MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3 1 1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 3 1 1 1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc 3 1[.]
MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 1.1.1 Lịch sử đời, nguồn gốc 1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại phổ tác dụng 1.1.3 Đặc tính cephalosporin nghiên cứu .5 1.2 TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM 1.2.1 Công thức cấu tạo 1.2.2 Tính chất lí hóa 1.2.5 Chỉ định 1.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim 1.2.6.1 Nghiên cứu định lượng cefixim phương pháp đo quang 1.2.6.2 Nghiên cứu định lượng cefixim phương pháp HPLC 1.4 SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 10 1.4.1 Khái niệm 10 1.4.2 Nguyên tắc .10 1.4.3 Phân loại 10 1.4.4 Các thông số đặc trưng .10 1.4.5 Ứng dụng HPLC 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15 2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 15 2.2.1 Hóa chất – thuốc thử - chất chuẩn 15 2.2.2 Thiết bị - dụng cụ 16 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu .17 2.3.2 Xây dựng điều kiện sắc kí .17 2.3.3 Đánh giá phương pháp 17 2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu 18 CHƯƠNG : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH .19 3.1.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu .19 3.1.1.1 Lựa chọn loại dung môi xử lí mẫu 19 3.1.1.2 Lựa chọn tỉ lệ dung mơi xử lí mẫu 21 3.1.2 Khảo sát quy trình phân tích 23 3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn cột sắc kí .24 3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động tốc độ dòng 25 3.1.2.3 Khảo sát thể tích tiêm mẫu .26 3.1.3 Quy trình phân tích 27 3.2.ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP .29 3.2.1.Độ thích hợp hệ thống .29 3.2.2 Độ đặc hiệu 30 3.2.3 Độ tuyến tính 32 3.2.4 Độ 34 3.2.5 Khảo sát độ xác 36 3.2.5.1 Độ lặp lại 36 3.2.5.2 Độ xác trung gian 36 3.2.6.Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) .38 3.2.6.1.Giới hạn phát 38 3.2.5.2 Giới hạn định lượng 39 3.3.BÀN LUẬN 39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 4.1 KẾT LUẬN 42 4.2 ĐỀ XUẤT .43 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril BP 2010 The Bristist Pharmacopoeia (Dược điển Anh 2010) C18 Octadecyl DAD Diode array derector (derector chuỗi diod) HPLC High perform liquid chromatography (sắc kí lỏng hiệu cao) HPLC-MS High perform liquid chromatography –Mas Spectrometry (sắc kí lỏng khối phổ) MeOH Methanol mg miligram ml mililit PA Pro analysis (tinh khiết phân tích) SĐK Số đăng kí USP 32 The United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ 34) UV - VIS Ultraviolet and visiable absorption Spectrophotometry (phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến) DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Phổ tác dụng cephalosporin Bảng 1.2 Đặc tính cephalosporin nghiên cứu đề tài Bảng 3.1 Khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu 20 Bảng 3.2 Kết khảo sát thể tích tiêm mẫu 27 Bảng 3.3 Kết độ thích hợp hệ thống 29 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ tuyến tính 33 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ 35 Bảng 3.6 Kết độ lặp lại độ xác trung gian 37 Bảng 3.7 Kết khảo sát LOD 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Cơng thức chung cephalosporin Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo cefixim Hình 2.1 Hóa chất,thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ .16 Hình 3.1 Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn dung mơi xử lí mẫu 20 Hình 3.2 Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn lượng dung mơi xử lí mẫu 22 Hình 3.3 Khảo sát lựa chọn cột sắc kí .25 Hình 3.4 Sắc kí đồ khảo sát thành phần pha động tốc độ dịng 26 