PHẦN I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Trong y học, vật liệu sinh học rất cần thiết khi điều trị cho bệnh nhân cần phẫu thuật, bệnh nhân tổn thương da do bỏng hoặc do nhiều nguyên nhân khác, giúp người bệnh được tiếp cận phương pháp chữa bệnh an toàn, rút ngắn thời gian chờ đợi, tạo tâm lý dễ chịu. Loại vật liệu sinh học có tiềm năng ứng dụng lớn trong điều trị các vết thương hở là collagen. Sử dụng băng gạc có bổ sung collagen đã phân cắt thành dạng kích thước nhỏ, hòa tan, sẽ giúp phóng thích collagen làm mau lành vết thương, giảm đáng kể nguy cơ xuất hiện sẹo. Đó là do collagen, đặc biệt là loại hòa tan, mạch ngắn, là thành phần chính trong lớp hạ bì và mạch máu, có chức năng chính là tăng tính đàn hồi và phục hồi các liên kết các mô tế bào. Collagen từ bò được chứng minh là có thành phần gần gũi với collagen từ con người, ít gây phản ứng miễn dịch trong quá trình điều trị, do vậy chủ yếu được nghiên cứu và sử dụng trong điều trị hơn so với collagen từ lợn và cá. Do collagen sản xuất bằng phương pháp vật lý, hóa học sẽ làm mất các chức năng sinh học của collagen, thời gian phân cắt kéo dài, nên phương pháp được quan tâm hiện nay là cắt liên kết các sợi collagen bằng collagenase, làm tăng các đoạn có kích thước nhỏ, rút ngắn thời gian, hiệu suất thu và sản phẩm collagen có tính hòa tan cao hơn, bảo toàn đặc điểm sinh học, thân thiện môi trường. Collagenase từ vi khuẩn có khả năng cắt hầu hết các loại collagen và tại nhiều vị trí trên sợi collagen. Các collagenase này hầu hết đều có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh cho người do vậy vẫn mang một đoạn protein của virus có khả năng làm loét rộng vết thương. Collagenase từ L. sphaericus vi khuẩn không gây bệnh cho người chưa được nghiên cứu rộng rãi ngoài thông tin công bố trình tự gene mã hóa collagenase trong hệ gen, nhưng không mang trình tự mã hoá của virus. Đây là một ưu điểm khi sử dụng enzyme từ vi khuẩn này tạo sản phẩm collagen không chứa các tác nhân gây miễn dịch hoặc dị ứng. Bên cạnh đó việc phối hợp protease từ thực vật như dứa hay đu đủ, giúp phân cắt các liên kết nội phân tử collagen sau khi bó sợi bị cắt bởi collagenase sẽ rút ngắn thời gian tạo các đoạn collagen ngắn, hòa tan. Nghiên cứu enzym để phân cắt các phụ phẩm như da và gân bò được công bố tập trung nhiều collagen hòa tan chưa có tại Việt Nam. Vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu thu nhận collagen từ gân và da bò bằng collagenase từ vi sinh vật và thực vật, định hướng ứng dụng trong băng gạc điều trị vết thương hở” được đề xuất thực hiện. Mục đích đề tài là tìm ra quy trình thu nhận collagen từ phân cắt gân và da bò bằng enzyme đạt hiệu suất cao, đơn giản, phù hợp với điều kiện Việt Nam, thân thiện môi trường, biến các phụ phẩm chế biến trở thành nguồn nguyên liệu có giá trị.
SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNGTHPT NGUYỄN THỊ MINH KHAI - QUẬN BẮC TỪ LIÊM ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015) Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THU NHẬN COLLAGEN TỪ GÂN VÀ DA BÒ BẰNG COLLAGENASE TỪ VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT, ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG BĂNG GẠC ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG HỞ Lĩnh vực: Kỹ thuật: Vật liệu Công nghệ sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN - TS Bạch Thị Mai Hoa - Đơn vị công tác: Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH & CN VN TÁC GIẢ: Trần Minh Tâm Lớp: 11B12 Trường: THPT Nguyễn Thị Minh Khai Hà Nội, tháng 11 năm 2014 MỤC LỤC Trang PHẦN I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI PHẦN II TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU VÀ ĐIỂM MỚI, SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI PHẦN III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ III.1 Chuẩn bị vật liệu collagen III.2 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp để thu nhận collagenase từ chủng vi khuẩn Lysinibacillus sphaericus VN3 III.3 Nghiên cứu thu nhận collagenase từ L sphaericus VN3 10 III.4 Nghiên cứu thu nhận protease từ đu đủ dứa 12 III.5 Nghiên cứu khả phân cắt collagen enzym từ L sphaericus VN3, dịch chiết đu đủ dứa 15 III.6 Nghiên cứu điều kiện phân cắt collagen từ da gân bò 16 III.7 Sơ nghiên cứu điều kiện phù hợp cho tạo màng collagen 18 III.8 Nghiên cứu tinh enzym từ chủng L sphaericus VN3 dứa PHẦN VI KẾT LUẬN 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 24 PHẦN I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Trong y học, vật liệu sinh học cần thiết điều trị cho bệnh nhân cần phẫu thuật, bệnh nhân tổn thương da bỏng nhiều nguyên nhân khác, giúp người bệnh tiếp cận phương pháp chữa bệnh an toàn, rút ngắn thời gian chờ đợi, tạo tâm lý dễ chịu Loại vật liệu sinh học có tiềm ứng dụng lớn điều trị vết thương hở collagen Sử dụng băng gạc có bổ sung collagen phân cắt thành dạng kích thước nhỏ, hịa tan, giúp phóng thích collagen làm mau lành vết thương, giảm đáng kể nguy xuất sẹo Đó collagen, đặc biệt loại hòa tan, mạch ngắn, thành phần lớp hạ bì mạch máu, có chức tăng tính đàn hồi phục hồi liên kết mô tế bào Collagen từ bị chứng minh có thành phần gần gũi với collagen từ người, gây phản ứng miễn dịch trình điều trị, chủ yếu nghiên cứu sử dụng điều trị so với collagen từ lợn cá Do collagen sản xuất bằng phương pháp vật lý, hóa học sẽ làm mất các chức sinh học của collagen, thời gian phân cắt kéo dài, nên phương pháp quan tâm cắt liên kết các sợi collagen bằng collagenase, làm tăng các đoạn có kích thước nhỏ, rút ngắn thời gian, hiệu suất thu và sản phẩm collagen có tính hòa tan cao hơn, bảo toàn đặc điểm sinh học, thân thiện môi trường Collagenase từ vi khuẩn có khả cắt hầu hết loại collagen nhiều vị trí sợi collagen Các collagenase này hầu hết đều có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh cho người vậy vẫn mang một đoạn protein của virus có khả làm loét rộng vết thương Collagenase từ L sphaericus - vi khuẩn không gây bệnh cho người - chưa được nghiên cứu rộng rãi ngoài thông tin công bố trình tự gene mã hóa collagenase hệ gen, không mang trình tự mã hoá virus Đây là một ưu điểm sử dụng enzyme từ vi khuẩn tạo sản phẩm collagen không chứa các tác nhân gây miễn dịch hoặc dị ứng Bên cạnh việc phối hợp protease từ thực vật dứa hay đu đủ, giúp phân cắt liên kết nội phân tử collagen sau bó sợi bị cắt collagenase rút ngắn thời gian tạo đoạn collagen ngắn, hòa tan Nghiên cứu enzym để phân cắt phụ phẩm da gân bị cơng bố tập trung nhiều collagen hịa tan chưa có Việt Nam Vì lý trên, đề tài “Nghiên cứu thu nhận collagen từ gân và da bò bằng collagenase từ vi sinh vật và thực vật, định hướng ứng dụng băng gạc điều trị vết thương hở” đề xuất thực Mục đích đề tài tìm quy trình thu nhận collagen từ phân cắt gân da bò enzyme đạt hiệu suất cao, đơn giản, phù hợp với điều kiện Việt Nam, thân thiện môi trường, biến phụ phẩm chế biến trở thành nguồn nguyên liệu có giá trị PHẦN II TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU VÀ ĐIỂM MỚI, SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI Trong y học, collagen thủy phân sản xuất từ bị cơng nhận loại thuốc uống thuốc tiêm an toàn dùng cho người Từ năm 1981, hai dòng thuốc tiêm collagen hòa tan loại I II tinh khiết sản xuất từ da bò với tên thương mại Zyderm Zyplast sử dụng rộng rãi cho điều trị bất thường đường viền mô mềm Hiện nay, collagen tinh khiết từ bò sử dụng ngành công nghiệp thẩm mỹ da và điều trị bệnh khớp, gân sụn, đánh giá hiệu điều trị phục hồi vết bỏng sâu rộng Collagen chiếm % thể trọng gân, khoảng 70% cấu trúc da phân bố chủ yếu lớp hạ bì da Đã có 29 loại collagen cơng bố, collagen hịa tan loại