Luận án nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố ix ở bệnh nhân hemophilia b

1 MỞ ĐẦU Hemophilia B hội chứng rối loạn chảy máu nghiêm trọng Biểu bệnh tượng chảy máu lâu cầm sau nhổ răng, vết rách, sau chấn thương, sau phẫu thuật chảy máu sinh lý khác Ở bệnh mức độ nặng tượng chảy máu gây tổn thương quan mô, dẫn đến tàn phế đe dọa tính mạng người bệnh [1] [2] Đây bệnh lý dai dẳng, khó điều trị ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống người bệnh Hemophilia B chiếm tỷ lệ từ 15-20% nhóm bệnh hemophilia với tỷ lệ mắc bệnh 1:30.000 nam giới [3] [4] Cơ chế sinh bệnh xuất phát từ đột biến gen mã hóa yếu tố IX (gen F9) Các đột biến tác động làm suy giảm làm ngừng trình tổng hợp yếu tố IX gen, gây thiếu hụt yếu tố IX dẫn đến tượng chảy máu kéo dài Gen F9 gen lặn nằm nhiễm sắc thể X (Xq27.1-q27.2) hemophilia B bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính Nam giới bị bệnh sinh tất gái người mang gen bệnh Phụ nữ mang gen bệnh có 50% nguy truyền nhiễm sắc thể X đột biến cho lần sinh [5] Chính vậy, phịng bệnh thơng qua chẩn đoán người mang gen bệnh cách tiếp cận hữu hiệu để kiểm soát nguồn gen bệnh Đây nhiệm vụ, mục tiêu chiến lược quản lý bệnh hemophilia B Hiện nay, giới có hai cách tiếp cận khác để chẩn đốn người mang gen bệnh phương pháp phân tích trực tiếp đột biến gây bệnh phương pháp chẩn đốn gián tiếp thơng qua đa hình nucleotide liên kết với gen F9 Phân tích trực tiếp phương pháp tìm đột biến gen người bị bệnh, sau sử dụng đột biến người bệnh làm thị phân tử để chẩn đoán tình trạng mang gen chẩn đốn trước sinh cho thành viên nữ gia đình Như vậy, phương pháp phân tích trực tiếp, đột biến gen người bệnh sở để xác định tình trạng mang gen bệnh Phân tích gián tiếp cịn gọi phân tích liên kết (linkage analysis) Phương pháp không cần xác định cụ thể đột biến gây bệnh mà sử dụng đa hình liên kết với gen F9 bệnh “chỉ điểm” để lần theo dấu vết gen bệnh, từ xác định người mang gen bệnh Để áp dụng phân tích liên kết, ngồi việc đáp ứng yêu cầu mẫu bệnh phẩm, gia đình người bệnh cần xác định người chắn mang gen bệnh dị hợp tử với đa hình gen F9 Việc tìm đa hình dị hợp tử người mang gen gặp nhiều khó khăn khơng có thơng tin tần suất dị hợp tử đa hình Do đó, khảo sát để tìm đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao, đặc trưng cho quần thể đóng bước quan trọng để ứng dụng hiệu phương pháp phân tích liên kết [5] [6] Trên giới, nghiên cứu biến đổi di truyền gen F9 thực từ lâu [7] Đến nay, sở liệu đột biến giới ghi nhận 1000 đột biến gen liên quan đến bệnh hemophilia B nhiều đa hình nucleotide gen F9 [4] Nhiều quốc gia xây dựng sở liệu đột biến gen bệnh nhân đồng thời xác định đa hình có giá trị chẩn đốn, áp dụng linh hoạt hai phương pháp phân tích trực tiếp gián tiếp chẩn đoán người mang gen, hỗ trợ hiệu cơng tác kiểm sốt quản lý bệnh [8] [9] [10] [11] [12] [13] Tại Việt Nam, chẩn đốn quản lý bệnh hemophilia B cịn vấn đề nan giải Theo ghi nhận Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học - Truyền máu TW, năm có hàng trăm ca bệnh phát Số liệu ước tính trung tâm cho thấy có ~ 30.000 người mang gen bệnh nước 20% số chẩn đốn quản lý [14] Chẩn đoán người mang gen để tư vấn tiền hôn nhân tư vấn sinh sản biện pháp để kiểm soát nguồn gen bệnh Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu thực để tìm hiểu đa hình nucleotide gen F9 người Việt Nam; nghiên cứu đột biến gen F9 liên quan đến bệnh hemophilia B tiến hành vài nghiên cứu cỡ mẫu chưa nhiều liệu đột biến gen bệnh nhân thiếu Do cơng tác chẩn đốn quản lý người mang gen chưa hiệu dẫn đến tỷ lệ mắc bệnh gia tăng Chính vậy, với mong muốn tiếp cận để phối hợp hai phương pháp phân tích trực tiếp phân tích gián tiếp chẩn đoán người mang gen bệnh hemophilia B Việt Nam, nghiên cứu sinh thực đề tài “Nghiên cứu đột biến đa hình di truyền gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B” MỤC TIÊU Mục tiêu 1: Lập đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX bệnh nhân hemophilia B Mục tiêu 2: Khảo sát để xác định đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm sở để chẩn đoán người mang gen phương pháp phân tích liên kết NỘI DUNG Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX máy giải trình tự gen hệ (Next-Generation Sequencing) - Thiết kế cặp mồi gối đầu để khuếch đại toàn gen F9 - Xây dựng tối ưu quy trình Long-range PCR khuếch đại gen F9 - Xây dựng quy trình giải trình tự gen F9 kỹ thuật NGS - Khẳng định độ tin cậy quy trình NGS phương pháp Sanger Giải trình tự gen F9 lập đồ đột biến gen F9 100 bệnh nhân hemophilia B Khảo sát mối tương quan kiểu gen đột biến tình trạng bệnh nhóm bệnh nhân nghiên cứu Giải trình tự gen F9 100 người phụ nữ khỏe mạnh Xác định tần suất tỷ lệ dị hợp tử đa hình nucleotide gen F9 NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Là cơng trình Việt Nam nghiên cứu số lượng lớn tổng thể đột biến toàn gen mã hóa yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, bao gồm tất vùng chức năng, exon intron, sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen NGS Là cơng trình nghiên cứu tính đa hình nucleotid gen mã hóa yếu tố IX Việt Nam, thực