Sắc ký - chromatography

Các kỹ thuật sắc ký dùng trong sinh học protein

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ

Tại sao phải dùng sắc ký:

Sắc ký Protein không phải là một quá trình phân tích cho kết quả định tính (Có – Không) đơn thuần Nó thường diễn ra theo nhiều bước khác nhau trong quá trình tinh sạch Protein Thông thường quá trình sắc ký là một khâu quan trọng trong các nghiên cứu Protein như cấu trúc, mối quan hệ giữa các nhóm chức hay biểu hiện protein v.v

Trong quá trình phân tách bằng sắc ký, chúng ta cần phải giải quyết một số vấn đề như sau:

1/ Chúng ta sẽ sử dụng protein vào mục đích nào? (Xác định hoạt tính, giải trình tự protein, nghiên cứu cấu trúc hay )

2/ Lượng protein cần thiết sử dụng và mức độ tinh sạch?

3/ Nguồn gốc của protein là từ đâu (Mô, dịch chiết, từ tế bào nuôi cấy …)?

4/ Bạn đã biết gì về protein quan tâm chưa (Tính ổn định, pI, MW )?

5/ Các phân tử tạp nhiễm hiện diện trong mẫu?

6/ Làm cách nào để phân tích các protein theo định lượng, thể tích, nông độ ((UV, protein assay…) và xác định hoạt tính (ELISA, Blotting )

Khi trả lời các câu hỏi này chúng ta sẽ xác định được phương pháp tinh sạch và các yếu tố thành công => kế hoạch cho tinh sạch

Sắc ký là gì?

Sắc ký là một phương pháp được chọn lựa để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học Sắc ký thường là phương pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây là phương pháp được đề nghị trong nghiên cứu lượng protein hay các phân tử sinh học với lượng mẫu lớn Quá trình sắc ký có thể được mô tả một cách đơn giản qua một số bước:

1 Một cột sắc ký được chuẩn bị với các

giá thể và đựơc cân bằng với dung dịch

buffer

2 Mẫu các phân tử sinh học được hòa vào

vào dung dịch đệm sau đó được đưa qua

cột

3 Một số mẫu sẽ bị giữ lại trên cột

4 Dòng dung dịch đệm tiếp tục được bơm

qua cột, mẫu sẽ được đẩy ra khỏi cột

theo từng phân đoạn

5 Rửa và cân bằng lại cột với dung dịch

đệm và sẵn sàng cho lần TN tiếp theo

Trong hầu hết quá trình này, chỉ có các phân tử sinh học có trong mẫu được quan tâm và thu nhận, các thành phấn khác có trong mẫu được xem như là các tạp chất Các phân tử sinh học cần thiết sẽ gắn kết với giá thể trong cột còn các chất tạp nhiễm sẽ được loại ra như các chất thải Ngược lại, có thể các chất tạp nhiễm bị giữ lại trên cột còn các phân tử sinh học lại được đẩy ra ngoài Tất cả điều đó phụ thuộc vào loại mẫu, loại phân

tử sinh học cần quan tâm và mức độ phức tạp của quy trình hay của phương pháp thực hiện

Sắc ký và các thuật ngữ dung trong sắc ký?

• Exclusion limit: Các phân tử có kích thước lớn hơn giới hạn kích thước của giá

thể (Exclusion limit) không thể đi vào bên trong lõi của giá thể được nên sẽ ở bên ngoài các chất giá thể và đựơc đẩy ra ngoài trong dung dịch bỏ ra trong lần đầu tiên (Void volume)

• Fractionation Range: Là khoảng có trọng lượng phân tử đủ nhỏ để đi vào trong

giá thể nhưng không qua toàn bộ giá thể hay toàn bộ các lổ của hạt giá thể

• Resolution (Độ phân giải): Độ cao (xa) của các thành phần trong quá trình sắc

ký và độ cao của đỉnh trong sắc ký đồ Đỉnh sắc ký đồ càng cao và càng tách ra, thì độ phân giải càng cao

• Tính chọn lọc (Selectivity): Làm thế nào giá thể thực hiện việc phân tách mẫu

mong muốn Các loại giá thể khác nhau, sẽ cho kết quả khác nhau trên cùng một mẫu Ta nói giá thể có tính chọn lọc