I phổ biến thường mô liên kết da, xương, gân Collagen có khả làm tăng tính đàn hồi phục hồi liên kết mô tế bào Collagenase enzyme phân cắt liên kết peptide bó sợi collagen tạo collagen hịa tan Collagenase từ vi khuẩn có tính ưu việt phân cắt collagen hịa tan khơng hịa tan, cắt hầu hết loại collagen nhiều vị trí sợi collagen Collagenase từ Clostridium histolyticum nghiên cứu sản xuất từ năm 1958 Các collagenase từ Pseudomonas aeruginosa (1975), từ vi sinh vật biển Vibrio sp Achromobacter iophagus (1996), hầu hết đều vi sinh vật gây bệnh cho người, vẫn mang một đoạn protein của virut có khả làm mở rộng vết loét của vết bỏng Lysinibacillus sphaericus là vi khuẩn có lợi và được xem tác nhân diệt muỗi sinh học dùng kiểm soát dịch sốt xuất huyết, sốt rét Collagenase từ L sphaericus chưa được nghiên cứu rộng rãi ngoài thông tin công bố trình tự gene mã hóa collagenase hệ gen của vi kh̉n này, khơng mang đoạn gen mã hóa virus Khi sử dụng enzyme từ vi khuẩn tạo sản phẩm collagen mạch ngắn, hịa tan khơng chứa các tác nhân gây miễn dịch hoặc dị ứng Điểm mới, sáng tạo đề tài: Sử dụng nguồn vật liệu giá thành rẻ, dồi Việt Nam gân da bò để tạo collagen mạch ngắn, nhờ phân cắt collagenase từ L sphaericus, vi kh̉n khơng gây bệnh cho người, chưa có nghiên cứu liên quan đến hoạt tính collagenase vi khuẩn Sử dụng thêm số enzyme từ thực vật rẻ tiền, sẵn có (dứa, đu đủ) nâng cao khả phân cắt collagen, rút ngắn thời gian, thân thiện với môi trường đường phân cắt bằng hóa học Tạo quy trình sản xuất collagen khép kín, vơ trùng đem lại hiệu kinh tế cao và an toàn, phù hợp với điều kiện nước, tận dụng nâng cao giá trị phụ phẩm chế biến Đây hướng nghiên cứu Việt Nam, có ý nghĩa khoa học thực tiễn, có tiềm ứng dụng cao PHẦN III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp để thu nhận collagenase từ chủng vi khuẩn L sphaericus VN3 Nghiên cứu thu nhận collagenase từ chủng vi khuẩn L sphaericus VN3 Nghiên cứu thu nhận protease từ đu đủ dứa Nghiên cứu khả phân cắt collagen enzym thô từ L sphaericus VN3 và dịch chiết đu đủ, dứa Nghiên cứu điều kiện phân cắt gân da bò bằng enzym từ L sphaericus VN3 và đu đủ, dứa Nghiên cứu tách chiết collagenase từ chủng L sphaericus VN3 và protease từ đu đủ, dứa Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho tạo màng collagen Lựa chọn các thành phần bổ sung thích hợp cho màng collagen dùng điều trị bỏng Thử nghiệm màng collagen thỏ đã gây bỏng thực nghiệm Xây dựng quy trình thu nhận collagen khép kín vơ trùng, đơn giản III.1 Chuẩn bị vật liệu collagen III.1.1 Dụng cụ, thiết bị hóa chất - Dụng cụ: cốc đong 1000 ml nhựa, hộp nhựa đựng da/gân bị, bình thủy tinh đựng hỗn hợp dịch collagen thô - Thiết bị: tủ lạnh Toshiba (Nhật), máy xay thịt (Việt Nam), máy ly tâm (Sorvall, Mỹ) , máy đo pH (Mettler Toledo, Anh) - Hóa chất: nước cất, dung dịch Na2HPO4 0,05M (17,907 g/L), acetic acid 0,5M (30,025 g/L), EDTA 5mM (1,861 g/L), cồn 70o III.1.2 Tạo vật liệu collagen Vật liệu collagen dùng thí nghiệm chuẩn bị sau: - Bước 1: Rửa da/ gân bị nước cất, sau cồn 70 o, ngâm gân/da cồn 70o Vệ sinh dụng cụ máy xay cồn 70o - Bước 2: Ngâm da/gân bò xay Na 2HPO4 0,05M pH 8,7-9,1 4oC 24 giờ, thay dịch ngâm đến lần trình ngâm - Bước 3: Loại bỏ dịch ngâm thay acetic acid 0,5M + EDTA 5mM - Bước 4: Ly tâm loại bỏ cặn (phần collagen không bị cắt/ phần protein collagen) thu hỗn hợp dịch collagen thô - Bước 5: Thu dịch keo collagen thô bảo quản tủ lạnh oC để dùng cho thí nghiệm Hình Gân da bị Hình Keo collagen thô III.