Nghiên cứu tái sinh giống lúa DT22 và Khang dân đột biến (KDĐB) phục vụ cho kỹ thuật chuyển gen pptx

Môi trường N6 bổ sung 2 mg/l 2,4D thường được sử dụng trong nuôi cấy mô lúa và để tạo callus từ phôi trưởng thành.. Cho điểm và đánh giá khả năng nhân callus trên nền môi trường 6 Môi t

NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG LÚA DT22

VÀ KHANG DÂN ĐỘT BIẾN (KDĐB) PHỤC VỤ CHO KỸ THUẬT CHUYỂN GEN

Phí Công guyên, guyễn Thuý Điệp, Kiều Thị Dung, Trần Minh Hoa, Trần Duy Dương, Đặng Trọng Lương

SUMMARY

Study on the plant regeneration of DT22 and mutant Khang dan (KDĐB) rice

cultivars from matured embryo calli for rice transformation

Two rice cultivars DT22 and KDĐB were used to induce calli and plant regeneration from matured embryo calli Callus induction, callus proliferation and regeneration ratio were evaluated on MS (Murashige Skoog, 1962) and 6 (Chu et al, 1978) media supplemented with different concentrations of phytohormon 6D supplemented with 2 mg/l 2,4D was the most effective on callus induction and callus proliferation of both DT22 and KDĐB cultivars DT22 cultivar was highest regenerated on MS medium supplemented with 2 mg/l BAP (BL2 medium) Regeneration ratio equal to 74.1% and regenerated shoot were healthy and uniform Healthy and uniform shoot were induced as 72.6% of regeneration ratio on MS medium supplemented with 2 mg/l BAP and 0.1 mg/l AA (A4 medium)

Keywords: Rice, Callus, Plant regeneration

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Đã có rất nhiều loại mô khác nhau được

dùng trong nghiên cứu tái sinh ở lúa

(Bhaskaran và Smith, 1988) Tuy nhiên, các

mô phôi thường được ứng dụng nhiều trong

nuôi cấy in vitro nhờ có khả năng tái sinh

cao của các callus được tạo thành

(Maggioni và cs., 1989) Sự tái sinh từ

callus đạt được từ rất lâu đối với các giống

thuộc Japonica spp (Nishi và cs., 1973)

Tiềm năng tạo thành callus và sự tái sinh đã

được nhiều báo cáo nhắc đến như một đặc

điểm khác biệt và hiệu quả tái sinh ở các

giống lúa Indica vẫn gặp những vấn đề khó

khăn do đặc tính di truyền của chúng (Toki,

1997) Do vậy, các chiến lược nhằm cải thiện hiệu quả tái sinh ở lúa được tiến hành nhiều trong những thập kỷ qua (Kyozuka và cs., 1988; Raman và cs., 1999) Các giống

lúa Japonica thường có khả năng tái sinh

cao trong khi đó sự thành công của các

giống lúa Indica vẫn còn hạn chế, đặc biệt

là đối với nhóm 1 (Kyozuka và cs., 1988; Raman và cs., 1994) Khả năng tái sinh liên quan nhiều đến hiệu quả biến nạp Vì vậy,

để nâng cao hiệu quả của quá trình biến nạp

gen vào lúa, chúng tôi tiến hành: “ ghiên cứu tái sinh giống lúa DT22 và Khang dân đột biến (KDĐB) phục vụ cho kỹ thuật chuyển gen”

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu nghiên cứu

Giống lúa DT22 và giống lúa Khang

dân đột biến (KDĐB) có nguồn gốc và xuất

xứ từ Viện Di truyền Nông nghiệp

Nuôi cấy mô tái sinh sử dụng môi

trường cơ bản MS (Murashige Skoog,

1962) và môi trường N6 (Chu và cs., 1978)

bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng ở

nồng độ khác nhau

2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nuôi cấy mô tạo callus và

tái sinh cây sử dụng phôi trưởng thành được

kết hợp từ phương pháp của IRRI và phòng

thí nghiệm Chọn giống cây trồng, Đại học

Kyushu, Nhật Bản

2.1 Khử trùng mẫu

Sử dụng 2 hóa chất khử trùng hạt khác nhau là HgCl2 1‰ trong 10 phút và NaClO 10% trong 2 lần x 20 phút

