Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ các cao chiết thô của loài nấm Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. 1887 thu thập tại Vườn Quốc gia Chư Yang Sin, tỉnh Đắk Lắk tiến hành thu thập loài nấm Ganoderma applanatum mọc hoang dã ngoài từ nhiên, sau đó tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của một số loại cao chiết thô từ của chúng để làm cơ sở khoa học cho việc ứng dụng loài nấm Ganoderma applanatum trong đời sống.
Tuyển tập Hội nghị Nấm học Toàn quốc lần thứ doi: 10.15625/vap.2022.0147 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC CAO CHIẾT THƠ CỦA LỒI NẤM Ganoderma applanatum (PERS.) PAT 1887 THU THẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA CHƯ YANG SIN, TỈNH ĐẮK LẮK Nguyễn Phương Đại Nguyên, Nguyễn Hữu Kiên*, Trần Thị Kim Thi Trường Đại học Tây Nguyên *Email: nhkien@ttn.edu.vn TĨM TẮT Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành thu thập lồi Ganoderma applanatum có nguồn gốc Vườn Quốc gia Chư Yang Sin, tỉnh Đắk Lắk, tiến hành nghiên cứu khả kháng khuẩn từ cao chiết thơ lồi nấm Ganoderma applanatum thu thập dựa khả ức chế phát triển vi khuẩn thể qua đường kính vịng kháng khuẩn tạo đĩa petri chứa môi trường Mueller Hinton Agar phương pháp khuếch tán đĩa thạch Khả kháng khuẩn loại cao thô với dung môi: nước, methanol, acetone, ethanol loài vi khuẩn gồm: vi khuẩn B subtilis (ATCC 6633TM), S aureus (ATCC 25923TM), E coli (ATCC 25922TM) Kết cho thấy khả kháng khuẩn loại cao thô loại vi khuẩn nghiên cứu khác nhau, cao thơ ethanol thể hoạt tính kháng khuẩn tốt cụ thể với nồng độ 320 mg/mL có khả kháng loại vi khuẩn B subtilis, S aureus với kích thước vịng kháng khuẩn đạt 15 mm sau 24 h ni cấy, cịn cao nước khơng có vịng kháng khuẩn Từ khố: Ganoderma applanatum, kháng khuẩn, Chư Yang Sin GIỚI THIỆU Nấm nói chung lồi nấm lớn nói riêng có vai trò quan trọng sống người để làm thực phẩm, chế biến thức ăn, làm thuốc chữa bệnh Nấm lớn sử dụng y dược nhiều loài nấm Linh chi thuộc họ Ganodermataceae Các sản phẩm công bố nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, ni trồng ứng dụng nấm Linh chi đời sống phong phú Các nhóm chất chất có tác dụng sinh học bao gồm: triterpenoid, steroid, acid béo, enzyme kháng sinh, protein,… Về mặt hoạt tính dược lý, acid béo có khả ức chế giải phóng histamin Nhóm protein có khả chống dị ứng phổ rộng điều hịa miễn dịch Nhóm nucleotid ức chế kết dính tiểu cầu, giãn giảm đau Nhóm alcaloid có tác dụng trợ tim Nhóm steroid giải độc gan, ức chế sinh tổng hợp cholesterol Nhóm polysacchairid chống hạ đường huyết, tăng cường miễn dịch Nhóm triterpen hạ huyết áp, ức chế enzyme biến đổi angiotensine (ACE), bảo vệ gan, chống khối u Ngồi ra, ngun tố Germanium tìm thấy nấm lim xanh G lucidum có tác dụng chống ung thư theo chế ngăn ngừa tình trạng thiếu oxy nuôi dưỡng tế bào - (Hypoxia) Germanium không trực tiếp công vào tế bào u, bướu mà kích thích hệ thống miễn dịch tự tiến hành sửa chữa tổn thương, thúc đẩy trình tái tạo tế bào,… [1] Hiện nay, có số cơng bố hoạt tính cao chiết từ thể loài Ganoderma applanatum Ở Việt Nam loài nấm Ganoderma applanatum mọc hoang dại chủ yếu sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, liệu hoạt tính kháng khuẩn chúng cịn Mục đích 177 Nguyễn Phương Đại Nguyên cs nghiên cứu tiến hành thu thập loài nấm Ganoderma applanatum mọc hoang dã ngồi từ nhiên, sau tiến hành khảo sát khả kháng khuẩn số loại cao chiết thô từ chúng để làm sở khoa học cho việc ứng dụng loài nấm Ganoderma applanatum đời sống Trên sở đó, chúng tối tiến hành nghiên cứu khả kháng khuẩn từ cao chiết thơ lồi nấm Ganoderma applanatum thu thập dựa khả ức chế phát triển vi khuẩn thể qua đường kính vịng kháng khuẩn tạo đĩa petri chứa môi trường Mueller Hinton Agar phương pháp khuếch tán đĩa thạch Khả kháng khuẩn loại cao thô với dung mơi: nước, methanol, acetone, ethanol lồi vi khuẩn gồm: vi khuẩn B subtilis (ATCC 6633TM), S aureus (ATCC 25923TM), E coli (ATCC 25922TM) Trong đó, E.coli vi khuẩn Gram (-) gây bệnh khác Khi xâm nhập vào đường tiêu hóa, chúng gây tiêu chảy bệnh đường ruột Khi xâm nhập vào đường tiết chúng gây bệnh nhiễm khuẩn tiết niệu [2]; S.aureus vi khuẩn Gram (+) thường gặp có khả gây nhiều loại bệnh khác nhau, S.aureus phân bố hầu hết hốc tự nhiên người mũi, bề mặt da, tai,… có khả gây bệnh mụn nhọt, viêm da, viêm phổi, viêm não, đường tiết niệu, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẫu [3]; B.subtilis vi khuẩn Gram (+) probiotic – vi khuẩn có lợi, an tồn B.subtilis khơng coi tác nhân gây bệnh độc hại chúng sử dụng để sản xuất chế phẩm hỗ trợ hệ tiêu hóa [3] Đồng thời nghiên cứu sử dụng đối chứng dương ampicillin: kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm betalactam, tức nhóm kháng sinh có cấu trúc phân tử gồm khung beta-lactam; Ampicillin thực chất penicillin bán tổng hợp nhóm A có hoạt phổ rộng với nhiều chủng vi khuẩn Gram (+) vi khuẩn Gram (-) Ampicillin có tác dụng chống lại vi khuẩn mẫn cảm gây nhiễm khuẩn đường hô hấp, dẫn mật, tiêu hố, tiết niệu, số bệnh ngồi da viêm bì có mủ, áp - xe, đầu đinh, viêm tai giữa, bàng quang thận, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu phương pháp chuẩn bị mẫu nghiên cứu Loài nấm Ganoderma applanatum thu Vườn Quốc gia Chư Yang Sin, tỉnh Đắk Lắk; sau làm sấy nhiệt độ 55 - 60 oC đến đạt độ ẩm % Mẫu sau sấy bảo quản bao PE màu đen giữ tủ đông nhiệt độ -30 oC sử dụng 2.2 Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp thu thập, phân tích, định loại mẫu Thu thập mẫu nấm tiến hành theo phương pháp Lê Bá Dũng (2003): Mẫu tìm kiếm thu thập theo sinh cảnh khác như: Rừng thông, rừng hỗn giao kim rộng, trảng cỏ bụi, mẫu thu cách ngẫu nhiên dọc theo tuyến đường thu mẫu Khi thu mẫu dựa vào số đặc điểm chi nấm để làm sở thu mẫu như: Quả thể dạng san hô, thịt nấm mềm, dễ thối rữa, nấm có màu sắc đa dạng