Các đặt tính cần thiết của Resin

Có nhiều đặt tính cần thiết của Resin mà các nhà khoa học quan tâm trong số các giá thể dung trong sắc ký Tuỳ thộc vào yêu cầu của TN hay kỹ thuật phân tích trong từng trường hợp

1 Độ phân giải cao

2 Khả năng gắn kết protein cao

3 Tính chọn lọc và tính chuyên biệt cao

4 Giá cả hợp lý

Tốc độ, khả năng lọc của gel (capacity) và độ phân giải là 1 trong 3 yếu tố có độ ảnh hưởng đến nhau trong quá trình sắc ký Rất khó có thể đạt tối đa một trong ba yếu tố

mà không ảnh hưởng đến yếu tố cỏn lại (Trừ khi sử dụng gel UNO hay UNO sphere cho phép đạt đựơc độ phân giài cao ở tốc độ cao)

1 Để tận dụng tối đa họat tính của gel (capacity), tốc độ sắc ký phải chậm, và khi đó đạt được độ phân giải tương đối tốt

2 Để đạt đựơc độ phân giải tốt, cần giảm lượng mẫu và tốc độ

3 Để đạt được tốc độ tối đa, mẫu phải ít, lúc đó độ phân giải sẽ giảm

Kích thước lổ gel cũng là một yếu tố quan trọng, tùy thuộc vàothí nghiệm thiết kế

1) Hạt có kích thước nhỏ (5-20 µm) thường cho độ phân giải tốt, nhưng yêu cầu vận hành ở áp suất cao và giá thành cao

2) Hạt có kích thước lớn (50 µm up) cho độ phân giải cao, giá thành thấp, vận hành

ở áp suất thấp hơn và thiết bị yêu cầu thấp hơn

Hạt có kích

thứơc nhỏ:

peaks nhọn, rõ,

độ phân giải cao

nhưng tạo nên

áp suất cao

trong hệ thống,

tốt cho phân

tích và chuẩn bị

dung dịch ở

lượng nhỏ

Hạt có kích thứơc nhỏ: peaks không

rỏ, độ phân giải không cao nhưng tạo nên áp suất không cao trong

hệ thống, không tốt cho phân tích, nhưng rất tốt cho chuẩn bị dung dịch ở lượng lớn.

CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION (ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY)

Sắc ký trao đổi ion là kỹ thuật thường được sử dụng nhất Kỹ thuật này dựa trên

sự phân tách của các điện tích khi mà một phân tử gắn với giá thể có mang điện tích khác dấu bản thân của giá thể không tích điện mà chúng xuất phát từ một nhóm chức năng có tên gọi là ligand Bản chất hóa học cơ bản của hạt mang lại cho nhiều tác nhân trao đổi ion đặc tính cơ bản của riêng nó UNOsphere và Macro-Prep, cùng với AG, Chelex, và Bio-Rex, đều khác nhau do hạt cơ bản của chúng

Tóm lược về sắc ký trao đổi ion

- Tách các phân tử theo điện tích

- Là kỹ thuật sử dụng thường xuyên

nhất

- Các nhóm tích điện được cố định trên

giá thể

- Các phân tử có điện tích trái dấu sẽ được gắn kết

- Các phân tử gắn kết được rửa giải bằng cách gia tăng lực ion (nồng độ muối)

- Dễ dàng thực hiện ở quy mô lớn hơn

Thuận lợi

- Kỹ thuật thu lượng mẫu khá đậm đặc

- Khả năng thu nhận cao

- Không đắt tiền

- Nhanh

Bất lợi

- Mẫu thường được rửa giải trong điều kiện nồng độ muối cao

- Tính chọn lọc thấp

Giá thể trao đổi ion âm tích điện dương

và gắn kết với các phân tử protein tích

điện âm (anion) Q và DEAE là các

ligand trao đổi ion âm thông thường

Q là Quaternary amine N(CH3)3

DEAE là Diethylaminoethyl N(C2H)2

Giá thể trao đổi ion dương tích điện âm

và gắn kết các protein tích điện dương (Cation) S và CM là các ligand trao đổi ion dương thông thường

S là Sulfonate SO3-

CM là Carboxymethyl COO-

Do phần lớn các protein tự nhiên mang tính acid và có pI nhỏ hơn 7 nên khoảng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion âm được sử dụng nhiều hơn Ở pH sinh lý (cơ thể) 7.4 protein thừơng tích điện âm nên các lọai chất trao đổi ion như Macro-Prep High Q hay UNOsphere Q, thường được sử dụng để tinh sạch proteins

HYDROXYAPATITE & FLUOROAPATITE

Hydroxyapatite và hiện nay là Fluoroapatite được giới thiệu lần đầu vào mùa hè năm 2004 Cơ chế tách thực hiện thông qua tương tác giữa protein với các nhóm phosphate và nhóm calcium trên giá thể Thêm vào đó, nhóm phosphate trên giá thể có thể tương tác với nhóm amin trên protein

Tổng quan chung về Hydroxyapatite

Phân tách protein dựa trên pI, điện tích và kích thước phân tử

HT có thành phần là calcium phosphate

Các phân tử tương tác với phosphate và calcium

HT là một trong những kỹ thuật cơ bản của trong phân tách các phân tử sinh học

CHT và CFT không kết tinh

Thuận lợi

- Là cơ chế tách độc nhất vô nhị (Unique

Separation Mechanism)

- Độ lập lại cao

- Độ phân giải cao

- Dễ dàng nâng cấp lên quy mô lớn

- Dễ dàng phát triển các phương pháp

- Độ bền cơ học cao

- Độ bền hóa học cao

- Cột có độ bền cao

- Protocols dễ thiết lập dựa trên các protocol có sẵn

- Fluoroapatite có thể thực hiện ở pH thấp đến pH 5.0

- Resin Ceramic bền

Bất lợi

- Không thể sử dụng CHT dưới pH 6.0 - Khó đoán kết quả gắn kết

Hydroxyapatite and fluoroapatite là công cụ độc đáo trong sắc ký các phân tử sinh học Cả hai loại resin đều có đặt tính phân tích đặt biệt, có thể phân tách và tinh sạch protein mà các phương pháp khác không thể thực hiện đựơc Cả hai lọai resin đều rất tốt cho sử dụng với các kháng thể, và thường phân tách các phân tử rất giống nhau (về mặt bản chất hóa học) CHT và CFT cho phép thực hiện việc phân tách như các dạng tinh thể khác nhưng hiện nay được phát triển bằng ceramic nên dễ dàng sử dụng hơn, bền hơn và khả năng phân tách cao hơn CHT ceramic hydroxyapatite có nhiều kích thước khác nhau nên dễ dàng chọn lựa để thực hiện trên các quy mô khác nhau CHT cho phép thực hiện ở

pH khá trung tính trung dung dịch đệm (có thể sử dụng dd đệm Na hay phosphate, nhưng phosphate thường được sử dụng hơn bởi vì dễ thực hiện trong các phòng lạnh) Fluoroapatite cho phép phân tách ở điều kiện acid hơn khỏang pH 5.0 mẫu được hòa tan trong phosphate buffer, 1-10 mM, và rửa gíải với một gradient lên đến 400 mM phosphate Đối với CHT các nhà nghiên cứu thường không sử dụng gradient nồng độ muối NaCl, như trong sắc ký trao đổi ion, mà sẽ tăng nồng độ muối trong buffer

SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

Kỹ thuật khác thường được sử dụng nhiều là kỹ thuật lọc gel (còn gọi là gel filtration hay gel permeation chromatography) Kỹ thuật này phân tách dựa trên trọng

lượng phân tử trong kỹ thuật này các protein lớn nhất sẽ di chuyển nhanh hơn và đựơc đưa ra khỏ cột trước trong khi các protein nhỏ hơn cần thời gian lâu hơn để đi qua cột và

vì vậy sẽ được rửa giải ra khỏi cột sau cùng

Tóm lược về Size Exclusion

Tách các phân tử dựa trên kích thước

Các phân tử có kích thước lớn đựơc rửa giải ra trước các phân tử nhỏ hơn

Thuận lợi

- Phương pháp đồng nhất, đơn giản, rẻ

tiền

- Không bị ảnh hưởng bởi các điều kiện

của đệm cho phép loại muối hay trao đổi

buffer

- Là kỹ thuật không có sự hút bám – các

điều kiện nhẹ nhàng, thu hồi đựơc luợng

mẫu nhiều, tốt

- Phân tách các đơn phân tử khỏi hỗn

hợp mà một số phương pháp khó thực

hiện

- Có thể loại muối 30% thể tích cột

Bất lợi

- Tốc độ chậm

- Độ phân giải thấp - mẫu protein cần có các protein khác nhau khá lớn về kích thước