nghiên cứu cỡ mẫu lớn, phục vụ chẩn đoán người mang gen phương pháp phân tích liên kết CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh hemophilia B 1.1.1 Một số dấu mốc lịch sử phát nghiên cứu bệnh hemophilia B Theo ghi chép sử gia Châu Âu, ghi nhận bệnh máu khó đơng, tên gọi khác bệnh hemophilia B đề cập đến từ kỷ thứ hai sau công nguyên giáo sỹ Do Thái cổ đại thực thủ thuật cắt bao quy đầu cho bé trai sinh Người ta quan sát thấy nhiều em bé bị chảy máu kéo dài dẫn tới tử vong sau thực thủ thuật Ở thời điểm đó, tượng chưa coi bệnh, chưa mô tả hay điều trị gì, mà xem nhiễm trùng Mặc dù vậy, với hậu nghiêm trọng xảy ra, quy định cắt bao quy đầu sau miễn cho cậu bé mà tiền sử có hai anh trai bị chết chảy máu [15] [16] Vào kỷ thứ 10, bác sỹ người Ả Rập, Al-Zahrawi - Albucasis (936-1013), người mô tả bệnh này, phát số người nam giới có tượng dễ bị chảy máu kéo dài gặp chấn thương dù nhỏ Mặc dù chưa biết nguyên nhân bệnh ông đặt tên “bệnh máu”, đồng thời đề xuất phương pháp điều trị đốt vị trí tổn thương đến mạch ngừng chảy máu Đây coi phương pháp điều trị sơ khai bệnh [15] [16] Năm 1803, bác sỹ người Mỹ, John Conrad Otto công bố kết nghiên cứu “mơ tả tình trạng máu khó đơng số gia đình” [17] Trong nghiên cứu, ơng nhận rối loạn có tính chất di truyền, người nam giới bị bệnh người phụ nữ không bị bệnh truyền cho trai họ với tỷ lệ định Những phát định hình đặc điểm bệnh tiền đề cho nghiên cứu vô vùng mạnh mẽ kỷ 19 Năm 1928, thuật ngữ “hemophilia” với ý nghĩa bệnh ưa chảy máu đề cập lần đại học Zurich để mô tả bệnh [15] Bệnh hemophilia B bùng nổ vào kỷ 19 đến 20 xem bệnh “hoàng gia” nhiều hoàng tộc Châu Âu mắc bệnh Nữ hoàng Anh, Victoria coi người mang gen bệnh hemophilia B Con trai bà xuất huyết não sau chấn thương tuổi 31 Gen bệnh từ hai người gái bà lan truyền khắp hoàng tộc Tây Ban Nha, Đức Nga Sự bùng nổ bệnh hemophilia gia đình hồng gia lúc thúc đẩy mạnh mẽ việc tìm hiểu kiến thức y học bệnh [15] [16] Năm 1952, Rosemary Biggs phát bệnh hemophilia B, gọi bệnh Chrismas (theo họ bệnh nhân hemophilia B đầu tiên, Stephan Chrismas) Yếu tố IX đồng thời gọi yếu tố Christmas Các mơ hình nghiên cứu điều trị bệnh hemophia B tập trung nghiên cứu Các chế phẩm điều trị bệnh hemophilia B tối ưu qua giai đoạn: chế phẩm huyết tương tươi máu toàn phần (1960), tủa lạnh (1964), yếu tố đặc có nguồn gốc huyết tương (từ 1970), yếu tố cô đặc tái tổ hợp (từ 1994 đến nay) [15] [16] [18] Năm 1963, Liên đoàn hemophilia giới thành lập, cho thấy quan tâm đặc biệt tới bệnh Liên đoàn tạo lãnh đạo toàn cầu với mục tiêu cải thiện hỗ trợ để trì chăm sóc với cho tất bệnh nhân bị bệnh máu di truyền, có bệnh hemophilia Các phương thức hoạt động Liên đoàn bao gồm: cung cấp khóa đào tạo để tăng độ xác chẩn đốn bệnh, cải thiện chun mơn chăm sóc người bệnh; tăng khả tiếp cận với sản phẩm xử lý an toàn đăc biệt liên kết với trung tâm/đơn vị điều trị bệnh máu di truyền để giúp họ đạt hỗ trợ phủ thơng qua vận động sách Hiện nay, Liên đồn hemophilia giới trở thành mạng lưới toàn cầu, hoạt động hiệu với 97 quốc gia thành viên [19] Năm 1982 đến 1983, gen F9 tách dịng Năm 1985, tồn trình tự gen F9 công bố Cấu trúc chức gen F9 sáng tỏ [7] Từ thời điểm này, phân tích đột biến để xác định tình trạng mang gen chẩn đốn trước sinh phân tích di truyền gián tiếp thơng qua đa hình nucleotide để theo dõi alen đột biến gia đình hemophilia B thực [4] Đến nay, nhiều đột biến gen liên quan đến bệnh hemophilia đa hình gen F9 biết đến, mối liên quan kiểu đột biến gen với kiểu hình bệnh, mối liên quan đột biến gen với chất ức chế làm sáng tỏ, hỗ trợ tích cực cơng tác chẩn đoán, điều trị, quản lý kiểm soát bệnh hemophilia B 1.1.2 Khái quát bệnh hemophilia B 1.1.2.1 Đặc điểm bệnh Người khỏe mạnh bình thường có nồng độ yếu tố IX hoạt tính dao động từ 50150% [20] Khi mạch máu bị tổn thương đứt, trình cầm máu đáp ứng nhanh, khu trú vùng tổn thương kiểm soát chặt chẽ chế co mạch, hình thành nút tiểu cầu, đơng máu, tan cục máu đông phát triển mô xơ cục máu đông để đóng kín vết thương Người bệnh hemophilia B người bị khả kiểm sốt q trình đơng máu nồng độ yếu tố IX hoạt tính giảm 40%, đặc trưng tượng chảy máu kéo dài dễ bị bầm tím [20] [21] Cơ chế phát sinh bệnh hemophilia B xảy đột biến gen F9 Các đột biến làm biến đổi cấu trúc gen, gây suy giảm khả tổng hợp protein gen Tùy loại đột biến vị trí xảy đột biến tạo mức độ thiếu hụt yếu tố IX khác nhau, gây mức độ bệnh khác Dựa vào kết định lượng nồng độ yếu tố IX hoạt tính huyết tương, bệnh hemophilia B chia thành mức độ: nặng nồng độ yếu tố IX < 1%; trung bình nồng độ yếu tố IX từ 1% - 5%; nhẹ nồng độ yếu tố IX dao động từ > 5% đến < 40% [20] [21] Trường hợp bệnh mức độ trung bình nhẹ thường có tượng chảy máu kéo dài sau phẫu thuật chấn thương Mức độ nặng thường xuất tự chảy máu khớp mà không cần lý Khi bị chảy máu, đặc biệt cơ, khớp quan nội tạng bệnh nhân nhẹ tàn phế, bệnh nhân nặng tử vong nhanh Nhưng chẩn đoán sớm điều trị đầy đủ, bệnh nhân hemophilia B có sống gần người bình thường Bệnh hemophilia B di truyền gen lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X, đa số nam giới biểu bệnh, nữ giới