I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum, thuộc họ Solanaceae. Ngày nay, khoai tây trở thành cây lương thực quan trọng, trên khắp thế giới từ khoai tây người ta đã chế biến ra hàng trăm món ăn khác nhau, thơm ngon, rẻ tiền, rất bổ dưỡng vì trong khoai tây có chứa các vitamin, khoáng chất và phân loại của chất phytichemical như carotenoids và phenol tự nhiên... Một củ khoai tây còn vỏ có kích thước trung bình 150g, cung cấp 27 mg vitamin C (45% giá trị hàng ngày), 620 mg kali (18%), 0.2 mg vitamin B6 (10%) và một lượng rất nhỏ thiamin, riboflavin, folate, niacin, magie, photpho, sắt, kẽm… Nghiên cứu còn cho thấy khoai tây không chỉ là lương thực, mà còn là dược phẩm, có tính chất chữa bệnh. GS.Venket Rao khoa dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada cho hay, trong khoai tây có nhiều chất chống ôxy hóa. Nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát triển của ung thư, kích thích tiêu hóa và chữa viêm tuyến dịch vị và một số bệnh khác. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy khoai tây rất giàu sterol, giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể. Tuy nhiên, người nông dân đang phải đối mặt với tình trạng gây hại của sâu, bệnh trên khoai tây, đặc biệt là bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây ra. Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu là dựa vào các phương pháp truyền thống và sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả cao và đặc biệt việc sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản, sức khỏe và môi trường sống của con người. Vì vậy, đề xuất một biện pháp phòng trừ hiệu quả và thân thiện với môi trường trở thành vấn đề cấp bách hiện nay. Vi khuẩn gây bệnh E. carotovora subsp. carotovora sử dụng quorum sensing (QS) như một cơ chế trao đổi thông tin giữa các tế bào và phụ thuộc mật độ quần thể. Trong cơ chế này, NacylLhomoserine lactones (AHLs) đóng vai trò như các chất tự cảm ứng (autoinducer) và cũng là các phân tử tín hiệu có mặt trong hầu hết các vi khuẩn gây bệnh Gram âm. Theo các nghiên cứu gần đây, một nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy AHLs qua cơ chế quorum quenching (QQ) đã được sử dụng trong phòng trừ sinh học bệnh thực vật. Do vậy, nhóm tác giả tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phân hủy NacylLhomoserine lactones (AHLs) trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây.
SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015) Tên đề tài: ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH PHÂN HỦY N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONES (AHLs) TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN KHOAI TÂY Lĩnh vực: Sinh học tế bào phân tử NGƯỜI HƯỚNG DẪN - TS Hoàng Hoa Long - Đơn vị công tác: Viện Di truyền nông nghiệp, KM2, đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội TÁC GIẢ: Vũ Văn Hiệp Lớp: 12 Hóa Trường: THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam Nguyễn Chu Hải Linh Lớp: 12 Toán Trường: THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam Hà Nội, tháng 11 năm 2014 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ AND Acid Deoxyribo Nucleic AHLs N-acyl-L-homoserine lactones ARN Acid Ribo Nucleic CV026 Chromobacterium violaceum CFU (Colony Forming Unit) đơn vị hình thành khuẩn lạc CS Cộng Ecc Erwinia cartovora subsp carotovora Ep Endophytes (vi khuẩn nội sinh) LB Môi trường Luria Bertani medium PCR Polymerase chain reaction QQ Quorum Quenching QS