- Kỹ thuật không bám hút

- Hòa tan mẫu

- Các phân đọan thu được cần cột thu nhận lớn hơn mẫu (có thể lớn hơn đến

20 lần)

- Không dùng được trong các bước bắt giữ mẫu

Có nhiều loại gel dùng trong kỹ thuật SEC do sự khác nhau của khỏang phân đọan của từng loại gel Người ta thường chọn dựa theo kích thước của các phân tử có chứa trong mẫu

1 Các phân tử có kích thước lớn không thể đi vào trong lõi của gel và đi bên ngòai, chúng sẽ đi vào trong thể tích void, và sẽ đi thẳng ra khỏi cột

2 Các phân tử nhỏ hơn đi vào trong lõi của hạt và bị giữ lại 1 chút nên đi ra ngoài chậm hơn

3 Các phân tử rất nhỏ sẽ thâm nhập đựơc vào lõi của hạt bất kỳ vị trí nào trong gel

và cần thời gian lâu nhất để bị đẩy ra ngòai, và đi vào tổng thể tích của mẫu

SẮC KÝ TƯƠNG TÁC KỴ NƯỚC (HIC)

Sắc ký tương tác kỵ nước là phươpng pháp bổ sung khá tốt cho các kỹ thuật phân tách khác Trong những năm gần đây, phương pháp này trở nên thông dụng như là các bước đầu tiên trong quá trình sắc ký

Lọai hạt Macro-Prep có dẫn xuất là nhóm kỵ nước, có thể là gốc methyl hay t-butyl Các gốc này hấp dẫn các gốc kỵ nước khác có trên bề mặt protein Khi cho mẫu protein vào trong điều kiện nồng độ muối cao, nồng độ muối cao ép các phần kỵ nước lại gần nhau và đính với nhau Quá trình rửa giải đựơc thực hiện bằng cách giảm dần nồng

độ muối cho đến khi các phần gắn kết kỵ nước đi lại vào trong dung dịch

Tóm lược về sắc ký kỵ nước - HIC

Phân tách các phân tử dựa theo tính kỵ nước của phân tử

Các nhóm kỵ nước khác nhau được cố định trên bề mặt giá thể

Dưới điều kiện nồng độ muối cao (thấp) các phần kỵ nước trên phân tử tương tác các nhóm cố định

Các phân tử gắn kết được rửa giải bằng cách giảm lực ion và vì vậy hòa tan các phân tử

ra khỏi giá thể

Thuận lợi

- Là bước cho phép cô mẫu

- Công suất cao

- Nhanh

- Mẫu được thu nhận trong nồng độ

muối thấp

Bất lợi

- Một số protein có thể bị tủa ở nồng độ muối cao

- Khó nâng cấp lên quy mô lớn

SẮC KÝ ÁI LỰC (AFFINITY CHROMATOGRAPHY)

Có rất nhiều kỹ thuật trong sắc ky, nhưng kỹ thuật sắc ký ái lực sử dụng các giá thể có một nhóm có ái lực với protein mà chúng ta quan tâm, nghĩa là các protein này

“muốn” bám vào giá thể Một ligand đựơc gắn kết vào giá thể và cũng chính ligand này

sẽ gắn kết với phân tử quan tâm Một ví dụ điển hình là tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể Ta có thể tinh sạch một kháng nguyên bằng cách cho mẫu đi qua cột có chứa giá thể liên kết với kháng thể để thu nhận protein Ngược lại, một giá thể có lien kết với một kháng nguyên chuyên biệt sẽ bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên đó Ứng dụng được biết đến nhiều nhất là gắn kết Protein A và Affi-Gel protein A (Protein A

là antigen cho IgG) vào gel để gắn kết các globulin miễn dịch Có nhiều lọai gel có sẵn trên thị trừơng và cũng có nhiều loại giá thể đã được hoạt hóa có thể được dùng để cố định trên gel bởi các nhà nghiên cứu