thường người mang gen bệnh [22] Người mang gen bệnh khơng có triệu chứng bệnh, có nguy chảy máu bất thường nồng độ yếu tố IX thấp mức bình thường cân đối trình bất hoạt nhiễm sắc thể X (skewed X inactivation) Thế giới ghi nhận số trường hợp nữ giới mắc bệnh hemophilia B, trường hợp mang đột biến đồng hợp tử dị hợp tử kép gen F9 người mang gen hemophilia B có hội chứng Turner (mất nhiễm sắc thể X) người mang gen hemophilia B có hội chứng Testicular Feminization (người nữ giới có kiểu gen nam giới, 46 XY) [3] [4] Đột biến gen bệnh hemophilia B không tự đi, mức độ bệnh thường không thay đổi suốt đời người bệnh Tuy nhiên, năm 1970, Veltlkamp cộng công bố biến thể bệnh hemophilia B kiểu hình hemophilia B Leyden [23] Theo đó, kiểu hình xuất khoảng 3% bệnh nhân, đặc trưng thiếu hụt yếu tố IX nghiêm trọng lúc sinh, từ tuổi thứ 10 nồng độ yếu tố IX bắt đầu tăng dần sau 20 tuổi nồng độ yếu tố IX gần đạt mức bình thường trì suốt đời Đa số bệnh nhân hemophilila B Leyden khơng cần điều trị sống hàng ngày mà phải bổ sung yếu tố đông máu gặp tai nạn điều trị dự phòng trước phẫu thuật Cơ chế hoạt động gen F9 bệnh nhân hemophilia B Leyden liên quan tới đáp ứng androgen nhân tố điều hòa phiên mã nằm vùng promoter gen F9 1.1.2.2 Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia B bệnh lý di truyền bẩm sinh Trong có ~70% bệnh nhiễm sắc thể X đột biến di truyền qua hệ gia đình (70%) Có ~30% trường hợp hemophilia B khơng có tiền sử gia đình, gia đình có người bị bệnh, trường hợp gọi hemophilia B đơn phát (sporadic hemophilia) Hemophilia B đơn phát phát sinh đột biến (de novo) xuất đời sống cá thể mang bệnh [24] Gen mã hóa yếu tố IX nằm nhiễm sắc thể X hemophilia B rối loạn di truyền gen lặn liên kết nhiễm sắc thể X (X-linked recessive disorder) [6] [25] Căn vào quy luật di truyền Mendel, phân tích phả hệ gia đình có tiền sử hemophilia B phát thành viên chắn mang gen bệnh, thành viên có nguy mang gen bệnh bị bệnh Người nam giới bị bệnh hemophilia B sinh tất gái mang gen bệnh (obligate carrier) (Hình 1a) Người phụ nữ mang gen bệnh có nguy truyền nhiễm sắc thể X đột biến cho 50% lần sinh (Hình 1b) Với trường hợp hemophilia đơn phát, gen bệnh bắt đầu di truyền từ phát người bệnh đầu tiên, thành viên nữ hệ gia đình người cần phân tích di truyền để chẩn đốn tình trạng mang gen [5] [21] (1a) (1b) Hình 1.1 Sơ đồ di truyền bệnh hemophilia B [26] 1.1.2.3 Phương pháp chẩn đoán điều trị bệnh a) Chẩn đoán xác định bệnh Nguyên nhân gây bệnh hemophilia B đột biến gen F9 Tuy nhiên, với bệnh nhân hemophilia B không cần thực xét nghiệm phân tích đột biến để chẩn đốn bệnh mà cần thực xét nghiệm định lượng yếu tố IX, xem xét đặc điểm lâm sàng kết hợp với khai thác tiền sử gia đình [14] [21] Về đặc điểm lâm sàng, bệnh nhân hemophilia B thường nam giới với biểu như: dễ bầm tím từ nhỏ; chảy máu lâu cầm, tái phát nhiều lần vị trí chân răng, mũi, vết thương, đái máu, máu, đặc biệt hay bị khớp cơ, có tính chất lặp lại cơ, khớp Chảy máu kéo dài bất thường sau chấn thương, nhổ phẫu thuật, biến dạng khớp, teo chảy máu nhiều lần khớp Khai thác tiền sử gia đình có có người nam giới liên quan họ mẹ bị chảy máu lâu cầm [14] [21] Về xét nghiệm, bệnh nhân hemophilia B có kết định lượng yếu tố IX huyết tương < 40% [14] [21] Trong trình chẩn đốn, cần phân biệt hemophilia B di truyền với hemophilia B mắc phải Bệnh nhân hemophilia mắc phải thường khơng có tiền sử chảy máu bất thường từ nhỏ mà phát sinh bệnh thời điểm đời Nguyên nhân thể tự sinh kháng thể chống lại yếu tố IX mình, xét nghiệm thường thấy nồng độ yếu tố IX giảm có chất ức chế [21] b) Chẩn đoán mức độ bệnh Nồng độ yếu tố IX người bình thường dao động từ 50 - 150% Trường hợp bị bệnh, nồng độ yếu tố IX giảm 40% [27] Để chẩn đoán mức độ bệnh, cần dựa vào kết định lượng nồng độ yếu tố IX Căn vào nồng độ yếu tố IX sở, bệnh chia thành mức độ: - Hemophilia B mức độ nặng: nồng độ yếu tố IX < 1% Những bệnh nhân thường bị chảy máu cơ, khớp cách tự phát, chảy máu không cần lý [27] - Hemophilia B mức trung bình: nồng độ yếu tố IX từ 1-5% Bệnh nhân hemophilia B mức độ trung bình có tượng chảy máu tự phát, thường chảy máu kéo dài sau chấn thương phẫu thuật nhỏ [27] - Hemophilia B mức độ nhẹ: nồng độ yếu tố IX từ - 40% Những bệnh nhân thường bị chảy máu sau chấn thương mạnh phẫu thuật lớn [27] c) Điều trị bệnh Liệu pháp thay protein Bản chất hemophilia B bệnh máu khó đơng thiếu hụt yếu tố IX nên phương pháp điều trị bệnh chủ yếu bổ sung yếu tố thiếu hụt hay gọi liệu pháp thay protein Phương pháp hiệu Yếu tố đông máu thiếu hụt tiêm trực tiếp vào mạch máu, tượng chảy máu dừng lại có đủ lượng yếu tố đơng máu di chuyển đến vị trí chảy máu [28] Các chế phẩm thay protein huyết tương tươi đông lạnh yếu tố IX tái tổ hợp Yếu tố IX cô đặc lựa chọn điều trị cho bệnh nhân hemophilia B Yếu tố đặc có nguồn gốc từ người (tách chiết trực tiếp từ máu) yếu tố cô đặc tái tổ hợp (được sản xuất từ tế bào biến đổi gen) phải xử lý để loại bỏ bất hoạt tất virus gây bệnh tiềm tàng trước trở thành chế phẩm để sử dụng cho bệnh nhân Huyết tương tươi đông lạnh chế phẩm chứa protein 10 máu, có yếu tố IX Hiệu điều trị huyết tương