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận collagenase từ chủng vi khuẩn Lysinibacillus sphaericus VN3 III.2.1 Lựa chọn mơi trường thích hợp cho sinh trưởng sinh collagenase chủng L sphaericus VN3 Dụng cụ, thiết bị hóa chất: - Dụng cụ: bình tam giác dung tích 250 ml (8 cái), que cấy đầu tròn (1 cái) - Thiết bị: tủ ấm nuôi vi sinh vật (Friocell, Đức), nồi khử trùng (ALP, Nhật), máy quang phổ (Labomed, Tây Ban Nha) - Hóa chất: collagen (Sigma, Mỹ), hố chất có thành phần mơi trường Thí nghiệm: - Chuẩn bị mơi trường nuôi cấy: + Môi trường LB lỏng: chuẩn bị loại có bổ sung khơng bổ sung collagen Thành phần hóa chất Hàm lượng (g/l) Cao men Trypton 10 NaCl Collagen 10 Nước cất tới 1000 ml pH 7-7,2 + Mơi trường khống ISP9 có bổ sung khơng bổ sung collagen Thành phần hóa chất Hàm lượng (g/l) (NH4)2 SO4 2,64 KH2PO4 2,38 K2HPO4 5,65 MgSO4 Collagen Muối vi lượng Nước cất pH 10 1ml 1000 ml 6,8- + Chuẩn bị 100 ml dung dịch muối vi lượng Thành phần hóa chất Trong lượng (g/l) Cu SO4 0,64 FeSO4 0,11 MnCl2 0,79 ZnSO4 0,15 Nước cất 100 ml + Chia môi trường vào bình tam giác, bình 25 ml, viết tên mơi trường thành bình giấy bao nút bơng, sau đem khử trùng 121 oC 40 phút Dung dịch muối vi lượng đựng bình tam giác 500 ml khử trùng môi trường Để nguội môi trường khử trùng, bổ sung vi lượng trước cấy giống - Cấy giống: lấy vòng que cấy sinh khối chủng vi khuẩn L sphaericus VN3 từ ống thạch nghiêng chuyển vào môi trường lỏng bình tam giác để nguội Chuyển bình tam giác cấy chủng vào máy lắc tốc độ 220 vịng/phút, ni 37oC 24 - Kiểm tra kết quả: Khi kết thúc nuôi cấy tiến hành đánh giá mức độ sinh trưởng cách đo OD dịch nuôi cấy máy quang phổ bước sóng 600 nm sinh tổng hợp collagenase Mơi trường cho giá trị OD hoạt tính collagenase cao lựa chọn để dùng thí nghiệm + Cách đo giá trị OD 600 nm: rửa cuvet nước cất, úp miệng cuvet xuống giấy thấm cho hút hết nước, dùng pipet bơm ml nước cất vào cuvet, đặt vào máy, đợi hình lên giá trị đo nhấn O/T để đưa giá trị 0; đổ nước úp miệng cuvet xuống giấy thấm trên, bơm ml dịch cần đo độ hấp phụ, đặt vào máy, ghi lại giá trị hiển thị hình + Phương pháp xác định hoạt tính collagenase [7]: Hoạt tính collagenase xác định cách đo lượng Leucine giải phóng từ chất collagen qua q trình ủ với dịch enzyme thơ Một đơn vị hoạt tính enzyme định nghĩa lượng enzyme cần để giải phóng 1µmol Leucine từ chất collagen điều kiện thí nghiệm Sử dụng ninhydrin L-Leucine (pha nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2 µmol/ml) xây dựng đường chuẩn Hình Đường chuẩn Leucine Chuẩn bị dung dịch: Đệm TES 50mM: pha 50 ml gồm: 2,5 ml Tris HCl 100 mM pH =8; 0,5 ml EDTA 20mM; 47 ml nước cất; 1,98 g CaCl2; 0,15 g NaCl Dung dịch ninhydrin 4%: cân g pha 32 ml nước cất 68 ml ethanol Dung dịch chất: chứa 1% (w/v) collagen đệm TES Hoạt tính collagenase dịch enzyme thơ xác định cách đo lượng Leucine sinh hỗn hợp phản ứng nhờ phương pháp so màu theo quy trình sau: 0,5ml dịch chất collagen phản ứng với 0,5 ml dịch nuôi vi khuẩn L sphaericus VN3 chứa enzyme thô 37oC Ly tâm 7000 vòng/phút 15 phút thu dịch Hút 0,5ml dịch vào ống effpendof sau bổ sung 0,2ml ninhydrin 4% (w/v) đo độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 570nm Hoạt độ collagenase xác định theo công thức sau: Hoạt độ enzyme E = (y*0,7)/(0,7*0,25) (u/ml) Trong đó: y: Phương trình đường chuẩn Leucine: y = (2,095*x + 0,0546) (µmol/ml); x: giá trị OD570nm Kết thu cho thấy môi trường LB lỏng có bổ sung 1% collagen thơ cho khả sinh trưởng cao (OD600 = 1,777) ISP9 lỏng có bổ sung 1% collagen cho hoạt tính collagenase cao đạt 12,28 U/ml Xác định định tính collagenase cho thấy mơi trường ISP9 thạch có bổ sung 1% collagen có vịng phân giải collagen với đường kính 2,1 cm (Bảng 1, Hình 5) Như lựa chọn môi trường ISP9 bổ sung 1% collagen thô để nuôi cấy chủng L sphaericus VN3 cho sinh collagenase Môi trường LB lựa chọn môi trường nhân giống tạo sinh khối cho lên men collagenase Bảng Sinh trưởng sinh tổng hợp collagenase VN3 môi trường khác Môi trường Khả sinh trưởng (OD 600 nm) LB 1,12 ISP9 0,528 LB + 1% collagen 1,777 ISP9 + 1% collagen 1,042 Hình Hoạt tính phân giải collagen chủng VN3 mơi trường thạch ISP9 