2.2 Phát sinh và nhân callus

- Môi trường N6D: N6 + 2 mg/l 2,4D +

3000 mg/l proline + 300 mg/l Casein + 3% đường + 0,3% phytagel)

- Sau 10 ngày các callus được tách ra

và chuyển vào các môi trường sau:

+ LD: Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) bổ sung 3% đường, 0,3% phytagel, 100 ml/l nước dừa và các loại vitamin, casein,

+ N6D: Môi trường N6 (Chu, 1978) bổ sung 3% đường, 0,3% phytagel và các loại vitamin, nước dừa, casesin,

Công thức

thí nghiệm 2,4D (mg/ml)

Casein (mg/ml)

Thiamin (mg/ml)

Tryptophan (mg/ml) Proline (mg/ml)

Công thức

thí nghiệm

2,4D

(mg/ml)

Casein (mg/ml)

Tryptophan (mg/ml)

Proline (mg/ml)

Glutamin (mg/ml)

Asparagin (mg/ml)

Nước dừa (ml/l)

2.3 Tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh

Callus lúa được nuôi cấy trên môi

trường nhân callus sau 4 tuần được cấy chuyển sang môi trường tái sinh và tạo chồi

Công thức

thí nghiệm

BAP (mg/ml)

Kinetin (mg/ml)

NAA (mg/ml)

Công thức thí nghiệm

BAP (mg/ml)

Kinetin (mg/ml)

NAA (mg/ml)

A1 2,0 1,0 0,1 BL5 3,5 0 0

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Kết quả vào mẫu nuôi cấy in vitro

Trong thí nghiệm vào mẫu in vitro,

chúng tôi sử dụng 2 hóa chất khử trùng hạt

khác nhau là HgCl2 và NaClO và đánh giá 2

chỉ tiêu là mức độ nhiễm và mức độ phát

triển callus từ hạt trưởng thành Kết quả ở

Bảng 1 cho thấy phương pháp khử trùng

bằng HgCl2 cho tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với

phương pháp khử trùng bằng NaClO (2,0 ±

0,5% ở KDĐB so với 9,0 ± 1,5%; 2,5 ±

0,5% ở DT22 so với 7,0 ± 5,0%) nhưng tỷ

lệ tạo callus ở phương pháp này lại thấp hơn so với khi khử trùng bằng NaClO (65,0

± 2,0% so với 77,0 ± 0,5% ở KDĐB; 74,0 ± 2,0% so với 86,0 ± 1,5% ở DT22 Sử dụng HgCl2 để khử trùng mẫu cho tỷ lệ nhiễm

thấp thích hợp khi thiết lập mẫu in vitro với

số lượng mẫu nhỏ Tuy nhiên, khi sử dụng

số lượng mẫu lớn, chúng tôi khuyến cáo nên sử dụng NaClO với mục đích thân thiện hơn với môi trường

Bảng 1 Kết quả vào mẫu in vitro

Hóa chất

khử trùng

Số lượng mẫu Tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ tạo

callus Số lượng mẫu Tỷ lệ nhiễm

Tỷ lệ tạo callus

2 Đánh giá sự phát sinh và nhân callus

Quá trình thiết lập mẫu nuôi cấy in

vitro ban đầu sử dụng môi trường N6D

(N6D: N6 + 2 mg/l 2,4D + 3000 mg/l

proline + 300 mg/l casein + 3% đường +

0,3% phytagel) Môi trường N6 bổ sung

2 mg/l 2,4D thường được sử dụng trong

nuôi cấy mô lúa và để tạo callus từ phôi

trưởng thành Tuy nhiên chúng tôi bổ sung

thêm casein và proline nhằm tăng cường khả năng tạo callus và sử dụng phytagel thay vì sử dụng agar-agar Callus được hình

thành sau 10 ngày nuôi cấy in vitro được

tách ra và tiến hành đánh giá khả năng nhân callus khi sử dụng các môi trường nhân callus khác nhau Khả năng nhân callus được đánh giá và cho điểm theo thang (+); (++); (+++); (++++), căn cứ vào khả năng nhân callus tăng dần