tươi đông lạnh thấp yếu tố đặc nồng độ yếu tố IX huyết tương thấp [28] [29] Liệu pháp gen Liệu pháp gen phương pháp sửa chữa, thay gen bị lỗi để chữa bệnh tận gốc cách đưa gen lành vào thể người bệnh Hemophilia số bệnh nghiên cứu rộng rãi lĩnh vực liệu pháp gen đánh giá thích hợp với phương pháp đặc điểm bệnh lý đơn gen; chế di truyền bệnh hiểu biết tường tận; mơ hình động vật lớn nhỏ bệnh có sẵn cho thử nghiệm tiền lâm sàng; hiệu điều trị bệnh xác định thông qua xét nghiệm đông máu Đặc biệt, ứng dụng liệu pháp gen để chữa bệnh hemophilia có khả thành cơng cao cần nồng độ F9 tăng từ 2-3% so với ban đầu chuyển đổi từ bệnh thể nặng sang thể nhẹ Nồng độ FIX tăng 30% so với ban đầu, bệnh nhân gần khỏi bệnh hoàn toàn Bên cạnh đó, nồng độ F9 tăng cao (150%) người bình thường bệnh nhân khơng có tượng tắc mạch xảy [28] [30] [31] Hiện nhiều kết thử nghiệm lâm sàng phản ánh cách rõ nét thành công liệu pháp gen chữa bệnh hemophilia B Trong hội nghị lớn Hội nghị Huyết học Mỹ, Hội nghị liệu pháp gen tế bào Mỹ, Hội nghị hemophilia giới có nhiều báo cáo kết thử nghiệm lâm sàng hai thể bệnh hemophilia A B [29] [31] [32] 1.2 Cấu trúc chức yếu tố IX trình đơng máu Bình thường máu lịng mạch dạng dung dịch lỏng Khi mạch máu bị tổn thương, máu chảy thể chuyển sang dạng đặc Quá trình chuyển từ dạng lỏng sang dạng đặc gọi q trình đơng máu Đơng máu chế quan trọng để cầm máu, nhằm ngăn cản chảy máu cách nhanh chóng thể bị tổn thương 1.2.1 Các yếu tố đơng máu Q trình đông máu đuợc khởi phát đồng thời hai đường: đường nội sinh đường ngoại sinh (Sơ đồ 1) Trong bao gồm chuỗi liên tiếp phản ứng enzym kết thúc hình thành fibrin cục máu đơng Các chất tham gia vào q trình đơng máu bao gồm protein huyết thanh, yếu tố mô (TF), ion Ca2+, phospholipid màng tế bào tiểu cầu Các chất thúc đẩy q trình đơng 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 Green, P.M., et al., Molecular pathology of haemophilia B Embo j, 1989 8(4): p 1067-72 (EAHAD), E.A.o.H.a.A.D., Coagulation Factor IX Variant Database http://www.factorix.org March 2016 Saad, S., et al., First report on UK database of haemophilia B mutations and pedigrees UK Haemophilia Centres Thromb Haemost, 1994 71(5): p 56370 Liu, J.Z., et al., The human factor IX gene as germline mutagen test: samples from Mainland China have the putatively endogenous pattern of mutation Hum Mutat, 2000 16(1): p 31-6 Ketterling, R.P., et al., Deletions with inversions: report of a mutation and review of the literature Hum Mutat, 1993 2(1): p 53-7 Knobloch, O., et al., Recurrent mutations in the factor IX gene: founder effect or repeat de novo events Investigation of the German haemophilia B population and review of de novo mutations Hum Genet, 1993 92(1): p 408 Nielsen, L.R., et al., Detection of ten new mutations by screening the gene encoding factor IX of Danish hemophilia B patients Thromb Haemost, 1995 73(5): p 774-8 Green, P.M., et al., Haplotype analysis of identical factor IX mutants using PCR Thromb Haemost, 1992 67(1): p 66-9 Bottema, C.D., et al., Missense mutations and evolutionary conservation of amino acids: evidence that many of the amino acids in factor IX function as "spacer" elements Am J Hum Genet, 1991 49(4): p 820-38 Koeberl, D.D., et al., Mutations causing hemophilia B: direct estimate of the underlying rates of spontaneous germ-line transitions, transversions, and deletions in a human gene Am J Hum Genet, 1990 47(2): p 202-17 Driscoll, M.C., E Bouhassira, and L.M Aledort, A codon 338 nonsense mutation in the factor IX gene in unrelated hemophilia B patients: factor IX338 New York Blood, 1989 74(2): p 737-42 Huang, M.N., et al., Molecular defect in factor IXHilo, a hemophilia Bm variant: Arg Gln at the carboxyterminal cleavage site of the activation peptide Blood, 1989 73(3): p 718-21 Thompson, A.R., et al., Factor IX mutations: rapid, direct screening methods for 20 new families with hemophilia B Thromb Res, 1992 65(2): p 289-95 Taylor, S.A., et al., A mutation adjacent to the beta cleavage site of factor IX (valine 182 to leucine) results in mild haemophilia Bm Br J Haematol, 1990 75(2): p 217-21 Tartary, M., et al., Detection of a molecular defect in 40 of 44 patients with haemophilia B by PCR and denaturing gradient gel electrophoresis Br J Haematol, 1993 84(4): p 662-9 Chen, S.H., et al., Three point mutations in the factor IX genes of five hemophilia B patients Identification strategy using localization by altered epitopes in their hemophilic proteins J Clin Invest, 1989 84(1): p 113-8 Odom, M.W., et al., Five novel point mutations: two causing haemophilia B and three causing factor X deficiency Mol Cell Probes, 1994 8(1): p 63-5 Potapov, V and J.L Ong, Examining Sources of Error in PCR by SingleMolecule Sequencing PLoS One, 2017 12(1): p e0169774 43 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 Yohe, S., et al., Clinical validation of targeted next-generation sequencing for inherited disorders 2015 139(2): p 204-210 Rehm, H.L., et al., ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing Genet Med, 2013 15(9): p 733-47 Hartman, P., et al., Next generation