Hình 3.5 Mối liên quan thể tích tiêm mẫu diện tích pic .27 Hình 3.6 Sắc kí đồ khảo sát độ đặc hiệu: mẫu chuẩn (a), mẫu trắng (b), mẫu thử (c) 31 Hình 3.7 Phổ cefixim dung dịch thử dung dịch chuẩn 31 Hình 3.8 Sắc kí đồ khảo sát độ đặc hiệu phân tích cefixim cephalosporin khác 32 Hình 3.9.a Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ (ng/ml) diện tích pic (mAu.s) cefixim 33 Hình 3.9.b Sắc kí đồ khảo sát độ tuyến tính 34 Hình 3.10 Sắc kí đồ sát LOD 39 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1929, Alexander Fleming phát khả kháng khuẩn nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu sử dụng kháng sinh Từ tới có nhiều dịng kháng sinh mạnh, phổ rộng cephalosporin, macrolid, quinolon, cloramphenicol… đời Sự đời loại thuốc kháng khuẩn kháng sinh thành tựu vĩ đại y học Các bác sĩ có loại thuốc kì diệu giá rẻ hiệu điều trị nhiễm khuẩn Kháng sinh với biện pháp vệ sinh, tiêm phịng góp phần gia tăng tuổi thọ người nhiều năm, chí nhiều thập kỉ Mỗi lần phát loài vi khuẩn kháng thuốc, phịng thí nghiệm lại đưa loại thuốc kháng sinh mới[7], [25] Tuy nhiên theo cảnh báo WHO, loại kháng sinh công hiệu điều trị bệnh dần bị vơ hiệu hóa Trong chiến vi khuẩn người, phần thắng nghiêng phía loại vi khuẩn kháng thuốc Đây gần dấu chấm hết cho thời kì hồng kim thuốc kháng sinh [26] Từ năm 1987 khơng có loại kháng sinh phát cịn vi khuẩn lại khơng ngừng biến đổi [25], [26] Do đó, giảm tỉ lệ kháng thuốc vi khuẩn công việc cấp bách hết Một nguyên nhân quan trọng dẫn đến vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh tồn dư nước thải đặc biệt nước thải nhà máy sản xuất kháng sinh Việc loại bỏ khơng hồn tồn kháng sinh nước thải nhà máy dẫn đến việc xả nước vào môi trường tiềm ảnh hưởng đến sức khỏe người tác động đến hệ sinh thái, tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc nồng độ dấu vết [24] Do hướng nghiên cứu dư lượng kháng sinh, chất chuyển hóa chúng ảnh hưởng chúng lên người môi trường quan tâm ý đặc biệt nước phát triển [24], [17]…Đã có nhiều nghiên cứu định lượng kháng sinh nước thải ảnh hưởng lên động thực vật sức khỏe người [19] Tại Việt Nam vấn đề dư lượng kháng sinh nước thải quan tâm nghiên cứu định lượng kháng sinh nước thải bệnh viện [3] Công nghiệp dược phát triển mạnh với gia tăng số lượng nhà máy sản xuất dược phẩm với lượng kháng sinh thải môi trường ngày nhiều Tuy nhiên lại chưa có nghiên cứu dư lượng kháng sinh nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm Cefixim kháng sinh cephalosporin hệ có phổ rộng, có hiệu nhiều vi khuẩn kháng nhiều loại kháng sinh cephalosporin hệ 1, cephalosporin hệ 2, penicillin,… đặc biệt cefixim dùng theo đường uống – đường dùng đơn giản dễ sử dụng so với nhiều cephalosporin khác Vì mà cefixim ngày sử dụng nhiều Để góp phần kiểm sốt dư lượng kháng sinh, cụ thể kháng sinh cefixim nhà máy sản xuất dược phẩm thực đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng cefixim nước thải sắc kí lỏng hiệu cao” Với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp xử lí mẫu điều kiện phân tích định lượng cefixim nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm - Thẩm định phương pháp định lượng cefixim mẫu nước CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 1.1.1 Lịch sử đời, nguồn gốc Năm 1945, Giuseppe Brotzu từ nguồn nước biển Cagliari (Italia) phân lập chủng nấm Cephalosporium acremonium Dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm có tác dụng ức chế phát triển tụ cầu vàng Staphylococcus aureus có tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu vàng bệnh thương hàn người Từ năm 1948 đến năm 1956, Abraham Neuton (Anh) từ môi trường nuôi cấy (nay gọi Acremonium chrysogenum) chiết hỗn hợp kháng sinh cephalosporin P1, cephalosporin C penicillin N Năm 