Kỹ Thuật Pcr Đọc Kết Pcr Thiết Kế Đoạn Mồi (Primer) Kỹ Thuật Real-Time Pcr Một Số Câu Hỏi Trắc Nghiệm.pdf

MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN Nguyen Le Thanh (MRes) thanhnl@pnt edu vu 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 1 MỤC LỤC 1 Kỹ thuật PCR 2 Đọc kết quả PCR 3 Thiết kế đoạn mồi (primer) 4 Kỹ thuật Real t[.]

Nguyen Le Thanh (MRes) thanhnl@pnt.edu.vu 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT MỤC LỤC Kỹ thuật PCR Đọc kết PCR Thiết kế đoạn mồi (primer) Kỹ thuật Real-time PCR Một số câu hỏi trắc nghiệm 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT PCR 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT Khái niệm chung PCR • Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction): Khuếch đại đoạn DNA quan tâm • Sử dụng DNA polymerase để: • Sao chép DNA • Liên kết với sợi DNA mạch đơn bị tách để tạo mạch DNA bổ sung • Thời gian ngắn cho nhiều DNA • Độ nhạy (sensitivity) cao • Kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính phơi, giải mã di truyền, tạo giống với đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hoá sinh vật mức độ phân tử 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT Cơ chế chép DNA i Quá trình bán bảo tồn (Semi-conservative) ii Gốc chép (origins of replication - ori) iii Chiều 5'  3' iv Gián đoạn hai chuỗi v “Mồi“ (RNA primer) vi Protein enzyme đặc hiệu 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT Sao chép DNA – Nhân sơ 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT Cơ chế khuếch đại DNA - PCR • Kỹ thuật tổng hợp DNA thể ứng dụng kỹ thuật PCR tuân thủ nguyên tắc chép DNA thể có khác biệt: • Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho helicase • Kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq DNA polymerase) để tổng hợp DNA môi trường thích hợp • Hệ thống điều nhiệt thích hợp với đoạn mồi thiết kế chuyên biệt, chủ động 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT Cơ chế khuếch đại DNA - PCR Biến tính Tháo xoắn 94-96oC 25/10/2018 Bắt cặp 60-68oC TT NCYSH DHYK PNT Kéo dài chuỗi 70-72oC 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT Các giai đoạn phản ứng PCR phịng thí nghiệm 1X 30-35X 25/10/2018 1X TT NCYSH DHYK PNT 10 Một số câu hỏi • So sánh PCR chế chép DNA tế bào? • Nhiệm vụ Taq DNA polymerase • Nhiệm vụ primer? • Sau số chu kz định, số lượng sản phẩm PCR bị giới hạn, sao? • Các yếu tố cần điều chỉnh để tối ưu hóa phản ứng PCR? 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 26 ĐIỆN DI ĐỌC KẾT QUẢ PCR 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 27 Làm để đọc kết PCR? • PCR cổ điển: • Thu thập kết sau 35-40 chu kz • Kết gì? 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 28 Làm để đọc kết PCR? • Kết PCR = DNA quan tâm • Kiểm chứng: • Sự diện • Độ dài • Lượng??? • Trực quan kết PCR: • Nhuộm DNA • Điện di khn đỡ (gel) • Các loại thuốc nhuộm • Ethidium Bromide (EtBr): r, ph bin, c hi ã SYBRđGold v SYBRđSafe • GelRed™ GelGreen™ • V.v… 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 29 Nguyên tắc điện di • Điện di: tượng dịch chuyển phân tử tích điện tác động điện trường • Phân chia phân tử DNA, RNA, hay protein • Khối lượng, điện tích • Khi phân tử tích điện đặt điện trường, chúng dịch chuyển cực (+) (-) tùy theo điện tích chúng • Khuôn đỡ (support matrix): giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose polyacrylamide gel • Kỹ thuật điện di giá rắn (agarose polyacrylamide): • Dung dịch đệm để dẫn điện • Gel để phân tách phân tử • Chất nhuộm phát vị trí phân tử gel • Agarose gel phân tách hiệu phân tử DNA RNA có kích thước từ 20 bp-20 kb • Polyacrylamide gel dùng để