sequencing for clinical diagnostics: Five year experience of an academic laboratory Mol Genet Metab Rep, 2019 19: p 100464 Zahari, M., et al., Mutational Profiles of F8 and F9 in a Cohort of Haemophilia A and Haemophilia B Patients in the Multi-ethnic Malaysian Population Mediterr J Hematol Infect Dis, 2018 10(1): p e2018056 Bottema, C.D., et al., The pattern of spontaneous germ-line mutation: relative rates of mutation at or near CpG dinucleotides in the factor IX gene Hum Genet, 1993 91(5): p 496-503 Green, P., et al., Haemophilia B mutations in a complete Swedish population sample: a test of new strategy for the genetic counselling of diseases with high mutational heterogeneity 1991 78(3): p 390-397 Gao, W., et al., Characterization of missense mutations in the signal peptide and propeptide of FIX in hemophilia B by a cell-based assay Blood Adv, 2020 4(15): p 3659-3667 Bentley, A., et al., Defective propeptide processing of blood clotting factor IX caused by mutation of arginine to glutamine at position− 1986 45(3): p 343-348 Ware, J., et al., Factor IX San Dimas: Substitution of glutamine for arg− in the propeptide leads to incomplete γ-carboxylation and altered phospholipid binding properties 1989 264(19): p 11401-11406 Lodish, H and S.L.J.B.M.B.E Zipursky, Molecular cell biology 2001 29: p 126-133 Kojima, T., et al., Possible absence of common polymorphisms in coagulation factor IX gene in Japanese subjects 1987 Graham, J., et al., The varying frequencies of five DNA polymorphisms of Xlinked coagulant factor IX in eight ethnic groups 1991 49(3): p 537 Driscoll, M.C., et al., A second BamHI DNA polymorphism and haplotype association in the factor IX gene 1988 Winship, P and I.J.B.J.H Peake, A clinically useful RFLP in the 5'flanking region of the factor IX gene 1992 80: p 26a Machado, F.B., et al., Informativeness of a novel multiallelic marker-set comprising an F8 intron 21 and three tightly linked loci for haemophilia A carriership analysis Haemophilia, 2011 17(2): p 257-66 Ljung, R.C.J.B.s.c.h., Prenatal diagnosis of haemophilia 1996 9(2): p 243-257 Shetty, S., et al., Factor VIII and IX gene polymorphisms and carrier analysis in Indian population 1997 54(4): p 271-275 44 PHỤ LỤC Phụ lục 01: KẾT QUẢ KIỂM TRA NỒNG ĐỘ VÀ ĐỘ TINH SẠCH CỦA CÁC MẪU ADN TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu HB1 108.8 ng/µl 2.176 1.146 1.9 2.52 DNA HB2 94 ng/µl 1.88 0.983 1.91 2.51 DNA HB3 150.1 ng/µl 3.002 1.569 1.91 2.51 DNA HB4 108.1 ng/µl 2.162 1.137 1.9 2.5 DNA HB5 93 ng/µl 1.859 0.974 1.91 2.49 DNA HB6 225.6 ng/µl 4.513 2.399 1.88 2.48 DNA HB7 100.3 ng/µl 2.006 1.059 1.89 2.46 DNA HB8 183 ng/µl 3.66 1.936 1.89 2.46 DNA HB9 188.7 ng/µl 3.774 1.986 1.9 2.45 DNA 10 HB10 138.5 ng/µl 2.77 1.474 1.88 2.44 DNA 11 HB11 164.9 ng/µl 3.298 1.717 1.92 2.44 DNA 12 HB12 103 ng/µl 2.059 1.082 1.9 2.43 DNA 13 HB13 113.6 ng/µl 2.273 1.22 1.86 2.43 DNA 14 HB14 83.6 ng/µl 1.672 0.881 1.9 2.42 DNA 15 HB15 125.8 ng/µl 2.517 1.337 1.88 2.42 DNA 16 HB16 113.4 ng/µl 2.267 1.171 1.94 2.41 DNA 17 HB17 175.9 ng/µl 3.517 1.861 1.89 2.41 DNA 18 HB18 178.7 ng/µl 3.574 1.898 1.88 2.41 DNA 19 HB19 94 ng/µl 1.881 1.004 1.87 2.4 DNA 20 HB20 116.3 ng/µl 2.325 1.23 1.89 2.4 DNA 21 HB21 144.1 ng/µl 2.881 1.531 1.88 2.4 DNA 22 HB22 187.8 ng/µl 3.757 1.953 1.92 2.4 DNA 23 HB23 188.9 ng/µl 3.777 2.01 1.88 2.4 DNA 24 HB24 190.8 ng/µl 3.816 1.997 1.91 2.4 DNA 25 HB25 104.4 ng/µl 2.087 1.102 1.89 2.39 DNA 26 HB26 138.6 ng/µl 2.773 1.454 1.91 2.39 DNA 27 HB27 157.8 ng/µl 3.155 1.671 1.89 2.39 DNA 28 HB28 194.5 ng/µl 3.889 2.043 1.9 2.39 DNA 29 HB29 85.1 ng/µl 1.703 0.872 1.95 2.38 DNA 30 HB30 149.8 ng/µl 2.995 1.594 1.88 2.38 DNA 31 HB31 169.7 ng/µl 3.395 1.78 1.91 2.38 DNA 45 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 32 HB32 175.5 ng/µl 3.51 1.824 1.92 2.38 DNA 33 HB33 216.8 ng/µl 4.336 2.28 1.9 2.38 DNA 34 HB34 258.3 ng/µl 5.167 2.744 1.88 2.38 DNA 35 HB35 178.4 ng/µl 3.569 1.859 1.92 2.37 DNA 36 HB36 121 ng/µl 2.42 1.267 1.91 2.36 DNA 37 HB37 132 ng/µl 2.639 1.402 1.88 2.36 DNA 38 HB38 184.3 ng/µl 3.685 1.942 1.9 2.36 DNA 39 HB39 329.6 ng/µl 6.592 3.486 1.89 2.36 DNA 40 HB40 82.4 ng/µl 1.647 0.847 1.94 2.35 DNA 41 HB41 120 ng/µl 2.4 1.27 1.89 2.35 DNA 42 HB42 149 ng/µl 2.979 1.516 1.96 2.35 DNA 43 HB43 165.5 ng/µl 3.309 1.734 1.91 2.35 DNA 44 HB44 169.4 ng/µl 3.389 1.784 1.9 2.35 DNA 45 HB45 87 ng/µl 1.739 0.888 1.96 2.34 DNA 46 HB46 92.6 ng/µl 1.852 0.984 1.88 2.34 DNA 47 HB47 124.3 ng/µl 2.487 1.314 1.89 2.34 DNA 48 HB48 169.5 ng/µl 3.39 1.799 1.88 2.34 DNA 49 HB49 182.1 ng/µl 3.642 1.921 1.9 2.34 DNA 50 HB50 215.3 ng/µl 4.306 2.248 1.91 2.34 DNA 51 HB51 252.2 ng/µl 5.045 2.646 1.91 2.34 DNA 52 HB52 260.1 ng/µl 5.202 2.719 1.91 2.34 DNA 53 HB53 267 ng/µl 5.34 2.816 1.9 2.34 DNA 54 HB54 299.8 ng/µl 5.995 3.177 1.89 2.34 DNA 55 HB55 453.6 ng/µl 9.072 4.77 1.9 2.34 DNA 56 HB56 89.4 ng/µl 1.787 0.953 1.88 2.33 DNA 57 HB57 93.3 ng/µl 1.867 0.989 1.89 2.33 DNA 58 HB58 124.8 ng/µl 2.496 1.276 1.96 2.33 DNA 59 HB59 177.1 ng/µl 3.541 1.83 1.93 2.33 DNA 60 HB60 206.6 ng/µl 4.132 2.161 1.91 2.33 DNA 61 HB61 227.3 ng/µl 