1971, từ chủng Norcardia, Nagarazan chiết xuất cephamycin có cấu trúc gần với cephalosporin C Có nhiều cephalosporin tự nhiên sinh tổng hợp từ chủng nấm mốc khác chúng khơng có ý nghĩa trị liệu Vì người ta tìm cách tạo cephalosporin bán tổng hợp sở cấu trúc vòng β-lactam Ưu cephalosporin có tác dụng kháng khuẩn vi khuẩn có hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) độc tính thấp Vì chúng nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trị liệu [8] 1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại phổ tác dụng * Công thức chung cephalosporin: R2 H R1 NH H S H O N R3 O HO O Hình 1.1: Cơng thức chung cephalosporin Cephalosporin dẫn chất acyl hóa acid 7-aminocephalosporanic (A7AC), mang cấu trúc -cephem, đủ liên hợp điện tử với vịng β –lactam để hợp chất có tác dụng sinh học Trong A7AC, carbon bất đối C(6) C(7) có cấu hình R, ngun nhân làm cho cephalosporin có tính hữu truyền mạnh [7] * Phân loại phổ tác dụng Hiện nay, cephalosporin phân loại thành hệ dựa phổ tác dụng Các cephalosporin hệ trước tác dụng vi khuẩn Gram (+) mạnh hơn, Gram (-) yếu hệ sau ngược lại Phổ chung hệ cephalosporin giới thiệu bảng 1.1 [9] Bảng 1.1 Phổ tác dụng cephalosporin Tên Tên đại nhóm diện Thế hệ I Phổ tác dụng Cephalexin - Phổ tác dụng trung bình, tác dụng vi khuẩn Cephalothin Gram (+) tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu Cephazolin kháng methicillin) … - Thuốc có tác dụng số vi khuẩn Gram (-) E.coli, Kebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis Shigella Thế hệ II Cephaclor - Phổ tác dụng tương tự hệ Tuy nhiên tác Cephuroxim dụng vi khuẩn Gram (+) yếu tác dụng Cefotetan… vi khuẩn Gram (-) mạnh Thế hệ III Cefixim - Tác dụng tốt vi khuẩn Gram (-), bền vững với β- Cefoperazon lactamase, tác dụng P aeruginosa Cefotaxim Thế hệ IV Cefdinir Cefepim… - Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng hệ - Phổ tác dụng tương tự mạnh hệ Thuốc tác dụng Enterobacteriaceae, tốt với Haemophilus, Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu - Bền vững với β-lactamase vi khuẩn Pseudomonas, 1.1.3 Đặc tính cephalosporin nghiên cứu Trong khuôn khổ đề tài chúng tơi xin giới thiệu đặc tính số cephalosporin sử dụng nghiên cứu đề tài bảng 1.2 [6], [7], [9], [13], [18], [22] Bảng 1.2 Đặc tính cephalosporin nghiên cứu đề tài Tên chất Thế hệ Cephadroxil monohydrat I 2.Cefuroxim II 3.Cefdinir III 4.Ceftazidim III 5.Cefotaxim natri III 6.Cefoperazon III Công thức phân tử Tính chất vật lí - Bột màu trắng gần trắng - Khó tan nước, khó tan ethanol 96% C20H22N4O10S - Bột trắng vàng - Ít tan nước, tan aceton, ethyl acetat methanol, tan ethanol C14H13N5O5S2 - Bột trắng vàng - Tan dung dịch đệm phosphat 0,1M (pH = 7), tan nước, alcol diethyl ether C22H22N6O7S2.5H2O - Bột trắng vàng - Tan dung dịch kiềm, dimethyl sulfoxid, tan dimethylformamid, methanol, nước, khơng tan aceton, ethanol, cloroform, dioxan, ether, ethyl acetat, toluen C16H16N5NaO7S2 - Bột trắng vàng - Dễ tan nước, tan methanol, thực tế không tan ether C25H26N9NaO8S2 - Bột trắng vàng - Dễ tan nước, tan methanol, tan ethanol 96% C16H17N3O5S.H2O ... thực đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng cefixim nước thải sắc kí lỏng hiệu cao? ?? Với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp xử lí mẫu điều kiện phân tích định lượng cefixim nước thải nhà máy sản... kiện sắc kí sở phép định lượng Các phương pháp định lượng áp dụng : - Phương pháp dùng chuẩn ngoại - Phương pháp dùng chuẩn nội - Phương pháp thêm chất chuẩn - Phương pháp chuẩn hóa diện tích Trong. .. phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim Nghiên cứu định lượng cefixim phong phú với nhiều loại mẫu khác Chúng xin giới thiệu số nghiên cứu định lượng cefixim 1.2.6.1 Nghiên cứu định lượng cefixim