Bảng 2 Cho điểm và đánh giá khả năng nhân callus trên nền môi trường MS

Môi trường

DT22 + ++ ++ +++ ++ ++ + ++

Bảng 3 Cho điểm và đánh giá khả năng nhân callus trên nền môi trường 6

Môi trường

Trong các nồng độ 2,4D được sử dụng

ở cả 2 công thức môi trường, thì nồng độ 2

mg/l 2,4D cho khả năng tạo callus cao nhất

ở cả 2 giống DT22 và KDĐB Nồng độ này

đã được sử dụng nhiều trong các thí nghiệm

tạo callus Điều đó gợi ý rằng, các giống lúa

có khả năng tạo callus cao nhất khi nồng độ

2,4D ngoại sinh được bổ sung trong môi trường nuôi cấy là 2 mg/l Do vậy, nồng độ

2 mg/l 2,4D có bổ sung các hợp chất như casein (300 mg/l) và proline (3000 mg/l) có thể áp dụng để tạo và nhân callus cho các thí nghiệm tạo callus phục vụ kỹ thuật tái

sinh và chuyển gen

Ảnh 1 Mẫu lúa DT22 và KDĐB trên môi trường phát sinh và nhân callus

Trong một số tài liệu, môi trường MS

được cho là có hiệu quả cao hơn so với N6

để tạo callus (A.S.M.T Bayawickrama và

Toyoaki Anai, 2006) Nhưng kết quả thu

được của chúng tôi chứng minh điều ngược

lại Trong mọi nồng độ 2,4D khác nhau, môi

trường N6 cho kết quả tạo callus cao hơn so

với MS tương ứng Vì thế chúng tôi cho

rằng các giống lúa khác nhau có thể có phản

ứng khác nhau trong điều kiện dinh dưỡng

có nhiều khác biệt Việc sử dụng cả 2 loại

môi trường để tạo callus ở lúa sẽ giúp các

nhà khoa học tìm ra được môi trường thích

hợp nhất trong công tác nghiên cứu này

3 Kết quả tái sinh cây từ callus

Trong các tổ hợp các chất điều hoà sinh trưởng được sử dụng, BAP và kinetin thuộc nhóm cytokinin được kết hợp hoặc không kết hợp với NAA thuộc nhóm auxin Dựa vào đánh giá về mặt hình thái, BAP cho khả năng tạo chồi tái sinh ở các nồng độ khác nhau cao hơn so với kinetin

DT22

Ảnh 2 Mẫu lúa tái sinh của giống DT22 và KDĐB

Ở nồng độ BAP 2 mg/l khả năng tạo

chồi và chất lượng các chồi được tạo thành

tốt nhất Ở môi trường BL2 (2 mg/l BAP),

giống DT22 phản ứng tốt hơn so với giống

KDĐB với hình thái cụm chồi xanh, khoẻ và

đồng nhất Tỷ lệ tạo chồi trung bình là

74,1% đối với giống DT22 và 66,1% đối với

giống KDĐB Đây cũng là môi trường cho

tỷ lệ tạo chồi cao nhất so với các môi trường

còn lại được sử dụng để tái sinh giống

DT22 Với các tổ hợp môi trường có bổ

sung thành phần kinetin thì ở nồng độ 2 mg/l

kinetin khả năng tạo chồi và tỷ lệ tạo chồi

cũng cao nhất trong cả 2 giống được nghiên

cứu Tuy nhiên, xét trên cả 2 tiêu chuNn là tỷ

lệ tạo chồi và chất lượng chồi được tạo thành

đều không cao bằng sử dụng môi trường với

nồng độ 2 mg/lBAP Tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt

cao nhất là 58,4% đối với giống DT22 ở môi

trường K3 (2 mg/l kinetin) (bảng 4) Trong khi đó, cũng với môi trường này, tỷ lệ tạo chồi của giống KDĐB chỉ đạt được là 53,7% Chất lượng chồi tạo thành cũng không cao khi chồi thường bị xoăn, yếu và

có tạo rễ Vì vậy, trong tái sinh cây của 2 giống DT22 và KDĐB sử dụng môi trường tái sinh với chất kích thích sinh trưởng là BAP sẽ cho hiệu quả cao hơn môi trường có