phân tách phân tử protein phân tử DNA có chiều dài 100 oC  đơng • Gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt độ • Các chuỗi polymer liên kết chéo với tạo thành hệ thống mạng lưới với kích thước mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose phản ứng polymer hố • Dung dịch đệm: TAE hay TBE để tạo mơi trường thích hợp cho ion di chuyển 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 31 EthBr EthBr 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 32 Điện di gel Agarose (Khơng biến tính) • Mặt phẳng ngang • DNA mang điện tích (-) nên chuyển từ cực (-) sang (+) điện trường • Tách đoạn DNA với kích thước khác • Tốc độ dịch chuyển phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường, v.v • Thường: DNA kích thước nhỏ di chuyển nhanh xa gel, DNA kích thước lớn di chuyển chậm gần gel • Các phân t nucleic acid có khối lươṇ g điêṇ tích khác đươc̣ tách • Vị trí DNA gel xác định trực tiếp • Nhuộm ethidium bromide (EtBr) nồng độ thấp phát tia UV 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 33 Điện di polyacrylamide (Khơng biến tính Biến tính) • Khơng biến tính: Khơng phá vỡ cấu trúc phân tử • Biến tính: Phá vỡ cấu trúc phân tử (Protein 3D  mạch thẳng) • Dùng để phân tách phân tử protein, đoạn DNA, RNA Gel rót vào hai kính ngăn cách miếng đệm để ngăn không cho polyacrylamide tiếp xúc với không khí • Chiều dài gel: 10 – 100 cm • Nồng độ gel: 3.5% – 20% ( tuz thuộc vào kích thước phân tử protein DNA) 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 34 Điện di polyacrylamide (Không biến tính Biến tính) Điện di khơng biến tính • Ít ảnh hưởng đến hoạt tính, cấu trúc chất cần phân tách • Điện di mơi trường đệm pH kiềm (8-9) nhằm để protein tích điện âm • Đối tượng: protein, DNA Điện di biến tính • Trong điện di biến tính: đệm mẫu đệm chạy protein bổ sung thêm chất sau: • SDS (Sodium dodesyl sulphate): phá vỡ cấu trúc bậc 2, protein làm cho cấu trúc hcuooix protein duỗi thẳng tồn phận tử tích điện âm • Các chất khử: β – mecaptoethanol (β-ME) hay DTT có tác dụng cắt cầu ddisulfide (-S-S-) nhiệt độ 95oC – 100oC giúp protein tồn dạng chuỗi polypeptide tách dời • Đới tượng: protein 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 35 Ví dụ: Dùng PCR để phát Mycobacterium tuberculosis máu bệnh nhân • • • • Đoạn trình tự IS6110 đặc thù cho Mtb (419bp) Primer có sẵn Thiết kế phản ứng PCR Điện di gel agarose Mẫu kiểm tra DNA từ máu bệnh nhân Chứng dương Mẫu DNA Mtb Chứng âm Nước, không DNA khuôn Tải FULL (80 trang): https://bit.ly/3PXo5oU Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 36 Mẫu Mẫu (+) 25/10/2018 (-) TT NCYSH DHYK PNT 37 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 38 Tải FULL (80 trang): https://bit.ly/3PXo5oU Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 39 Điện di (+) • • • (-) Chứng dương: thang DNA/RNA (marker/ladder) Chứng âm: nước Để làm gì? 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 7175639 40 ...MỤC LỤC Kỹ thuật PCR Đọc kết PCR Thiết kế đoạn mồi (primer) Kỹ thuật Real-time PCR Một số câu hỏi trắc nghiệm 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT PCR 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT Khái niệm chung PCR •... ưu hóa phản ứng PCR? 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 26 ĐIỆN DI ĐỌC KẾT QUẢ PCR 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 27 Làm để đọc kết PCR? • PCR cổ điển: • Thu thập kết sau 35-40 chu kz • Kết gì? 25/10/2018... Kết gì? 25/10/2018 TT NCYSH DHYK PNT 28 Làm để đọc kết PCR? • Kết PCR = DNA quan tâm • Kiểm chứng: • Sự diện • Độ dài • Lượng??? • Trực quan kết PCR: • Nhuộm DNA • Điện di khn đỡ (gel) • Các loại