4.546 2.397 1.9 2.33 DNA 62 HB62 747.1 ng/µl 14.942 7.939 1.88 2.33 DNA 63 HB63 93.2 ng/µl 1.864 0.994 1.88 2.32 DNA 64 HB64 125.2 ng/µl 2.504 1.33 1.88 2.32 DNA 65 HB65 159.7 ng/µl 3.193 1.7 1.88 2.32 DNA 66 HB66 291.9 ng/µl 5.839 3.084 1.89 2.32 DNA 46 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 67 HB67 297.4 ng/µl 5.948 3.146 1.89 2.32 DNA 68 HB68 467.4 ng/µl 9.349 4.945 1.89 2.32 DNA 69 HB69 138.5 ng/µl 2.77 1.456 1.9 2.31 DNA 70 HB70 175 ng/µl 3.501 1.845 1.9 2.31 DNA 71 HB71 214 ng/µl 4.28 2.261 1.89 2.31 DNA 72 HB72 221.9 ng/µl 4.438 2.337 1.9 2.31 DNA 73 HB73 244.1 ng/µl 4.881 2.506 1.95 2.31 DNA 74 HB74 258.1 ng/µl 5.161 2.697 1.91 2.31 DNA 75 HB75 268.2 ng/µl 5.363 2.81 1.91 2.31 DNA 76 HB76 275.6 ng/µl 5.512 2.891 1.91 2.31 DNA 77 HB77 334.8 ng/µl 6.697 3.526 1.9 2.31 DNA 78 HB78 408.6 ng/µl 8.173 4.259 1.92 2.31 DNA 79 HB79 506.1 ng/µl 10.122 5.324 1.9 2.31 DNA 80 HB80 600.5 ng/µl 12.011 6.334 1.9 2.31 DNA 81 HB81 742.4 ng/µl 14.848 7.862 1.89 2.31 DNA 82 HB82 93.5 ng/µl 1.87 0.986 1.9 2.3 DNA 83 HB83 100.4 ng/µl 2.008 1.062 1.89 2.3 DNA 84 HB84 118.6 ng/µl 2.372 1.231 1.93 2.3 DNA 85 HB85 119.8 ng/µl 2.396 1.278 1.87 2.3 DNA 86 HB86 130.8 ng/µl 2.617 1.394 1.88 2.3 DNA 87 HB87 142.2 ng/µl 2.844 1.506 1.89 2.3 DNA 88 HB88 151.6 ng/µl 3.032 1.567 1.93 2.3 DNA 89 HB89 172.4 ng/µl 3.447 1.819 1.9 2.3 DNA 90 HB90 185.2 ng/µl 4.688 2.456 1.91 2.29 DNA 91 HB91 189.8 ng/µl 3.797 1.99 1.91 2.3 DNA 92 HB92 200.4 ng/µl 4.009 2.108 1.9 2.3 DNA 93 HB93 220.1 ng/µl 4.403 2.342 1.88 2.3 DNA 94 HB94 242.3 ng/µl 4.846 2.556 1.9 2.3 DNA 95 HB95 246.3 ng/µl 4.926 2.606 1.89 2.3 DNA 96 HB96 360.6 ng/µl 7.212 3.767 1.91 2.3 DNA 97 HB97 409 ng/µl 8.18 4.299 1.9 2.3 DNA 98 HB98 517.7 ng/µl 10.355 5.506 1.88 2.3 DNA 99 HB99 747.9 ng/µl 14.958 7.953 1.88 2.3 DNA 100 HB100 1084.2 ng/µl 21.683 11.429 1.9 2.3 DNA 101 NK1 90 ng/µl 1.95 2.29 DNA 1.8 0.923 47 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 102 NK2 93.6 ng/µl 3.388 1.75 1.94 2.29 DNA 103 NK3 111.7 ng/µl 2.235 1.177 1.9 2.29 DNA 104 NK4 119 ng/µl 2.38 1.265 1.88 2.29 DNA 105 NK5 207.5 ng/µl 4.149 2.179 1.9 2.29 DNA 106 NK6 207.5 ng/µl 4.15 2.177 1.91 2.29 DNA 107 NK7 234.4 ng/µl 4.688 2.456 1.91 2.29 DNA 108 NK8 234.9 ng/µl 4.699 2.473 1.9 2.29 DNA 109 NK9 247.2 ng/µl 4.943 2.538 1.95 2.29 DNA 110 NK10 247.5 ng/µl 4.95 2.6 1.9 2.29 DNA 111 NK11 255.6 ng/µl 5.112 2.669 1.92 2.29 DNA 112 NK12 276.5 ng/µl 5.531 2.889 1.91 2.29 DNA 113 NK13 303.1 ng/µl 6.063 3.211 1.89 2.29 DNA 114 NK14 305.7 ng/µl 6.115 3.179 1.92 2.29 DNA 115 NK15 314.5 ng/µl 6.29 3.268 1.92 2.29 DNA 116 NK16 363 ng/µl 7.261 3.762 1.93 2.29 DNA 117 NK17 410.5 ng/µl 8.21 4.274 1.92 2.29 DNA 118 NK18 629.4 ng/µl 12.588 6.687 1.88 2.29 DNA 119 NK19 752.9 ng/µl 15.057 7.955 1.89 2.29 DNA 120 NK20 798.3 ng/µl 15.965 8.403 1.9 2.29 DNA 121 NK21 158.3 ng/µl 3.167 1.683 1.88 2.28 DNA 122 NK22 169.4 ng/µl 3.388 1.75 1.94 2.28 DNA 123 NK23 198.1 ng/µl 3.963 2.095 1.89 2.28 DNA 124 NK24 268.5 ng/µl 5.371 2.854 1.88 2.28 DNA 125 NK25 280.7 ng/µl 5.613 2.956 1.9 2.28 DNA 126 NK26 290.8 ng/µl 5.816 3.082 1.89 2.28 DNA 127 NK27 324.1 ng/µl 6.482 3.417 1.9 2.28 DNA 128 NK28 382.4 ng/µl 7.648 4.048 1.89 2.28 DNA 129 NK29 426.7 ng/µl 8.534 4.552 1.87 2.28 DNA 130 NK30 451.1 ng/µl 9.021 4.751 1.9 2.28 DNA 131 NK31 474.3 ng/µl 9.486 4.96 1.91 2.28 DNA 132 NK32 479.1 ng/µl 9.582 5.041 1.9 2.28 DNA 133 NK33 99.8 ng/µl 1.997 1.056 1.89 2.27 DNA 134 NK34 121.8 ng/µl 2.436 1.29 1.89 2.27 DNA 135 NK35 170.8 ng/µl 3.415 1.805 1.89 2.27 DNA 136 NK36 336.6 ng/µl 6.731 3.502 1.92 2.27 DNA 48 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 137 NK37 438.1 ng/µl 8.763 4.513 1.94 2.27 DNA 138 NK38 453.2 ng/µl 9.064 4.778 1.9 2.27 DNA 139 NK39 474.9 ng/µl 9.498 4.875 1.95 2.27 DNA 140 NK40 627.1 ng/µl 12.542 6.706 1.87 2.27 DNA 141 NK41 898.4 ng/µl 17.969 9.575 1.88 2.27 DNA 142 NK42 1395.1 ng/µl 27.902 14.846 1.88 2.27 DNA 143 NK43 84.5 ng/µl 1.691 0.889 1.9 2.26 DNA 144 NK44 90.4 ng/µl 1.809 0.949 1.91 2.26 DNA 145 NK45 96.4 ng/µl 1.929 0.992 1.94 2.26 DNA 146 NK46 143.1 ng/µl 2.861 1.512 1.89 2.26 DNA 147 NK47 159.6 ng/µl 3.192 1.666 1.92 2.26 DNA 148 NK48 186.9 ng/µl 3.739 1.963 1.9 2.26 DNA 149 NK49 240 ng/µl 4.801 2.491 1.93 2.26 DNA 150 NK50 321 ng/µl 6.419 3.393 1.89 2.26 DNA 151 NK51 365.7 ng/µl 7.314 3.844 1.9 2.26 DNA 152 NK52 586.6 ng/µl 11.732 6.18 1.9 2.26 DNA 153 NK53 138.9 ng/µl 2.777 1.48 1.88 2.25 DNA 154 NK54 140.4 ng/µl 2.809 1.499 1.87 2.25 DNA 155 NK55 152.3 ng/µl 3.046 1.62 1.88 2.25 DNA 156 NK56 155.1 ng/µl 3.103 1.633 1.9 2.25 DNA 157 NK57 217.7 ng/µl 4.354 2.291 1.9 2.25 DNA 158 NK58 224.6 ng/µl 4.493 2.344 1.92 2.25 DNA 159 NK59 240.4 ng/µl 4.809 2.409 2.25 DNA 160 NK60 269.2 ng/µl 5.384 2.825 1.91 2.25 DNA 161 NK61 317.5 ng/µl 6.35 3.343 1.9 2.25 DNA 162 NK62 355.4 ng/µl 7.109 3.651 1.95 2.25 DNA 163 NK63 1231.5 ng/µl 24.63 12.979 1.9 2.25 DNA 164 NK64 96.2 ng/µl 1.924 1.012 1.9 2.24 DNA 165 NK65 102.4 ng/µl 2.048 1.042 1.97 2.24 DNA 166 NK66 124.4 ng/µl 2.489 1.279 1.95 2.24 DNA 167 NK67 154.8 ng/µl 3.095 1.607 1.93 2.24 DNA 168 NK68 166.4 ng/µl 3.329 1.655 2.24 DNA 