phong phú như: đỏ, cam, vàng, kem, trắng,…[4] Phân tích đặc điểm: Phân tích đặc điểm hiển vi bào tử, hệ sợi, đảm,… sử dụng kính hiển vi Olympus (Nhật) quan sát độ phóng đại 400 phân tích hình thái ngồi màu sắc, độ phân nhánh, biến đổi màu sắc nấm bị thương cách sử dụng kính lúp Phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh học, Trường Đại học Tây Nguyên 178 Nghiên cứu khả kháng khuẩn từ cao chiết thơ lồi nấm Ganoderma applanatum … Định danh loài: Dựa vào dẫn liệu hình thái, cấu trúc giải phẫu, chúng tơi tiến hành định danh theo phương pháp hình thái giải phẫu so sánh dựa tư liệu tác giả Teng (1964) [5], Trịnh Tam Kiệt (2011) [6] * Phương pháp trích ly mẫu: Trích ly mẫu nghiên cứu tiến hành cụ thể sau: Chiết mẫu sử dụng phương pháp ngâm kiệt dung môi hữu theo tỉ lệ (1:10) Đối với ba dung môi acetone, ethanol methanol thực theo quy trình, riêng với dung mơi nước mẫu nấm chiết nóng 100 ̊C thời gian - giờ, đậy nắp miệng bình để nước khơng bay Sau gạn thu dịch chiết lặp lại dịch chiết có màu nhạt dần Dịch chiết thu tiến hành lọc vải kate trắng lọc lại giấy lọc, chưng cất phương pháp thăng hoa 60 oC Kết thúc thu cao thô acetone, cao thô methanol, cao thô ethanol cao thô nước * Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết Nguyên tắc: Dựa khả ức chế phát triển vi khuẩn thể qua đường kính vịng kháng khuẩn tạo đĩa petri chứa môi trường Mueller Hinton Agar phương pháp khuếch tán đĩa thạch [7] Chuẩn bị môi trường Theo công thức lấy 34 g Mueller Hinton Agar pha L nước cất, điều chỉnh pH sau đem đun sơi để hịa tan đem hấp khử trùng 121 oC 15 phút, 1atm Sau để nguội, nhiệt độ khoảng 50 - 60 oC đổ khoảng 25 mL mơi trường hấp khử trùng vào đĩa petri vơ trùng đường kính cm để có độ dày mm Chuẩn bị vi khuẩn Tăng sinh vi khuẩn môi trường canh thang ủ ấm 37 oC Vi khuẩn sau 24 tăng sinh tiến hành ly tâm thu cặn bỏ dịch (ly tâm 3.000 vòng/5 phút) pha với nước muối sinh lý 0,9 % độ đục chuẩn (McFarland) Hút 100 µL dịch vi khuẩn chuẩn bị cho vào đĩa thạch láng dịch chứa vi khuẩn mặt đĩa thạch que cấy trải, ủ 30 phút sử dụng dụng cụ đục lỗ thạch, tạo lỗ theo sơ đồ dưới, lỗ đục có đường kính mm Quy ước đục lỗ thạch Chú thích: 1, 2, 3, 4, lỗ nhỏ cao chiết có nồng độ khảo sát cao xuống thấp nhất; nhỏ đối chứng âm dung môi pha mẫu Nhỏ cao chiết thô cao chiết phân đoạn vào lỗ đục Để khô tự nhiên 30 phút nhiệt độ phòng ủ ấm nhiệt độ 37 oC Đo vòng kháng khuẩn sau 24 h Đo ghi lại kích thước vịng 179 Nguyễn Phương Đại Ngun cs vơ khuẩn Hoạt tính ức chế vi khuẩn đánh giá cách đo đường kính (ĐK) vòng ức chế vi sinh vật Dùng thước kẹp có chia mm để đo đường kính vịng kháng khuẩn Thí nghiệm lặp lại ba lần lấy số đo đường kính trung bình Nồng độ cao lỗ: Nồng độ Cao 320 mg/mL 160 mg/mL Cao thô 80 mg/mL 40 mg/mL 20 mg/mL * Xử lý số liệu Xử lý thống kê phần mềm Stagraphic Centurion XV Các số liệu biểu diễn giá trị trung bình lần lặp lại ± độ lệch chuẩn với mức ý nghĩa p