sử dụng kinetin Sự khác biệt là đối với môi trường tái sinh A4 có bổ sung BAP 2 mg/l, giống KDĐB có khả năng tạo cụm chồi xanh, đồng nhất và khoẻ hơn khi trong môi trường có kết hợp với NAA nồng độ 0,1 mg/l Do vậy, môi trường thích hợp để tái sinh giống DT22 là môi trường BL2 có

bổ sung 2 mg/l BAP còn môi trường A4 có

bổ sung 2 mg/l BAP và 0,1 mg/lNAA thích hợp để tái sinh giống KDĐB

Bảng 4 Đánh giá tỷ lệ tái sinh cây từ callus và hình thái chồi

có tạo rễ

61,4 ± 2,7 Cụm chồi xanh, vừa phải,

xuất hiện nhiều rễ

có tạo rễ

60,4 ± 2,8 Cụm chồi xanh, vừa phải,

xuất hiện nhiều rễ

BL1 68,3 ± 2,0 Chồi xanh, thẳng, sức sống

trung bình

64,6 ± 1,5 Chồi xanh, thẳng, sức sống

trung bình BL2 74,1 ± 2,5 Cụm chồi xanh, đồng nhất, 66,1 ± 3,1 Chồi xanh, thẳng, sức sống

khoẻ trung bình BL3 71,4 ± 3,3 Cụm chồi xanh, đồng nhất,

khoẻ

65,8 ± 2,3 Chồi xanh, thẳng, sức sống

trung bình

yếu BL5 66,4 ± 1,5 Chồi xanh, xoăn, yếu 61,8 ± 2,7 Chồi xanh, kích thước vừa, yếu BL6 64,2 ± 3,0 Chồi xanh, xoăn, yếu 60,3 ± 2,9 Chồi xanh, kích thước vừa, yếu

K5 49,1 ± 1,6 Chồi xanh, mảnh, xoắn, có rễ 52,2 ± 3,1 Chồi xanh, mảnh yếu, có rễ

IV KẾT LUẬN

1 Hiệu quả khử trùng tốt nhất đối với

giống DT22 và KDĐB là sử dụng

NaClO 10% trong thời gian 20 phút;

2 Môi trường tạo callus thích hợp cho 2

giống DT22 và KDĐB là: N6 + 2 mg/l

2,4D + 3000 mg/l proline + 300 mg/l

casein + 3% đường + 0,3% phytagel

3 Môi trường tái sinh giống DT22: Môi

trường cơ bản MS (đa lượng, vi lượng,

vitamin) + 2 mg/l BAP + 100 mg/l nước

dừa + 8 g/l agar + 30 g/l đường;

4 Môi trường tái sinh giống KDĐB: Môi

trường cơ bản MS (đa lượng, vi lượng,

vitamin) + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA

+ 100 mg/l nước dừa + 8 g/l agar + 30

g/l đường

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Đỗ Hữu Ất, Bùi Huy Thuỷ, Trần Duy

Quý, guyễn Minh Công, 2001 ″Cải

tiến giống lúa thuần chất lượng nhập nội

bằng phương pháp đột biến thực

nghiệm” Kết quả nghiên cứu khoa học (2000-2001) Viện Di Truyền Nông nghiệp, Bộ NN & PTNT

2 A.S.M.T Abayawickrama and Toyoaki Anai, 2006 Coparison of Regeneration

Efficiency of Different Genotype of

Indica Rice cultivars Bull Fac Agr.,

Saga Univ 92: 17-23

3 Bhaskaran S, Smith RH., 1988

Enhanced somatic embryogenesis in

Sorghum biocolor L from shoot tip

culture In vitro Cell Dev Biol 24:65-70

4 Hossain, M.A and M asreen., 1997

In vitro regeneration of six Indica rice

cultivars Bangladesh J Biochem., 3: 95-98

5 Kyozuka J, Otoo E, et al., 1988 Plant

regeneration from protoplast of

Indica rice: genotype differences in

culture response Theor Appl Genet 76:887-890

6 Toki S., 1997 Rapid and efficient

Agrobacterium-mediated transformation

of rice Pl Mol Biol Rep 15: 16-21

5gười phản biện: GS.TSKH Trần Duy Quý