Quorum Sensing TB Tế bào VKNS Vi khuẩn nội sinh YPDA Yeast Peptone Dextrose Agar DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn 10 Hình 2: Thí nghiệm thử khả sản sinh AHLs vi khuẩn 12 Hình 3: Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs 14 Hình 4: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 môi trường YPDA sau 24 nuôi cấy 28oC .18 Hình 5: Triệu chứng bệnh sau tái nhiễm chủng P.2.6.1 khoai tây sau 24h 19 Hình 6: Khả sản sinh AHLs chuỗi ngắn chủng vi khuẩn gây bệnh P.2.6.1 21 Hình 7: Các chủng VKNS có khả phân hủy AHLs chuỗi ngắn 22 Hình 8: Sản phảm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA chủng VKNS 23 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Độc tính chủng vi khuẩn phân lập từ củ khoai tây bị bệnh thối nhũn 19 Bảng 2: Khả sản sinh AHLs chủng vi khuẩn gây bệnh 20 Bảng 3: Các chủng VKNS có khả phân hủy AHLs 21 Bảng 4: Hiệu lực phòng trừ bệnh thối nhũn chủng VKNS 1.6 22 MỤC LỤC MỤC LỤC I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI II TỔNG QUAN VẤN ĐỀ Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Phương pháp chế Các giai đoạn tiến hành Tính mới, tính thời đề tài Ý nghĩa thực tiến đề tài III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ .8 3.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 3.1.3 Môi trường dùng nghiên cứu 3.1.4 Dụng cụ, thiết bị 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Ecc .9 3.2.2 Phân lập chủng VKNS từ củ khoai tây 12 3.2.3 Tuyển chọn chủng VKNS có khả phân hủy AHLs điều kiện in vitro in vivo 13 3.2.4 Đánh giá khả ức chế phát triển vị khuẩn gây bệnh thối nhũn triệu chứng bệnh lát cắt củ khoai tây VKNS 14 3.2.5 Phân loại vi khuẩn VKNS đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng VKNS 16 3.2.6 Đánh giá khả tồn chủng VKNS bên mơ chủ 17 3.2.7 Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu (đang tiến hành) 18 3.3 Kết nghiên cứu 18 3.3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn từ củ khoai tây 18 3.3.2 Đánh giá độc tính tác nhân gây bệnh cũ khoai tây phịng thí nghiệm 18 3.3.3 Khả sản sinh AHLs chủng vi khuẩn gây bệnh 19 3.3.4 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn nội sinh từ củ khoai tây 21 3.3.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn nội sinh có khả phân hủy AHLs in vitro in vivo 21 3.3.6 Đánh giá khả ức chế bệnh thối nhũn lát cắt củ khoai tây chủng VKNS 1.6 22 3.3.7 Phân loại đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 23 3.3.8 Khả tồn chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 mô chủ .24 IV KẾT LUẬN 25 V TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 I Tài liệu tham khảo tiếng Việt .26 II Tài liệu tham khảo tiếng Anh 26 I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Cây khoai tây có tên khoa học Solanum tuberosum, thuộc họ Solanaceae Ngày nay, khoai tây trở thành lương thực quan trọng, khắp giới từ khoai tây người ta chế biến hàng trăm ăn khác nhau, thơm ngon, rẻ tiền, bổ dưỡng khoai tây có chứa vitamin, khống chất phân loại chất phytichemical carotenoids phenol tự nhiên Một củ khoai tây cịn vỏ có kích thước trung bình 150g, cung cấp 27 mg vitamin C (45% giá trị hàng ngày), 620 mg kali (18%), 0.2 mg vitamin B6 (10%) lượng nhỏ thiamin, riboflavin, folate, niacin, magie, photpho, sắt, kẽm… Nghiên cứu cho thấy khoai tây khơng lương thực, mà cịn dược phẩm, có tính chất chữa bệnh GS.Venket Rao khoa dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada cho hay, khoai tây có nhiều chất chống ơxy hóa