chủng L sphaericus Hoạt tính (U/ml) 6,34 12,28 collagenase Hình Chủng VN3 sinh trưởng môi trường lỏng III.2.2 Lựa chọn pH, nhiệt độ nồng độ NaCl thích hợp cho sinh trưởng sinh collagenase chủng L sphaericus VN3 Dụng cụ, thiết bị hóa chất: - Dụng cụ: bình tam giác dung tích 250 ml (6 cái), que cấy đầu trịn (1 cái) - Thiết bị: tủ ấm nuôi vi sinh vật (Friocell, Anh), nồi khử trùng (ALP, Nhật) - Hóa chất: hố chất có thành phần mơi trường ISP9 Thí nghiệm: Để xác định khả sinh trưởng vi khuẩn L sphaericus VN3 điều kiện khác nhau, vi khuẩn nuôi cấy môi trường ISP9 lỏng 37 oC có bổ sung 1% collagen khơng hòa tan nồng độ NaCl tăng dần từ - 10 %, nuôi nhiệt độ (4oC; 10oC; 20oC; 30oC; 37oC 45oC) pH khác (từ pH 4,0 - 10,0) Quan sát phát triển xác định khả sinh collagenase vi khuẩn môi trường sau - ngày nuôi cấy Bảng Ảnh hưởng pH, nhiệt độ nồng độ NaCl đến sinh trưởng sinh collagenase chủng L sphaericus VN3 Điều kiện nuôi cấy Sinh trưởng (OD600) Hoạt tính collagenase (U/ml) NaCl (%) 3,812 12,40 3,096 12,37 3,056 12,34 2,04 10,28 1,88 8,75 1,36 6,12 0,092 4,01 0,82 0,42 10 0,304 Nhiệt độ (oC) 4oC 10 20 0,934 5,26 30 2,13 10,53 37 3,812 12,34 45 pH 0,424 3,87 3,683 12,34 3,512 12,17 2,85 11,02 10 0,851 Qua q trình thí nghiệm cho thấy (Bảng 2, Hình 6) chủng vi khuẩn VN3 chủng ưa ấm, phát triển nhiệt độ từ 20 oC đến 37oC, phát triển tốt 37oC Ở 4oC 10oC chủng vi khuẩn không phát triển, nhiệt độ lên tới 45 oC chủng vi khuẩn ngừng phát triển Chủng vi khuẩn VN3 không phát triển pH axit, pH từ đến 10 chủng có khả phát triển, phát triển tốt khoảng pH từ đến Khi pH tăng lên 10 khả sinh trưởng chủng VN3 giảm mạnh Ở nồng độ NaCl thấp khả sinh trưởng chủng tốt, nồng độ % NaCl môi trường tăng lên, khả sinh trưởng chủng giảm dần Tại nồng độ 7%, chủng bị ức chế sinh trưởng Như lựa chọn điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn L sphaericus VN3 37oC, NaCl ≤ 5% pH=7 A B C Hình Chủng VN3 sinh trưởng mơi trường ISP9 có nồng độ NaCl (A), pH (B), nhiệt độ (C) khác III.3 Nghiên cứu thu nhận collagenase từ L sphaericus VN3 III.3.1 Dụng cụ, thiết bị hóa chất - Dụng cụ: bình tam giác dung tích 1000 ml (3 cái), que cấy đầu tròn (1 cái), ống nghiệm 18x180 mm (5 cái) - Thiết bị: tủ ấm nuôi vi sinh vật, nồi khử trùng, máy lắc ổn nhiệt (CPT, Hàn Quốc) - Hóa chất: hố chất có thành phần mơi trường ISP9 III.3.2 Thí nghiệm Nhân giống vi khuẩn cho lên men Chủng vi khuẩn L sphaericus VN3 từ ống nghiệm thạch nghiêng được hoạt hóa cách cấy sang ống nghiệm mới nuôi 24 giờ, rồi được cấy vào môi trường LB, nuôi 37o C thời gian 24 máy lắc tốc độ 220 vòng/phút Mật độ giống vi khuẩn đạt 108 CFU/ml Phương pháp lên men Cấy giống vi khuẩn vào bình tam giác 1000ml lên men với tỉ lệ 10% (v/v), nuôi máy lắc tốc độ 220 vòng/phút 37 o C thời gian 30 Môi trường lên men sử dụng ISP9 + 1% collagen thô, pH = Trong trình lên men lấy 10 ml mẫu định kỳ để xác định sinh trưởng (giá trị OD600) hoạt tính collagenase (U/ml), kết thu cho thấy từ thứ 12 chủng bắt đầu sinh collagen hoạt tính cao 24 giờ, thời điểm thích hợp để dừng lên men thu collagenase 24 (Bảng 3) 10 Bảng Biến động trình lên men sinh collagenase chủng L sphaericus VN3 Thời gian (Giờ) Sinh trưởng (OD600) Hoạt tính collagenase (U/ml) 0,560 0, 781 0,924 12 1,095 4,11 15 1,257 6,03 18 2,019 8,19 21 2,974 9,06 24 3,803 12,3 27 3,152 10,21 30 1,911 8,91 III.3.