Tóm lược về sắc ký ái lực

Kỹ thuật hấp thụ phát hiện các ái lực sinh học mà một protein có với một phân tử khác được cố định tên một pha ổn định

Thuận lợi

- Phát triển phương pháp tinh sạch trên

protein A dễ dàng

- Bứơc bắt giữ tốt

- Cho phép phân tách protein dạng

nguyên thủy còn hoạt tính với dạng đã

biến tính

Bất lợi

- Đắt tiền

- Khó tẩy rửa

- Chọn lọc ligand

- Gắn kết ligand lên giá thể hoạt hóa thường khó

Có nhiều phương thức khác nhau để rửa giải các protein gắn ái lực vì có nhiều loại sắc ký ái lực khác nhau, các bước theo garadient vẫn thường đựơc sử dụng Thường

sử dụng trên các hệ thống có áp suất thấp Các giá thể (thường là agarose) thường chịu được áp suất dưới 50psi

SỬ DỤNG CÁC PHƯƠGN PHÁP SẮC KÝ

Thông thường, để đạt được mục tiêu cuối cùng, người ta sử dụng nhiều hơn một bước sắc ký, người ta thường dùng các phương pháp khác nhau để tách các phân tử theo các đặt tính khác nhau của protein, ví dụ như một mẫu có thể tinh chế qua lần đầu tiên là trao đổi ion để thu nhận các protein dựa theo điện tích sau đó thực hiện theo bước lọc gel (theo kích thước và trao đổi buffer của mẫu như là một bước trung gian), tiếp theo đó ta

có thể thực hiện sắc ký hydroxyapatite như là bước tinh sạch cuối cùng

Thường thì có giới hạn các bước trong suốt quy trình tinh sạch vì các nguyên liệu hay mẫu sẽ mất đi trong mỗi bước Vì vậy, việc lựa chọn đúng kỹ thuật và vật liệu cho tinh sạch là điều cực kỳ quan trọng

TÓM LƯỢC VỀ CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ, ĐẶT TÍNH VÀ ỨNG DỤNG

ION EXCHANGE – TÁCH THEO ĐIỆN TÍCH

Đặt tính

- Độ phân giải tốt

- Tốc độ cao

- Công suất sử dụng cao

- Cô đặc mẫu

- Không đắt tiền

Ứng dụng

- Bắt giữ trong giai đọan đầu của sắc ký

- Trong các giai đọan phân đọan trung gian

- Sạch

HYDROXYAPATITE (CERAMIC) – TÁCH THEO CƠ CHẾ TƯƠNG TÁC ĐỘC NHẤT (UNIQUE)

Đặt tính

- Độ phân giải rất cao

- Tốc độ cao

- Công suất sử dụng cao

- Cô đặc mẫu

- Không đắt tiền

Ứng dụng

- Bắt giữ trong giai đọan đầu của sắc ký

- Trong các giai đọan phân đọan trung gian

- Sạch

- Dùng phân tách các phân nhóm phụ, isozymes

SẮC KÝ LỌC GEL – PHÂN TÁCH THEO KÍCH THƯỚC PHÂN TỬ

Đặt tính

- Độ phân giải ở mức độ vừa phải

- Công suất thấp

- Chậm

- Hòa loãng mẫu

- Không đắt tiền

Ứng dụng

- Lọai muối khỏi dung dịch, trao đổi đệm

- Bước làm sạch sau các bước

- Tách chiết theo nhóm

- Tách chiết các monomer và dimer

SẮC KÝ TƯƠNG TÁC KỴ NƯỚC – THEO MỨC ĐỘ KỴ NƯỚC CỦA PHÂN TỬ

Đặt tính

- Độ phân giải tốt

- Tốc độ cao

- Công suất tốt

- Mẫu thu nhận cô đọng (không hòa loãng mẫu)

Ứng dụng

- Bắt giữ các phân tử trong các giai đọan đầu

- Phân đọan trung gian (Intermediary fractionation)