Nó có khả ngăn ngừa q trình lão hóa, hạn chế phát triển ung thư, kích thích tiêu hóa chữa viêm tuyến dịch vị số bệnh khác Những nghiên cứu gần cho thấy khoai tây giàu sterol, giúp tăng cường khả miễn dịch cho thể Tuy nhiên, người nông dân phải đối mặt với tình trạng gây hại sâu, bệnh khoai tây, đặc biệt bệnh thối nhũn khoai tây vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora gây Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu dựa vào phương pháp truyền thống sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Tuy nhiên, biện pháp khơng có hiệu cao đặc biệt việc sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản, sức khỏe môi trường sống người Vì vậy, đề xuất biện pháp phịng trừ hiệu thân thiện với mơi trường trở thành vấn đề cấp bách Vi khuẩn gây bệnh E carotovora subsp carotovora sử dụng quorum sensing (QS) chế trao đổi thông tin tế bào phụ thuộc mật độ quần thể Trong chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai trị chất tự cảm ứng (autoinducer) phân tử tín hiệu có mặt hầu hết vi khuẩn gây bệnh Gram âm Theo nghiên cứu gần đây, nhóm vi khuẩn có khả phân hủy AHLs qua chế quorum quenching (QQ) sử dụng phòng trừ sinh học bệnh thực vật Do vậy, nhóm tác giả tiến hành thực đề tài nghiên cứu: "Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phân hủy N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây" II TỔNG QUAN VẤN ĐỀ Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập định danh chủng vi khuẩn nội sinh phân hủy AHLs có khả ức chế phát triển vi khuẩn thối nhũn từ khoai tây với hiệu cao ổn định - Thử nghiệm chủng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây vi khuẩn Ecc gây khoai tây - Tìm quy trình xử lý VKNS để phịng trừ bệnh hiệu Đối tượng nghiên cứu - Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn - Mẫu củ khoai tây bệnh - Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia cartovora subsp carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây - Chủng vi khuẩn thị Chromobacterium violaceum CV026 có khả phản ứng với phân tử AHLs hình thành sắc tố màu tím (violacein) Phương pháp chế * Phương pháp nghiên cứu - Phân lập VKNS vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp khử trùng bề mặt tiêu chuẩn - Phân loại VKNS vi khuẩn gây bệnh dựa xác định đặc tính sinh lý sinh hóa giải trình tự gen 16S rRNA - Tuyển chọn chủng có khả phân hủy AHLs in vitro in vivo theo phương pháp đồng nuôi cấy với reporter strains Chromobacterium violaceum CV026 - Đánh giá độ an toàn sinh học chủng VKNS dựa sở liệu DSMZ * Cơ chế Đề tài tập trung khai thác tiềm vi khuẩn nội sinh ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh thối nhũn, làm rõ chế tương tác vi khuẩn nội sinh vi khuẩn gây bệnh thông qua phá hủy mạng lưới QS Vấn đề ý nghĩa khoa học loại bệnh định trồng mà giúp tạo sở để nghiên cứu điều trị bệnh người vi khuẩn phụ thuộc tín hiệu QS gây Các giai đoạn tiến hành Bước 1: Phân lập chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn Ecc Bước 2: Phân lập chủng VKNS từ củ khoai tây Bước 3: Tuyển chọn chủng VKNS có khả phân hủy AHLs điều kiện in vitro in vivo Bước 4: Đánh giá khả ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh thối nhũn triệu chứng bệnh lát cắt củ khoai tây VKNS Bước 5: Phân loại, đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng VKNS Bước 6: Đánh giá khả tồn chủng VKNS bên mơ chủ Bước 7: Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu (đang tiến hành) Tính mới, tính thời đề tài Ở Việt Nam: Hiện chưa có nghiên cứu vè chế gây bệnh vi khuẩn gây bệnh thối nhũn sử dụng chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng để phân hủy AHLs vi khuẩn gây bệnh phòng trừ bệnh thối nhũn vi khuản gây hại trồng Trên giới: Đã có nhiều nghiên cứu theo hướng Hầu hết nghiên cứu sử dụng vi khuẩn phân lập từ đất vi khuẩn biểu mô Do điểm đè tài sử dụng chủng vi khuẩn nội sinh Ý nghĩa thực tiến đề tài Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây góp phần tạo sản phẩm nơng sản an tồn, làm giảm sử dụng thuốc hóa học giúp bảo vệ mơi trường, sức khỏe người tăng thu nhập cho người nông dân Trên sở mở rộng ứng dụng để phịng trừ bệnh nhiều lồi trồng khác III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian: Từ tháng 05/2014 đến - Địa điểm: Bộ môn Bệnh Học Phân Tử - Viện Di Truyền Nông Nghiệp 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu - Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn - Mẫu củ khoai tây bệnh - Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia cartovora subsp carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây - Chủng vi khuẩn thị Chromobacterium violaceum CV026 có khả phản ứng với phân tử AHLs hình thành sắc tố màu tím (violacein) 3.1.3 Mơi trường dùng nghiên cứu + Môi trường YPDA dùng phân lập nuôi cấy vi khuẩn: Cao nấm men 1,5 g; Peptone 0,3 g; Glucose 1,5 g; Nước cất 1000 ml; Agar 20 g; pH 7,2; Khử trùng 121oC 15 phút + Môi trường LB dùng nuôi cấy, thử khả phân hủy AHLs: Tryptone 10g; Cao nấm men 5g; NaCl 5g; Nước cất 1000 ml; Agar 20; pH 7,2; Kkhử trùng 121ºC 15 phút + Sữa gầy (skimmed milk) dùng bảo quản chủng vi khuẩn: 10% skim milk; 0,05 % L-Glutamic Acid; khử trùng 121ºC 15 phút 3.1.4 Dụng cụ, thiết bị Các thiết bị máy móc Bộ mơn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, bao gồm số thiết bị như: tủ cấy an toàn sinh học NUAIRE (Mỹ), nồi khử trùng OMRON (Nhật Bản), máy ly tâm lạnh UNIVERSAL (Mỹ), cân điện tử AND (Anh), lị vi sóng, máy chụp ảnh gel, máy đo pH HORIBA (Nhật Bản), máy PCR, tủ lạnh giữ giống VESTROST (Đan Mạch), tủ nuôi cấy JEIOTECH (Hàn Quốc), bể điện di MUPID (Nhật Bản), tủ sấy LENTON (Anh), máy khuấy từ FISHER (Mỹ)… Dụng cụ: đĩa Petri, Pipette loại, ống Fancol, ống nghiệm, ống eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (50, 100, 250 ml), bình Schott, que cấy… 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Ecc 3.2.1.1 Điều tra thu thập mẫu bệnh - Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn thu thập từ chợ đầu mối địa bàn Hà Nội cánh đồng trồng khoai tây khu vực Thường Tín, Đơng Anh, Sóc Sơn - Các mẫu bệnh thu dựa triệu chứng thối nhũn điển hình: mơ bệnh bị thối, có màu kem đến màu nâu, ướt, nhũn Quá trình thối bắt đầu bề mặt củ ăn sâu vào bên Ranh giới mô bệnh khỏe rõ ràng đường viền tối màu đen (Hình 1) Thường thối nhũn khơng có mùi giai đoạn đầu phân hủy, có xâm nhiễm thứ cấp có mùi khó chịu Hình 1: Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn Mẫu bệnh thu thập để riêng biệt túi báo, bảo quản nhiệt độ 4oC phân lập vi khuẩn gây bệnh 3.2.1.2 Phân lập vi khuẩn gây bệnh Phân lập vi khuẩn gây bệnh tiến hành theo phương pháp Furuya cộng (2002) theo bước sau: - Rửa mẫu vịi nước sau xịt cồn 70% tồn mẫu - Cắt miếng nhỏ (1x1cm) vùng bị bệnh vùng không bị bệnh điểm khác mẫu bệnh, sau đặt vào đĩa Petri khử trùng - Nhỏ 1ml nước cất khử trùng vào sau nghiền nát để lấy dịch gốc Chuẩn bị ống eppendorf 1.5ml, ống chứa 900µl nước cất khử trùng - Hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từ ống nhỏ sang ống làm ống thứ để nồng độ pha lỗng - Lấy 100µl từ ống eppendorf với nồng độ pha loãng nhỏ vào đĩa môi trường YPDA trang bề mặt đĩa - Để mẫu tủ 28oC, sau 24 kiểm tra khuẩn lạc Mô tả đặc điểm khuẩn lạc đĩa, sau chuyển cấy vào môi trường YPDA - Bảo quản chủng vi khuẩn phân lập sữa tách béo 10% -20 C để tiến hành thí nghiệm o 3.2.1.3 Đánh giá độc tính tác nhân gây bệnh củ khoai tây phòng thí nghiệm Độc tính tác nhân gây bệnh đánh giá phịng thí nghiệm 10 tục hút 100 µl dịch từ ống nhỏ sang ống làm ống thứ để nồng độ pha lỗng Lấy 100 µl từ ống pendorf với nồng độ pha lỗng nhỏ vào đĩa mơi trường YPDA trà bề mặt đĩa Để mẫu tủ 28oC, sau 24h kiểm tra khuẩn lạc Mô tả đặc điểm khuẩn lạc đĩa, sau chuyển cấy vào môi trường YPDA Bảo quản chủng VKNS phân lập sữa gầy (skimmed milk) 10% -20oC để tiến hành thí nghiệm 3.2.3 Tuyển chọn chủng VKNS có khả phân hủy AHLs điều kiện in vitro in vivo Khả phân hủy AHLs vi khuẩn gây bệnh tiến hành theo phương pháp đồng nuôi cấy Molina cộng (2003) (Hình 3) với số thay đổi sau: - Chủng vi khuẩn thị CV026 chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn Ecc cấy môi trường LB YPDA tương ứng ủ 28oC 48h - Các chủng VKNS cấy môi trường YPDA ủ 28oC 24h - Các chủng VKNS cấy vạch thành đường môi trường, kèm sát hai bên chủng vi khuẩn Ecc chủng vi khuẩn thị CV026 cấy vạch thành đường, tạo thành đường cấy song song - Đối chứng dương gồm hai chủng Ecc CV026 cấy sát nhau; Đối chứng âm chủng Ecc chủng CV026 cấy riêng biệt - Mẫu để tủ 280C Lưu ý: Thí nghiệm làm nhắc lại lần kết thể sau 24h Cách đọc kết quả: - Dương tính (+): vạch cấy chủng vi khuẩn thị CV026 có màu tím sẫm - Phân hủy AHLs phần (±): vạch cấy chủng vi khuẩn thị CV026 có màu tím nhạt - Âm tính (-): vạch cấy chủng vi khuẩn thị không màu (màu khuẩn lạc vi khuẩn) (Hình 3) 13 Hình 3: Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs 3.2.4 Đánh giá khả ức chế phát triển vị khuẩn gây bệnh thối nhũn triệu chứng bệnh lát cắt củ khoai tây VKNS 3.2.4.1 Chuẩn bị lát cắt củ khoai tây - Rửa củ khoai tây vòi nước chảy cho hết bùn đất để nước - Cắt lát khoai tây khoan lỗ lát cắt khoai tây (sử dụng khoan đục lỗ thạch) - Khử trùng bề mặt lát cắt khoai tây với cồn 70% phút, NaClO (3% Cl-) + - giọt Tween 20 phút Tráng nước cất khử trùng lần - Thấm khô giấy thấm khử trùng Đặt lát cắt khoai tây vào đĩa Petri 3.2.4.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn - Chuẩn bị ống eppendorf (1.5ml) chứa 1000µl nước cất khử trùng Dùng que cấy lấy - đầu que cấy vi khuẩn (VKNS vi khuẩn gây bệnh Ecc) nuôi đĩa Petri cho vào ống nước cất, trộn kỹ máy vortex tạo thành dịch khuẩn đục (khoảng 108-109 cfu/ml) 14 3.2.4.3 Lây nhiễm Phương pháp lây nhiễm tiến hành mô tả Molina cs (2003) Phươn pháp 1: nhiễm trộn VKNS Ecc Ba lát cắt khoai tây cho chủng vi khuẩn thử nghiệm, đặt đĩa Petri riêng biệt Chuẩn bị hỗn hợp dịch khuẩn: 25µl dịch vi khuẩn nội sinh 25µl vi khuẩn gây bệnh Ecc trộn vào Đối chứng âm: 50µl nước cất vơ trùng; Đối chứng vi khuẩn gây bệnh Ecc: 25µl nước cất vơ trùng + 25µl dịch khuẩn Ecc Đĩa thí nghiệm: Dùng hỗn hợp dịch khuẩn nhỏ xung quanh thành lỗ khoan Ủ mẫu 28oC kiểm tra sau 24h Phương pháp 2: nhiễm VKNS trước 24h nhiễm Ecc sau Đối chứng âm: 50µl nước cất vơ trùng, sau 24h thêm 50µl nước cất vơ trùng; Đối chứng Ecc: 50µl nước cất vơ trùng, sau 24h thêm 50µl Ecc Đĩa thí nghiệm: Nhỏ trước 50µl VKNS sau 24h sau tiến hành nhỏ tiếp 50µl Ecc vào thành lỗ khoan Ủ mẫu 28oC kiểm tra sau 48h Phương pháp 3: nhiễm Ecc trước 24h nhiễm VKNS sau Đối chứng âm: 50µl nước cất vơ trùng, sau 24h thêm 50µl nước cất vơ trùng; Đối chứng Ecc: 50µl Ecc, sau 24h thêm 50µl nước cất vơ trùng Đĩa thí nghiệm: Nhỏ trước 50µl Ecc sau 24h sau tiến hành nhỏ tiếp 50µl VKNS vào thành lỗ khoan Ủ mẫu 28oC kiểm tra sau 48h 3.2.4.4 Đọc kết - Đọc kết sau 48h ủ 28oC - Đánh số đĩa 1, 2, (mỗi chủng đĩa) Cân miếng khoai tây lây nhiễm ghi kết - Rửa nhẹ vòi nước chảy để loại bỏ hết phần thối Cân lại trọng lượng lát cắt khoai tây sau rửa ghi kết 3.2.4.5 Phân tích kết Nhập kết trọng lượng lát cắt củ khoai tây vào Excel tính trọng lượng mơ thối rửa 15 Xử lý số liệu phân tích phương sai ANOVA phần mềm Statview version 5.0.1 (SAS Institute Inc.) để tìm mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê trọng lượng mô thối lát cắt khoai tây xử lý VKNS không xử lý VKNS 3.2.5 Phân loại vi khuẩn VKNS đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng VKNS 3.2.5.1 Phương pháp phân loại chủng VKNS Phản ứng nhân gen PCR giải trình tự gen sử dụng primer F27 5’AGAGTTTATCMTGGCTCAG-3’ R1492 5’-GRTACCTTGTTACGACTT3’ Giải trình tự gen 16S rRNA trực tiếp từ phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp Big Dye tiến hành máy ABI Sequence Detector System SDS 7700 Trình tự gen 16S rRNA phân tích chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) dựa vào sở liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) 3.2.5.2 Phương pháp đánh giá độ an toàn sinh học chủng VKNS Đánh giá độ an toàn sinh học chủng vi khuẩn nội sinh dựa Phân nhóm Prokaryotes (Vi khuẩn vi khuẩn cổ) thành nhóm nguy (risk group) Các quy định kỹ thuật tác nhân sinh học (Technical Rules for Biological Agents-TRBA466) công bố Ủy ban tác nhân sinh học Cộng hòa LB Đức (TRBA 466, 2010) theo Hướng dẫn số 2000/54/EC Hội đồng Nghị viện Châu Âu bảo vệ người lao động khỏi nguy tiếp xúc với tác nhân sinh học (Directive 2000/54/EC of the European Parliament and Council of 18.09.2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work) Theo Thông tư số 07 /TT-BYT ngày 14 tháng năm 2012) Danh mục vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm theo nhóm nguy cấp độ an toàn sinh học phù hợp kỹ thuật xét nghiệm Các loài vi khuẩn phân thành nhóm nguy đó: Nhóm 1: Khơng gây bệnh cho người Nhóm 2: Có thể gây bệnh cho người lan truyền cộng đồng, thường có biện pháp điều trị nhiễm phải Nhóm 3: Có thể gây bệnh cho người tiềm ẩn nguy lan truyền cộng đồng, có biện pháp điều trị nhiễm phải Nhóm 4: Gây bệnh nặng cho người có nguy cao lan truyền 16 cộng đồng, chưa có biện pháp điều trị thích hợp Dựa vào kết phân loại vi khuẩn trên, xác định lồi vi khuẩn khơng thuộc nhóm nguy thuộc nhóm tiếp tục sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo; lồi vi khuẩn thuộc nhóm nguy 2, ngừng sử dụng tiêu hủy chủng khử trùng nhiệt độ cao lần liên tiếp sau 24 3.2.6 Đánh giá khả tồn chủng VKNS bên mô chủ 3.2.6.1 Chuẩn bị củ khoai tây - Rửa củ khoai tây vòi nước chảy cho hết bùn đất để nước; khử trùng bề mặt củ khoai tây với cồn 70% phút tráng nước cất khử trùng lần - Để củ khoai tây khơ tự nhiên, sau đặt củ khoai tây vào rổ nhựa lưới để nhiệt độ phòng 3.2.6.