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford [4] - Dụng cụ, thiết bị: Máy đo quang phổ (Labomed, Tây Ban Nha), ống effpendof 2ml (14 cái), Pipetteman 1ml, giấy thấm, bình tia đựng cồn - Hóa chất: Dung dịch protein chuẩn (BSA): cân 10 mg albumin cân phân tích, pha 1ml nước cất, lắc cho tan Giữ -200C Khi dùng pha loãng 100 lần, dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần lít sau: Coomasie Brilliant Blue G250 cân 0,1 g làm tan 50 ml methanol, pha lõang với nước cất thành 500 ml để dược dung dịch (1), đựng chai màu tối có nắp 100 ml H3PO4 85% pha lõang thành 500 ml dung dịch (2) Khi cần sử dụng hòa V (1) 1V (2) lọc lấy dịch - Tiến hành: Chuẩn bị loạt ống theo số thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, để xây dựng đường chuẩn theo Bảng ống effpendof chứa mẫu cần phân tích Đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 595 nm - Tính kết quả: Vẽ đường tuyến tính nồng độ albumin với mật độ quang OD595 Dựa vào phương trình đường tuyến tính nồng độ protein với mật độ quang OD595 tính hàm lượng protein mẫu phân tích 11 Bảng Xây dựng đường chuẩn albumin Nồng độ albumin Dung dịch BSA STT (mg/ml) (ml) 0,125 0,25 0,25 0,25 0,5 0,25 0,75 0,25 1,0 0,25 1,5 0,25 2,0 0,25 0 Dung dịch Bradford (ml) 1,75 ml 1,75 ml 1,75 ml 1,75 ml 1,75 ml 1,75 ml 1,75 ml 2,0 ml Hình Đường chuẩn protein Dựa vào phương trình đường chuẩn y= 1,565x – 0,052 tính hàm lượng protein dịch nuôi cấy chủng VN3 0,1 mg/ml, từ tính hoạt tính collagenase riêng chủng VN3: 122,8 U/mg protein III.4 Nghiên cứu thu nhận protease từ đu đủ dứa III.4.1 Dụng cụ, thiết bị hóa chất - Dụng cụ: rây để lọc, cốc đong 500 ml, 1000 ml - Thiết bị: máy xay sinh tố (Philips, Malaysia), Cân Shimadzu AY220 Max 220g d=0.1mg - Hóa chất: Cồn 70o, nước cất, đệm Tris HCl 0,5 M pH = ( cân 36,342g Tris base hịa tan lít nước cất, chỉnh pH dung dịch HCl 10N) - Vật liệu: đu đủ xanh, cuống dứa III.4.2 Thí nghiệm Chiết enzym từ đu đủ dứa: 12 Với mục đích rút ngắn thời gian phân cắt collagen thô nguồn enzym rẻ tiền, sẵn có Việt Nam, enzym từ đu đủ cuống dứa thử nghiệm khả thủy phân vật liệu collagen Rửa đu đủ cuống dứa nước sạch, rửa lại nước cất, sau cồn 70 o Vệ sinh máy xay, dụng cụ cồn 70o, cho vào box cấy dứa đu đủ, bật đèn UV 30 phút Cân đu đủ xanh cuống dứa, sau cho vào máy xay sinh tố, thêm đệm Tris HCl 0,5 M pH = theo tỉ lệ 1:1 (ví dụ có 100 gram đu đủ + 100 ml đệm), xay nhuyễn, đổ cốc đong thủy tinh dung tích 1000 ml, lọc rây thu enzym thô Xác định hàm lượng protein tổng số theo phương pháp Bradford hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến Hình Chiết enzym từ đu đủ dứa Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến[1]: Cho protease tác dụng với casein, sản phẩm tạo thành có chứa loại peptid ngắn, acid amin tyrosine chiếm đa số Xác định tyrosine phản ứng màu với thuốc thử folin, từ xác định hoạt tính protease theo định nghĩa: Hoạt tính protease biểu thị số micromol tyrosine sinh thủy phân casein mg hỗn hợp chứa protease phút điều kiện chuẩn (37 oC, pH=7,6) Dụng cụ: ống nghiệm 18x180 (6 cái), Bình định mức 50, 100, 250, 500 ml, Finnpipette F2 100-1000 microlitre, Hóa chất: Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: hòa tan 2,967 g Na 2HPO4.2H2O nước cất thành 250 ml Dung dịch KH2PO4 1/15 M: hòa tan 0,9072 g KH 2PO4 nước cất thành 100 ml Dung dịch đệm Soresen 1/15M, pH = 7,6: trộn 177 ml dung dịch Na 2HPO4 1/15 M 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15 M Đo chỉnh pH=7,6 13 Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy g casein đệm Sorensen tan hoàn toàn định mức lên 100 ml Dung dịch TCA 10%: hòa tan 10 g TCA nước cất cho đủ 100 ml Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH nước cất cho đủ 500 ml Dung dịch HCl 0,2 N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250 ml Dung dịch tyrosine 20mM/L: khuấy, nghiền 0,118 g tyrosin dung dịch HCl 0,2 N vừa đủ 50 ml Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/L: pha loãng ml tyrosin 20mM/L HCl 0,2N thành 100 ml Tiến hành: Bảng Xây dựng đường chuẩn tyrosine Ống nghiệm Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/L 0,2 0,4 0,6 0,8 (ml) Dung dịch HCl 0,2 N (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lượng tyrosin (µmol) 0,2 0,4 0,6 0,8 Lắc để yên 10 phút, đo mật độ quang bước sóng 