169 NK69 172.7 ng/µl 3.455 1.827 1.89 2.24 DNA 170 NK70 224.8 ng/µl 4.495 2.409 1.87 2.24 DNA 171 NK71 270.5 ng/µl 5.411 2.839 1.91 2.24 DNA 49 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 172 NK72 271.8 ng/µl 5.435 2.889 1.88 2.24 DNA 173 NK73 409.6 ng/µl 8.192 4.313 1.9 2.24 DNA 174 NK74 497.1 ng/µl 9.942 5.265 1.89 2.24 DNA 175 NK75 642.6 ng/µl 12.853 6.788 1.89 2.24 DNA 176 NK76 737.1 ng/µl 14.741 7.973 1.85 2.24 DNA 177 NK77 185.9 ng/µl 3.717 1.937 1.92 2.23 DNA 178 NK78 364.1 ng/µl 7.281 3.836 1.9 2.23 DNA 179 NK79 365.2 ng/µl 7.304 3.878 1.88 2.23 DNA 180 NK80 619.2 ng/µl 12.383 6.414 1.93 2.23 DNA 181 NK81 921.8 ng/µl 18.435 9.887 1.86 2.23 DNA 182 NK82 113.2 ng/µl 2.264 1.194 1.9 2.22 DNA 183 NK83 364 ng/µl 7.279 3.763 1.93 2.22 DNA 184 NK84 364.4 ng/µl 7.288 3.82 1.91 2.22 DNA 185 NK85 114.5 ng/µl 2.29 1.196 1.92 2.21 DNA 186 NK86 156.3 ng/µl 3.126 1.651 1.89 2.21 DNA 187 NK87 157.4 ng/µl 3.148 1.674 1.88 2.21 DNA 188 NK88 176.1 ng/µl 3.523 1.882 1.87 2.21 DNA 189 NK89 331.8 ng/µl 6.636 3.508 1.89 2.21 DNA 190 NK90 401.1 ng/µl 8.021 4.245 1.89 2.21 DNA 191 NK91 481.2 ng/µl 9.624 5.135 1.87 2.21 DNA 192 NK92 699.6 ng/µl 13.991 7.558 1.85 2.21 DNA 193 NK93 94.1 ng/µl 1.883 0.998 1.89 2.2 DNA 194 NK94 140.2 ng/µl 2.805 1.465 1.91 2.2 DNA 195 NK95 155 ng/µl 3.099 1.616 1.92 2.2 DNA 196 NK96 277.8 ng/µl 5.556 2.965 1.87 2.2 DNA 197 NK97 89.9 ng/µl 1.799 0.954 1.89 2.19 DNA 198 NK98 131.1 ng/µl 2.623 1.371 1.91 2.19 DNA 199 NK99 180.1 ng/µl 3.602 1.895 1.9 2.19 DNA 200 NK100 204.2 ng/µl 4.084 2.151 1.9 2.19 DNA 201 MG01 254.5 ng/µl 15.965 8.403 1.9 2.19 DNA 202 MG02 546.8 ng/µl 10.937 5.634 1.94 2.19 DNA 203 MG03 110.7 ng/µl 2.213 1.168 1.9 2.18 DNA 204 MG04 147.3 ng/µl 2.947 1.5 1.96 2.18 DNA 205 MG05 170.4 ng/µl 3.407 1.798 1.89 2.18 DNA 206 MG06 287.9 ng/µl 5.758 3.028 1.9 2.18 DNA 50 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 207 MG07 96.6 ng/µl 1.932 1.014 1.91 2.17 DNA 208 MG08 235.7 ng/µl 4.715 2.508 1.88 2.17 DNA 209 MG09 406.4 ng/µl 8.128 4.24 1.92 2.17 DNA 210 MG10 87.1 ng/µl 1.741 0.917 1.9 2.16 DNA 211 MG11 110.7 ng/µl 2.214 1.185 1.87 2.16 DNA 212 MG12 249.5 ng/µl 4.99 2.636 1.89 2.16 DNA 213 MG13 193.7 ng/µl 3.874 2.06 1.88 2.15 DNA 214 MG14 479.6 ng/µl 9.592 5.1 1.88 2.14 DNA 215 MG15 85.8 ng/µl 1.716 0.868 1.98 2.13 DNA 216 MG16 89.8 ng/µl 1.796 0.935 1.92 2.13 DNA 217 MG17 140 ng/µl 2.799 1.508 1.86 2.13 DNA 218 MG18 151.5 ng/µl 3.031 1.558 1.94 2.13 DNA 219 MG19 527.8 ng/µl 10.556 5.558 1.9 2.13 DNA 220 MG20 563.3 ng/µl 11.265 5.998 1.88 2.13 DNA 221 MG21 280.2 ng/µl 5.603 2.924 1.92 2.11 DNA 222 MG22 99 ng/µl 1.981 1.04 1.91 2.07 DNA 223 MG23 127.6 ng/µl 2.552 1.371 1.86 2.07 DNA 51 Phụ lục 02: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN F9 CỦA 100 BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B STT Mã BN Năm sinh Giới tính % FIX Mức độ bệnh Có ức chế Biến đổi nucleotide (HGVS cDNA) Biến đổi axit amin (HGVS protein) Loại đột biến Vị trí Domain HB01 1999 Nam Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP HB02 1994 Nam 0.1 Nặng không c.1135C>T p.Arg379* nonsense exon SP HB03 2012 Nam 0.6 Nặng không c.1276A>G p.Thr426Ala missense exon SP HB04 2010 Nam 0,6 Nặng không c.128G>A p.Arg43Gln missense exon PRO HB05 2003 Nam C p.Cys128Arg missense exon EGF1 HB06 2009 Nam T p.Arg226Trp missense exon AP HB07 1981 Nam 0.1 Nặng không c.1135C>T p.Arg379* nonsense exon SP HB08 2005 Nam 0.1 Nặng không c.689G>T p.Gly230Val missense exon SP HB09 2013 Nam A p.Ser430Arg missense exon SP 10 HB10 1983 Nam 0.3 Nặng không c.1213G>A p.Asp405Asn missense exon SP 11 HB11 1995 Nam 0.1 Nặng không c.1213G>A p.Asp405Asn missense exon SP 12 HB12 1988 Nam 0.1 Nặng không c.127C>T p.Arg43Trp missense exon PRO 13 HB13 1984 Nam 0.1 Nặng không c.1213G>A p.Asp405Asn missense exon SP STT Mã BN Năm Giới % Mức Có Biến đổi nucleotide Biến đổi Loại Vị trí Domain 52 sinh tính FIX độ bệnh ức chế (HGVS cDNA) axit amin đột biến (HGVS protein) 14 HB14 2012 Nam 0.4 Nặng không del_exon - large del exon EGF2 15 HB15 1991 Nam 0.1 Nặng không c.677G>A p.Arg226Gln missense exon AP 16 HB16 1985 Nam 0.2 Nặng không c.433T>C p.Cys145Arg missense exon EGF2 17 HB17 2015 Nam 3.2 Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP 18 HB18 1975 Nam 0.2 Nặng không c.470G>T p.Cys157Phe missense exon EGF2 19 HB19 1953 Nam 0,3 Nặng không c.1135C>T p.Arg379* nonsense exon SP 20 HB20 1988 Nữ 2.1 Trung bình khơng c.881G>A (Đồng hợp tử) p.Arg294Gln missense exon SP 21 HB21 1964 Nam Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP 22 HB22 2013 0.4 Nặng không c.874C>T p.Gln292* nonsense exon SP 23 HB23 1984 Nam 0.1 Nặng không c.1243C>A p.His415Asn missense exon SP 24 HB24 1980 Nam 0.1 Nặng không c.344A>G p.Tyr115Cys missense exon EGF1 25 HB25 2000 Nam 0,4 Nặng không c.956T>C p.Leu319Pro missense exon SP 26 HB26 1998 Nam 0,1 Nặng không c.952delC p.Leu318Phefs*8 frameshift exon SP 27 HB27 1981 Nam 0,5 Nặng không c.253-1G>C splice site 28 HB28 1989 Nam 0,2 Nặng không c.755G>C p.Cys252Ser missense exon SP 29 HB29 2012 Nam 0.1 Nặng không c.1069G>C p.Gly357Arg missense exon SP 30 HB30 2013 Nam 0.5 