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn - Chuẩn bị 500ml dịch huyền phù vi khuẩn nội sinh (mật độ khoảng 106107 cfu/ml) 3.2.6.3 Lây nhiễm - Đối chứng âm: củ khoai tây ngâm 500ml nước cất vơ trùng 30 phút - Thí nghiệm: củ khoai tây ngâm 500ml dịch khuẩn nội sinh 30 phút; Mỗi chủng nội sinh sử dụng củ khoai tây, đặt rổ nhựa lưới giữ nhiệt độ phịng 3.2.6.4 Đánh giá kết thí nghiệm - Mỗi củ khoai tây khử trùng bề mặt cồn 70% phút rửa lần với nước cất vô trùng box cấy - Từ củ khoai tây cắt miếng có kích thước 2,0x2,0 cm cân trọng lượng lát cắt, sau dùng dao mổ cắt thành miếng nhỏ 1ml nước cất vô trùng - Chuẩn bị ống eppendorf, ống cho 900µl nước cất vơ trùng Sau nghiền mẫu, hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từ ống nhỏ sang ống làm ống thứ để nồng độ pha loăng Lấy 100µl từ ống eppendorf nồng độ pha 17 loãng nhỏ vào đĩa môi trường YPDA trà bề mặt đĩa Để mẫu tủ 280C, sau 48h kiểm tra đếm số lượng khuẩn lạc 3.2.7 Quy trình xử lý VKNS để phịng trừ bệnh hiệu (đang tiến hành) 3.3 Kết nghiên cứu 3.3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn từ củ khoai tây Từ 10 mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn điển hình thu thập từ chợ đầu mối địa bàn Hà Nội vùng trồng khoai tây Thường Tín, Đơng Anh, Sóc Sơn, phân lập 98 chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn phân lập có hình thái khuẩn lạc màu sắc đa dạng (Hình 4) Hình 4: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 môi trường YPDA sau 24 nuôi cấy 28oC Các chủng vi khuẩn đặt tên theo thứ tự mẫu bệnh thu đợt khác làm cách cấy truyền khuẩn lạc tách rời phát triển môi trường YPDA Sau lần cấy truyền liên tiếp từ khuẩn lạc thu chủng vi khuẩn Bảo quản chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập sữa tách béo 10% -20oC để tiến hành thí nghiệm 3.3.2 Đánh giá độc tính tác nhân gây bệnh cũ khoai tây phịng thí nghiệm Sau lây nhiễm 98 chủng vi khuẩn củ khoai tây bệnh để đánh giá độc tính chúng, thu 10 chủng thể độc tính mạnh lát cắt củ khoai tây (Bảng 1) Các chủng vi khuẩn bảo quản sữa tách béo 10% nhiệt độ -20oC để phục vụ cho nghiên cứu 18 Bảng 1: Độc tính chủng vi khuẩn phân lập từ củ khoai tây bị bệnh thối nhũn Độc tính STT Chủng vi khuẩn Sau 24h Sau 48h P.1.3 ++ +++ P.1.5 + ++ P.2.4.5 ++ +++ P.2.5.1 ++ +++ P.2.5.3 ++ +++ P.2.6.1 + ++ P.4.5.5 ± + P.4.5.6 ++ +++ P.4.6.2 ++ +++ 10 P.4.6.3 - ± Chú thích: Khơng có biểu bị bệnh: Biểu bệnh yếu: ± Biểu bệnh nhẹ: + Biểu bệnh nặng: ++ Biểu bệnh nặng: +++ Hình 5: Triệu chứng bệnh sau tái nhiễm chủng P.2.6.1 khoai tây sau 24h 19 3.3.3 Khả sản sinh AHLs chủng vi khuẩn gây bệnh Trong số 98 chủng vi khuẩn phân lập, thu chủng có khả sản sinh AHLs (Bảng 2) Hai chủng P.2.5.1 P.2.6.1 vừa có khả sản sinh AHLs vừa thể độc tính mạnh lát cắt củ khoai tây Chủng P.2.6.1 lựa chọn cho nghiên cứu (Hình Bảng 2: Khả sản sinh AHLs chủng vi khuẩn gây bệnh STT Chủng vi khuẩn Độc tính lát cắt củ khoai tây Khả sản sinh AHLS chuỗi ngắn P.2.5.1 +++ + P.2.6.1 ++ + P.2.6.3 - + P.3.4.7 - + P.3.5.1 - + P.4.5.5 + + P.4.5.6 +++ - P.8.6.5 - - Chú thích: ( + ): Khả sản sinh AHLs mạnh ( ± ): Khả sản sinh AHLs yếu ( - ) : Không có khả sản sinh AHLs 20 ... chưa có nghi? ?n cứu vè chế gây bệnh vi khu? ?n gây bệnh thối nh? ?n sử dụng chủng vi khu? ?n n? ??i sinh đối kháng để ph? ?n hủy AHLs vi khu? ?n gây bệnh phòng trừ bệnh thối nh? ?n vi khu? ?n gây hại trồng Tr? ?n giới:... quenching (QQ) sử dụng phòng trừ sinh học bệnh thực vật Do vậy, nhóm tác giả ti? ?n hành thực đề tài nghi? ?n cứu: "Ứng dụng vi khu? ?n n? ??i sinh ph? ?n hủy N- acyl- L- homoserine lactones (AHLs) phòng trừ bệnh. .. ? ?n định - Thử nghiệm chủng vi khu? ?n n? ??i sinh để phòng trừ bệnh thối nh? ?n khoai tây vi khu? ?n Ecc gây khoai tây - Tìm quy trình xử l? ? VKNS để phịng trừ bệnh hiệu Đối tượng nghi? ?n cứu - Mẫu củ khoai