660nm Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo lượng tyrosine ống (đường chuẩn) (Hình 8) Hình Đường chuẩn tyrosine Hoạt tính protease (U/ml) = (x.V.K)/(t.v) X: số µmol tyrosine suy từ đường chuẩn V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng (11 ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1 ml) 14 k: độ pha loãng t: thời gian phản ứng 1U= µmol tyrosine/ml/phút µmol/mg/phút Bảng Xác định lượng tyrosine dung dịch nghiên cứu Dung dịch hóa chất Thí nghiệm Đối chứng Casein 1% (ml) 5 TCA 10% (ml) Dịch enzym mẫu (ml) Lắc ủ mẫu 37oC 30 phút TCA 10% (ml) Dịch enzym mẫu (ml) Lọc, lấy ml dịch lọc thực phản ứng màu Dịch lọc (ml) 1 Dung dịch NaOH 0,5N 2 (ml) Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 Lắc để yên 10 phút, đo mật độ quang bước sóng 660nm Từ kết hàm lượng protein (mg/ml) hoạt tính protease (U/ml), tính hoạt tính riêng enzym là: số đơn vị hoạt tính/mg protein enzym Kết trình bày Bảng Bảng Hoạt tính protease dịch chiết đu đủ cuống dứa Vật liệu Protein tổng số Hoạt tính protease Hoạt tính protease (mg/ml) (U/ml) riêng (U/mg) Cuống dứa 0,21 2,885 12,738 Đu đủ 0,322 2,588 7,944 III.5 Nghiên cứu khả phân cắt collagen enzym từ L sphaericus VN3, dịch chiết đu đủ dứa V.1 Dụng cụ, thiết bị hóa chất - Dụng cụ: đĩa petri chứa môi trường ISP9 + 1% collagen (2 đĩa), dụng cụ đục lỗ (1 cái), - Thiết bị: Finnpipette F2 100-1000 microlitre, tủ lạnh (Toshiba, Nhật), tủ ni vi sinh vật (Friocell, Đức) - Hóa chất: thành phần mơi trường ISP9 + 1% collagen khơng hịa tan V.2 Thí nghiệm 15 - Chuẩn bị mơi trường thạch khống ISP9 + 1% collagen khơng hịa tan, đổ đĩa petri, để nguội, đục lỗ, nhỏ dịch chiết enzym đu đủ dứa, dịch lên men chủng VN3, để ngăn mát tủ lạnh cho enzym khuếch tán, sau lấy để tủ ni vi sinh vật 37oC Quan sát đo vòng phân giải collagen sau 1-3 ngày Đối chứng collagenase chuẩn (Sigma) nước cất Kết cho thấy enzym từ chủng VN3 dịch chiết enzym dứa, đu đủ có khả phân cắt collagen, khả phân giải chủng VN3 > dịch chiết enzym dứa > Hình Hoạt tính phân giải collagen chủng VN3 dịch chiết enzym đu đủ dịch chiết đu đủ, dứa III.6 Nghiên cứu điều kiện phân cắt collagen từ da gân bị VI.6.1 Dụng cụ, thiết bị hóa chất - Dụng cụ: bình tam giác 100 ml (20 cái) - Thiết bị: tủ nuôi vi sinh vật 37oC (Friocell, Đức) - Hóa chất: dịch keo collagen thơ (từ gân da bị) VI.6.2 Thí nghiệm Trộn dịch ni cấy chủng VN3 (đã loại sinh khối) hay gọi dịch enzym thô, dịch chiết enzym đu đủ, dứa với dịch keo collagen thô theo tỉ lệ 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 Ủ 37oC, hàng ngày quan sát dịch hóa keo collagen thơ mắt thường tuần Kết cho thấy tỉ lệ phối trộn enzym: collagen thơ = 4:1 thích hợp cho phân cắt collagen Ở tỉ lệ cịn lại, q trình ủ lượng dịch nên khơng thấy rõ dịch hóa, mẫu có tỉ lệ 1:1 collagen trương lên trình ủ tạo thành khối A B C Hình 10 Thủy phân collagen thơ từ gân, da bò enzym từ dứa (A), đu đủ (B) chủng VN3 (C) 16 Trên sở chọn tỉ lệ phối trộn 4:1, tiến hành nghiên cứu điều kiện phân cắt collagen thô từ gân da bị ngày, để tìm cơng thức phối trộn enzym collagen thích hợp Chuẩn bị mẫu thủy phân collagen từ gân da bị bình tam giác 100 ml sau: Mẫu 1: Dịch chiết enzym đu đủ + collagen từ gân, da bò, tỉ lệ 4:1 Mẫu 2: Dịch chiết enzym dứa+ collagen từ gân, da bò, tỉ lệ 4:1 Mẫu 3: Dịch enzym thơ chủng VN3+ collagen từ gân, da bị, tỉ lệ 4:1 Mẫu 4: Dịch enzym thô chủng VN3 + dịch chiết enzym đu đủ + collagen từ gân, da bò, tỉ lệ 2:2:1 Mẫu 5: Dịch enzym thô chủng VN3 + dịch chiết enzym dứa + collagen từ gân, da bò, tỉ lệ 2:2:1 Mẫu 6: Dịch collagenase chuẩn (12,5U/ml) + collagen từ gân, da bò, tỉ lệ 4:1 Mẫu 7: Nước cất + collagen từ gân,da bò, tỉ lệ 4:1 Mẫu 8: Dịch enzym thô chủng VN3 + 1% collagen Sigma Trong mẫu 6, 7, mẫu đối chứng Quan sát dịch hóa xác định hàm lượng protein phần dịch hỗn hợp hàng ngày Kết đo giá trị OD595 nm