Nặng không c.223C>T p.Arg75* nonsense exon GLA STT Mã BN Năm Giới % Mức Có Biến đổi nucleotide Biến đổi Loại Vị trí Domain Nam splice site intron - 53 sinh tính FIX độ bệnh ức chế (HGVS cDNA) axit amin đột biến (HGVS protein) 31 HB31 1980 Nam 0.2 Nặng không c.1213G>A p.Asp405Asn missense exon SP 32 HB32 1998 Nam 0.3 Nặng không c.1369A>T p.Lys457* nonsense exon SP 33 HB33 1985 Nam 0.1 Nặng không c.422G>A p.Cys141Tyr missense exon EGF2 34 HB34 1955 Nam 0.3 Nặng không c.383G>A p.Cys128Tyr missense exon EGF1 35 HB35 1977 Nam 0.5 Nặng không c.1243C>A p.His415Asn missense exon SP 36 HB36 2015 Nam 0.4 Nặng không c.1213G>A p.Asp405Asn missense exon SP 37 HB37 2006 Nam 0.5 Nặng không c.206G>A p.Cys69Tyr missense exon GLA 38 HB38 2007 Nam 0.9 Nặng không c.88G>T p.Val30Phe missense exon PRO 39 HB39 2005 Nam 0.4 Nặng không c.761G>A p.Gly254Asp missense exon SP 40 HB40 2005 Nam 0.7 Nặng không c.1136G>A p.Arg379Gln missense exon SP 41 HB41 1980 Nam 0.3 Nặng không c.1135C>T p.Arg379* nonsense exon SP 42 HB42 2015 Nam 0.2 Nặng không c.127C>T p.Arg43Trp missense exon PRO 43 HB43 1980 Nam 0.5 Nặng không c.206G>A p.Cys69Tyr missense exon GLA 44 HB44 1990 Nam 0.3 Nặng không c.278-3A>G Splice site 45 HB45 1992 Nam 0.2 Nặng không c.127C>T p.Arg43Trp missense exon PRO 46 HB46 2010 Nam 0.5 Nặng không c.1331A>G p.Tyr444Cys missense exon SP Splice site intron - 54 STT Mã BN Năm sinh Giới tính % FIX Mức độ bệnh Có ức chế Biến đổi nucleotide (HGVS cDNA) Biến đổi axit amin (HGVS protein) Loại đột biến Vị trí Domain 47 HB47 1976 Nam 2.2 Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP 48 HB48 1980 Nam 0.4 Nặng không c.223C>T p.Arg75* nonsense exon GLA 49 HB49 1970 Nam 0.9 Nặng không c.947T>C p.Ile316Thr missense exon SP 50 HB50 1989 Nam 0.5 Nặng không c.1220G>C p.Cys407Ser missense exon SP 51 HB51 2016 Nam 0.7 Nặng không c.127C>T p.Arg43Trp missense exon PRO 52 HB52 2003 Nam 0.3 Nặng không c348-349insGA pGlu116Glufs*15 frameshift exon EGF1 53 HB53 1991 Nam 1.3 Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP 54 HB54 1990 Nam 0.5 Nặng không c.838+1G>A splice site splice site intron - 55 HB55 2012 Nam 0.1 Nặng không c.1220G>A p.Cys407Tyr missense exon SP 56 HB56 2009 Nam Trung bình khơng c.128G>A p.Arg43Gln missense exon PRO 57 HB57 1975 Nam 0.2 Nặng không c.470G>T p.Cys157Phe missense exon EGF2 58 HB58 2008 Nam 4.4 Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP 59 HB59 2011 Nam 0.3 Nặng không c.1024A>C p.Thr342Pro missense exon SP 60 HB60 1981 Nam Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP 61 HB61 2012 Nam 1.5 Trung bình khơng c.127C>T p.Arg43Trp missense exon PRO 62 HB62 1993 Nam 2.8 Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP 63 HB63 1993 Nam 0.9 Nặng không c.128G>A p.Arg43Gln missense exon PRO 64 HB64 2012 Nam 2.3 Trung bình khơng c.137G>T p.Arg46Met missense exon PRO 55 STT Mã BN Năm Giới % Mức Có sinh tính FIX độ bệnh ức chế Biến đổi Biến đổi nucleotide axit amin (HGVS cDNA) (HGVS protein) Loại đột biến Vị trí Domain 65 HB65 2007 Nam 0,1 Nặng khơng c.956T>C p.Leu319Pro missense exon SP 66 HB66 1981 Nam 0,2 Nặng không c.1004G>A p.Cys335Tyr missense exon SP 67 HB67 1985 Nam 0,1 Nặng không c.206G>A p.Cys69Tyr missense exon GLA 68 HB68 1950 Nam 1.1 Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP 69 HB69 1998 Nam 10 Nhẹ không c.149G>A p.Gly50Asp missense exon GLA 70 HB70 2015 Nam 0,1 Nặng không c.1238G>A p.Gly413Glu missense exon SP 71 HB71 2011 Nam 0.1 Nặng không c.676C>T p.Arg226Trp missense exon AP 72 HB72 2015 Nam 0.2 Nặng không c.1159-1161del p.Lys387del small del exon SP 73 HB73 2012 Nam 0.1 Nặng không c.1213G>A p.Asp405Asn missense exon SP 74 HB74 2014 Nam A p.Arg226Gln missense exon AP 75 HB75 1997 Nam 0.1 Nặng không c.1369A>T p.Lys457* nonsense exon SP 76 HB76 1948 Nam >5 Nhẹ không c.942T>A p.His314.Gln missense exon SP 77 HB77 2000 Nam 3.6 Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP 78 HB78 2009 Nam 1.2 Trung bình khơng c.881G>A p.Arg294Gln missense exon SP 79 HB79 1992 Nam 0.3 Nặng không c.1060del A p.Ser354Valfs*14 small del exon SP 80 HB80 1973 Nam 0.1 Nặng không c.914A>G p.Tyr305Cys missense exon SP 81 HB81 2004 Nam 4.5 Trung bình khơng c.-21C>T - - promoter - 56 STT Mã BN Năm sinh Giới tính % FIX Mức độ bệnh Có ức chế Biến đổi nucleotide (HGVS cDNA) Biến đổi axit amin (HGVS protein) Loại đột biến Vị trí Domain 82 HB82 2008 Nam 0.2 Nặng khơng c.215A>G p.Glu72Gly missense exon GLA 83 HB83 1998 Nam Trung bình khơng c.520+13A>G - splice site intron - 84 HB84 2017 Nam 0.2 Nặng không c.1181T>A p.Met394Lys missense exon SP 85 HB85 2012 Nam 0.1 Nặng không c.277+4A>G - splice site intron - 86 HB86 2017 Nam 0.1 Nặng không c.1084A>T P.Lys362* nonsense exon SP 87 HB87 1980 Nam 20.6 Nhẹ không c.149G>A p.Gly50Asp missense exon GLA 88 HB88 2004 Nam 0.3 Nặng không c.349T>A p.Cys117Ser missense exon EGF1 89 HB89 2006 Nam 0.3 Nặng không c.1369A>T p.Lys457* nonsense exon SP 90 HB90 2017 Nam 0.1 Nặng không c.349T>A p.Cys117Ser missense exon EGF1 91 HB91 2006 Nam 0.1 Nặng không c.718T>C p.Trp240Arg missense exon SP 92 HB92 2011 Nam G - splice site intron - 93 HB93 2014 Nam