có hiệu lực chế gây suy giảm miễn dịch riêng * Nhóm kháng purin: Ba chất thờng dùng nhÊt lµ 6-mercaptopurin, azathioprin vµ thioguanin Azathioprin (Imuran) lµ dÉn xuất nitro-imidazol mercaptopurin chất hay đợc sử dụng - Tác dụng chế: Tác dụng ức chế miễn dịch: nồng độ thấp 10 -2 mg/l, azathioprin ức chế sinh sản lympho T, gây độc tế bào ức chế tế bào tạo kháng thể Với nồng độ thấp 1mg/l, azathioprin ức chế phản ứng tạo hoa hồng tự nhiên chuột cống Trên ngời, với liều ức chế miễn dịch thông thờng không làm giảm bạch cầu, tác dụng xuất liều cao gây độc Azathioprin tác dụng lên miễn dịch đặc hiệu không đặc hiệu, kéo dài thời gian tồn mảnh ghép Tác dụng lên sản xuất kháng thể có đặc điểm: dùng đồng thời 48 sau dùng kháng nguyên có tác dụng, dùng trớc tác dụng Tác dụng lên sản xuất IgG IgM, tác dụng lên đáp ứng miễn dịch nguyên phát thứ phát Phối hợp azathioprin với kháng nguyên liều cao tạo tình trạng dung nạp miễn dịch đặc hiệu Trên chuột nhắt trắng dùng liều 20-35 mg chuột cống liều 15-20 mg/kg thể trọng để gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm [6], [88], [205] .* Nhóm mù tạc nitơ (nitrogen mustard) Hai thuốc thờng dùng cyclophosphamid (CY) clorambuci -Cơ chế tác dụng øc chÕ miƠn dÞch: LiỊu cao CY: 100300mg/kg thĨ träng chuột cống trắng thấy giảm tế bào lympho, teo hạch lympho, teo vùng vỏ tuyến ức, teo lách Các tổn thơng phục hồi nhanh, sau ngừng thuốc vài ngày thấy tăng sinh quan lympho đáp ứng miễn dịch trở lại bình thờng sau - tuần Cyclophosphamid tác dụng mạnh lympho B lympho T Điều thời gian sống lympho B ngắn lympho T Trên đáp ứng miễn dịch dịch thể: cyclophosphamid tác dụng chủ yếu lên IgG tác dụng yếu với IgM, tác dụng lên phản ứng miễn dịch nguyên phát mạnh thứ phát Làm phản ứng mẫn c¶m chËm Cyclophosphamid thêng dïng liỊu 100 - 200 mg/kg chuột nhắt, liều 150mg/kg chuột cống để gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm [6], [20], [32] * Methotrexat: chế miễn dịch tế bào miễn dịch dịch thể, thông qua ức chế nhân lên giảm chức tế bào lympho B T Tuy nhiên thuốc đợc dùng thực nghiệm [3], [6] * Cyclosporin A: Cycloporin cã cÊu tróc mét pepid vòng đợc chiết xuất từ nấm Tolypoclodium inflatum gams Thuốc øc chÕ chän läc víi lympho T Víi nång ®é điều trị, cyclosporin không gây ức chế tủy xơng Liều điều trị thuốc ức chế sản sinh ức chế giải phóng lymphokin, đặc biệt interleukin làm cho lympho T không trở thành tế bào lympho T nhận cảm đợc Liều cao, thuốc ức chế interleukin 2-receptor [3], [11], [73], [205] H×nh 1.1: Cơ chế tác dụng suy giảm miễn dịch cycloporin A * Corticoid: víi liỊu 2-10mg, ë cht cèng corticoid hủy tế bào lympho, đặc biệt huỷ tế bào tuyến ức Tác dụng làm giảm tế bào lympho sớm xuất hiện, đồng thời làm giảm khả tập trung tế bào lympho, tế bào đơn nhân bạch cầu đa nhân vị trí viêm Corticoid ức chế phản ứng mẫn chậm, ức chế di tản đại thực bào, làm giảm lympho độc với tế bào, kéo dài thời gian tồn mảnh ghép da Hiệp đồng với azathioprin ghép quan, làm giảm khả lu giữ kháng nguyên bề mặt đại thực bào, làm giảm tính thực bào thông qua giảm giải phóng interleukin Corticoid làm giảm sản xuất IL-2, IFN , làm tăng dị hóa IgG Liều lợng: chuột nhắt dùng liều 20-40 mg/kg thể trọng để gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm [6], [9], [205] ảnh Lách bình thờng - Lô (chứng sinh học) 34 ảnh Tuyến ức bình thờng - Lô (chứng sinh học) 35 ảnh Tuỷ xơng bình thờng - Lô (chứng sinh học) 35 ảnh Lách - Lô (mô hình CY) .36 ảnh Lách - Lô (CY + levamisol) 36 ảnh Tuyến ức - Lô (CY + levamisol) 37 ¶nh Lách - Lô (CY + nhàu) 37 ảnh Tuyến ức - Lô (CY + nhàu) 38 ảnh Tuỷ xơng - Lô (CY + nhàu) 38 ảnh 10 Lách - Lô (mô hình tia xạ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) 39 ảnh 11 Tuyến ức - Lô (mô hình tia xạ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) 39 ảnh 12 Tuỷ xơng - Lô (mô hình tia xạ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) 40 ảnh 13 Lách - Lô (tia xạ + levanisol), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) 40 ảnh 14 Tuyến ức - Lô (tia xạ + levanisol ), dïng thc c¸ch (XN sau tỉng liỊu xạ ngày) .41 ảnh 15 Tuỷ xơng - Lô (tia xạ + levanisol ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) 41 ảnh 16 Lách - Lô (tia xạ + nhàu), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) .42 ảnh 17 Tuyến ức - Lô (tia xạ + nhàu), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) 