cho thấy mẫu có tỉ lệ dịch enzym từ chủng VN3: dịch chiết enzym dứa: collagen thô = 2:2:1 cho giá trị cao thời gian phân cắt ngày thích hợp nhất, hàm lượng protein tổng số đạt cao 0,1624 mg/ml dịch phản ứng, sau thời gian hàm lượng protein không tăng lên nữa, Mẫu gồm dịch VN3: dịch chiết đu đủ: collagen thô = 2:2:1 có thời gian phân cắt thích hợp ngày, protein tổng số dịch phản ứng 0,158 mg/ml Mẫu sử dụng dịch dứa kết hợp với enzym từ chủng VN3 lựa chọn nguồn thu enzym cuống dứa- phụ phẩm chế biến dứa Nhờ nâng cao khả cắt collagen, rút ngắn thời gian protease từ dứa phân cắt liên kết nội phân tử collagen sau bó sợi bị cắt nhiều vị trí tác dụng collagenase từ chủng VN3 Bên cạnh việc giúp tận dụng nâng cao giá trị nguồn phụ phẩm này, góp phần giảm nhiễm môi trường việc tập trung cuống dứa thải bỏ sau trình chế biến Mẫu lựa chọn dùng để tạo hỗn hợp phân cắt collagen ở pH (5, 6, 7, 8) nhiệt độ (30, 37, 40 oC) khác nhằm tìm điều kiện thích hợp (Hình 11) Kết đo giá trị OD595 nm để xác định hàm lượng protein thu dịch phản ứng cho thấy phân cắt nhiệt độ 30oC pH=7 cho kết cao nhất, đạt 17 0,234 mg/ml Từ lựa chọn điều kiện phân cắt collagen từ da gân bò là: nhiệt độ 30oC, pH = Hình 11 Phân cắt collagen thơ enzym Dịch sau phân cắt có dạng keo nhớt dùng để tạo màng collagen, kiểm tra cách chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét cho thấy collagen trước bị phân cắt enzym có dạng sợi dài đan xen thành lưới, collagen sau tác dụng enzym bị cắt thành đoạn ngắn (Hình 12) Như việc dùng enzym thơ từ chủng VN3 kết hợp với enzym thô từ dứa, đu đủ có khả phân cắt collagen thơ từ gân da bò, kết sơ ban đầu tạo sở cho bước nghiên cứu nhằm tạo màng collagen ứng dụng thực tế A B Hình 12 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét collagen trước (A) sau (B) phân cắt enzym (x 5000) III.7 Sơ nghiên cứu điều kiện phù hợp cho tạo màng collagen III.7.1 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất Dụng cụ: mica đóng bìa sách (03 tờ), đũa thủy tinh (1 chiếc), rây bột (1 cái), thìa inox (1 cái) Thiết bị: tủ cấy vô trùng (ESCO, Pháp) 18 Hóa chất: dung dịch Dung dịch NaOH 5N: hịa tan 10 g NaOH nước cất cho đủ 50 ml Dung dịch HCl N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 25 ml III7.2 Thí nghiệm: Gân da bò sau xay ngâm dung dịch có 5% acetic acid bảo quản tủ lạnh để dùng cho thí nghiệm Sau bị thủy phân enzym thu dạng dịch keo nhớt Điều chỉnh pH dịch 2, 3, 4, 5, 6, 7, dung dịch NaOH 5N HCl 2N Quét dịch có pH khác lên giấy mica, để khô tự nhiên tủ cấy vô trùng quan sát khả tạo màng, đánh giá cảm quan mức độ tạo màng Kết trình bày Bảng Bảng Khả tạo màng collagen dịch sau thủy phân có pH khác pH Tạo thành Không Không Không tạo tạo tạo tạo màng tạo màng tạo tạo màng màng màng màng màng rõ rõ màng Màng Ướt Màng Màng có sợi trong trắng Màng có khơng Có độ Có độ Có độ độ dai dai dai dai dai Màng nhẵn Nhẵn Nhẵn Khơng mịn mịn mịn mịn, vón cục Kết luận: pH tạo màng tốt nhất, màng tạo thành trong, mịn, có độ dai, khơ nhanh nên tách khỏi mica sớm dịch pH axit Như collagen sau phân cắt enzym từ chủng VN3 dứa tạo thành màng pH =7, vấn đề đặt sản phẩm màng hướng tới ứng dụng điều trị nên cần phải Bước nghiên cứu tinh enzym, sau dùng cho phân cắt keo collagen thô 19 ... thu nhận collagen từ gân và da bò bằng collagenase từ vi sinh vật và thực vật, định hướng ứng dụng băng gạc điều trị? ?vết thương hở? ?? đề xuất thực Mục đích đề tài tìm quy trình thu. .. + collagen từ gân, da bò, tỉ lệ 2:2:1 Mẫu 5: Dịch enzym thô chủng VN3 + dịch chiết enzym dứa + collagen từ gân, da bò, tỉ lệ 2:2:1 Mẫu 6: Dịch collagenase chuẩn (12,5U/ml) + collagen từ gân, da. .. xuất từ da bò với tên thương mại Zyderm Zyplast sử dụng rộng rãi cho điều trị bất thường đường vi? ??n mơ mềm Hiện nay, collagen tinh khiết từ bị sử dụng ngành công nghiệp thẩm mỹ da và điều trị