42 ảnh 18 Tuỷ xơng - Lô (tia xạ + nhàu), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) 43 ảnh 19 Lách - Lô (mô hình tia xạ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) 43 ảnh 20 Tuyến ức - Lô (mô hình tia xạ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) 44 ảnh 21 Lách - Lô (tia xạ + nhàu), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) .44 ¶nh 22 TuyÕn øc - Lô (tia xạ + nhàu), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) 45 Phụ lục Kết đánh giá giải phẫu vi thể lách, tuyến ức, tuỷ xơng Lách, tuyến ức tủy xơng chuột nhắt trắng mô hình gây suy giảm miễn dịch CY tia xạ đợc làm xét nghiệm giải phẫu vi thể + Trên mô hình gây suy giảm miễn dịch cyclophosphamid: ảnh Lách bình thờng - Lô (chøng sinh häc) (HE x 250) ¶nh TuyÕn øc bình thờng - Lô (chứng sinh học) (HE x 250) ảnh Tuỷ xơng bình thờng - Lô (chứng sinh học) (HE x 400) ảnh Lách - Lô (mô hình CY) Tăng sinh tế bào tuỷ trắng đỏ, nhiều mẫu tiểu cầu, suy giảm nặng dòng lympho (HE x 250) ảnh Lách - Lô (CY + levamisol) Các tế bào tơng đối bình thờng, không suy giảm nhiều (HE x 250) ảnh Tuyến ức - Lô (CY + levamisol) Các tế bào không suy giảm, tuyến ức gần nh bình thờng (HE x 250) ảnh Lách - Lô (CY + nhàu) Lách tăng sinh tế bào tuỷ trắng tăng sinh số tế bào nhân chia (HE x 400) ảnh Tuyến ức - Lô (CY + nhµu) Tun øc xung hut vïng vá, vïng tủ bình thờng không suy giảm dòng tế bào lympho (HE x 250) ảnh Tuỷ xơng - Lô (CY + nhàu) Tuỷ xơng dòng tiểu cầu giảm nhẹ, bạch cầu hồng cầu gần nh bình thờng (HE x 400) + Trên mô hình gây suy giảm miễn dịch tia xạ: ảnh 10 Lách - Lô (mô hình tia xạ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Lách xung huyết nhẹ, dòng tế bào lympho giảm rõ rệt (HE x 250) ảnh 11 Tuyến ức - Lô (mô hình tia xạ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Tuyến ức: tất dòng tế bào giảm nặng, đặc biệt dòng lympho (HE x 250) ảnh 12 Tuỷ xơng - Lô (mô hình tia xạ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Tuỷ xơng mẫu tiểu cầu ít, dòng bạch cầu hạt, lympho giảm (HE x 250) ảnh 13 Lách - Lô (tia xạ + levanisol), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Lách giảm nhẹ nguyên bào lympho, số lợng tiểu cầu ít, tăng nhẹ võng nội mô liên kết xơ (HE x 400) ảnh 14 Tuyến ức - Lô (tia xạ + levanisol ), dïng thc c¸ch (XN sau tỉng liều xạ ngày) Tuyến ức giảm nhẹ nguyên bào lympho vùng tuỷ, tăng sinh nhẹ nguyên bào võng nội mô (HE x 400) ảnh 15 Tuỷ xơng - Lô (tia xạ + levanisol ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Tuỷ xơng dòng tiểu cầu giảm rõ, dòng bạch cầu hạt lympho không giảm (HE x 400) ảnh 16 Lách - Lô (tia xạ + nhàu), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Lách xung huyết nhẹ, tế bào bình thờng, không giảm (HE x 250) ảnh 17 Tuyến ức - Lô (tia xạ + nhàu), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Tuyến ức bình thờng, tế bào không suy giảm (HE x 400) ảnh 18 Tuỷ xơng - Lô (tia xạ + nhàu), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Tuỷ xơng không xơ không thoái hoá mỡ, tăng dòng bạch cầu hạt (HE x 400) ảnh 19 Lách - Lô (mô hình tia xạ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Lách xơ hoá nhẹ, giảm nặng dòng tế bào nang (HE x 250) ảnh 20 Tuyến ức - Lô (mô hình tia xạ), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Tuyến ức giảm nhẹ nguyên bào lympho vùng tuỷ, tăng sinh nhẹ liên kết vùng vỏ (HE x 250) ảnh 21 Lách - Lô (tia xạ + nhàu), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Lách giảm rõ rệt nguyên bào lympho nang, tăng sinh liên kết, mẫu tiểu cầu, hồng cầu (HE x 250) ảnh 22 Tuyến ức - Lô (tia xạ + nhàu), dùng thuốc cách (XN sau tổng liều xạ ngày) Tuyến ức suy giảm vừa nguyên bào lympho, tăng sinh liên kết xơ tế bào võng m« (HE x 400) ... tài: Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch in vitro in vivo cao nhàu chuột nhắt trắng Nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá cao nhàu thỏ bị chiếu xạ mô hình gây tổn thơng gan carbon tetraclorid paracetamol. .. miễn dịch chiếu tia gamma tiêm cyclophosphamid [2] Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm nghiên cứu tác dụng chống oxyhóa đánh giá sâu tác dụng kích thích miễn dịch thực nghiệm cao nhàu Việt... liên tục bị phá huỷ tạo H2O2, nên gốc superoxid hydro peroxid tồn tế bào nồng độ cân O2ã_ + H2O2 HO + OH- + O Nh vậy, hô hấp tế bào đà sinh O 2? ?_, H2O2 , 1O2 độc hại thể [156] 1.5 .2. 2.Nguyên