Luận án nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố ix ở bệnh nhân hemophilia b tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - VŨ THỊ BÍCH HƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2022 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS Dương Quốc Chính Viện Huyết học – Truyền máu TW Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS.TS Vũ Minh Phương Phản biện 2: PGS.TS Lương Thị Lan Anh Phản biện 3: PGS.TS Vũ Thị Thơm Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … … , ngày … tháng … năm … Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Hemophilia B rối loạn chảy máu thiếu hụt yếu tố IX (FIX) Đây bệnh lý khó điều trị, để lại hậu quả nghiêm trọng đe dọa tính mạng người bệnh Cơ chế sinh bệnh hemophilia B đột biến gen mã hóa yếu tố IX (F9) làm giảm chức tổng hợp FIX gen, dẫn đến thiếu hụt yếu tố IX gây tượng chảy máu kéo dài Gen F9 gen lặn nằm nhiễm sắc thể X nên có tính chất di truyền qua hệ Do đó, chẩn đốn người mang gen bệnh cách tiếp cận để kiểm soát nguồn gen bệnh, hạn chế tỷ lệ mắc bệnh thơng qua chẩn đốn trước sinh, chẩn đốn trước chuyển phơi Đột biến đa hình nằm gen F9 cơng cụ chủ đạo để chẩn đốn người mang gen bệnh hemophialia B Các biến đổi di truyền có tính quần thể, việc khảo sát để tìm đột biến đa hình đặc trưng cho quần thể có vai trị quan trọng nhằm thiết lập cơng cụ chẩn đốn hiệu phù hợp Trên giới, nghiên cứu đột biến đa hình nucleotde gen F9 gen hemophilia thực từ lâu Nhiều quốc gia công bố đặc điểm đột biến đa hình nucleotide có giá trị thơng tin quần thể mình, góp phần hiệu chăm sóc, kiểm sốt quản lý bệnh hemophilia B Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu khảo sát tìm hiểu đa hình nucleotide gen F9 đặc trưng cho người Việt Nam Nghiên cứu đột biến gen F9 liên quan đến bệnh hemophilia B chưa nhiều, tính đại diện chưa cao chưa nghiên cứu đầy đủ toàn gen F9 Trong đó, tỷ lệ bệnh nhân gia tăng hàng năm Chính vậy, nghiên cứu tổng quát toàn gen F9 với cỡ mẫu lớn để thiết lập cơng cụ chẩn đốn đặc trưng hiệu cho người Việt Nam nhiệm vụ quan trọng nhằm góp phần kiểm sốt nguồn gen bệnh Với lý đó, nghiên cứu sinh thực đề tài “Nghiên cứu đột biến đa hình di truyền gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B” Mục tiêu nghiên cứu luận án: (1) Lập đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX bệnh nhân hemophilia B (2) Xác định đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm sở để chẩn đoán người mang gen phương pháp phân tích liên kết Các nội dung nghiên cứu luận án: (1) Xây dựng quy trình giải trình tự gen F9 hệ thống giải trình tự NGS (2) Giải trình tự lập đồ đột biến gen F9 100 bệnh nhân Khảo sát mối tương quan kiểu gen đột biến tình trạng bệnh (3) Giải trình tự gen F9 100 người phụ nữ bình thường Xác định tần suất tỷ lệ dị hợp tử đa hình nucleotide gen F9 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh hemophilia B 1.1.1 Một số dấu mốc lịch sử phát nghiên cứu bệnh hemophilia B Thế kỷ thứ hai sau công nguyên có ghi nhận bệnh máu khó đơng Năm 1928, thuật ngữ “hemophilia” đề cập lần Năm 1952, Rosemary Biggs phát bệnh hemophilia B Năm 1982-1983, gen F9 tách dịng Năm 1985, trình tự gen F9 cơng bố Từ đây, phân tích di truyền chẩn đốn tình trạng mang gen hemophilia B thực 1.1.2 Khái quát bệnh hemophilia B 1.1.2.1 Đặc điểm bệnh Người khỏe mạnh bình thường có nồng độ FIX hoạt tính dao động từ 50150% Người bệnh hemophilia B người bị khả kiểm sốt q trình đơng máu nồng độ yếu tố IX hoạt tính giảm 40%, 1.1.2.2 Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia B di truyền gen lặn liên kết với NST X Khoảng 70% bệnh nhiễm sắc thể X đột biến di truyền qua nhiều hệ gia đình, 30% đột biến xuất đời sống cá thể mang bệnh 1.1.2.3 Phương pháp chẩn đoán điều trị bệnh a) Chẩn đoán xác định bệnh Dựa xét nghiệm định lượng yếu tố IX kết hợp xem xét đặc điểm lâm sàng khai thác tiền sử gia đình b) Chẩn đoán mức độ bệnh Bệnh mức độ nặng (FIX < 1%), mức độ trung bình (FIX từ 1-5%), mức độ nhẹ (FIX từ - 40%) c) Điều trị bệnh Chủ yếu truyền bổ sung yếu tố IX ngoại sinh Phương pháp điều trị liệu pháp gen thử nghiệm lâm sàng 1.2 Cấu trúc chức FIX q trình đơng máu 1.2.1 Các yếu tố đông máu Các chất tham gia vào q trình đơng máu bao gồm protein huyết thanh, yếu tố mô (TF), ion Ca2+, phospholipid màng tế bào tiểu cầu Các chất thúc đẩy trình đơng máu yếu tố đơng máu, có yếu tố IX 1.2.2 Vai trị yếu tố IX q trình đơng máu Yếu tố IX có vai trị chủ đạo việc hoạt hóa yếu tố X để trở thành yếu tố Xa - mục tiêu cuối đường đông máu 1.2.3 Cấu trúc yếu tố IX q trình hoạt hóa yếu tố IX Gen F9 có xấp xỉ 34 kb, bao gồm exon intron Phân tử yếu tố IX tổng hợp gan, có trọng lượng phân tử 57.000 Da, gồm domain: GLA, EGF1, EGF2, peptid hoạt hóa domain xúc tác 1.2.4 Mối tương tác FIX với nhân tố hoạt hóa Domain SP vị trí liên kết yếu tố IXa với yếu tố VIIIa Domain EGF (EGF1, EGF2) có vai trị định mối tương tác yếu tố IXa VIIIa Domain GLA có vai trị hỗ trợ phân tử liên kết với bề mặt phospholipid tiểu cầu hoạt hóa 1.3 Phân tích di truyền bệnh hemophilia B 1.3.1 Vai trò phân tích di truyền bệnh hemophilia B Phân tích di truyền để chẩn đốn tình trạng mang gen bệnh chẩn đốn trước sinh, chẩn đốn trước chuyển phơi cho người phụ nữ gia đình hemophilia B phương pháp hữu hiệu để kiểm soát nguồn gen bệnh 1.3.2 Đặc điểm đột biến gen F9 1.3.2.1.Biến đổi đơn nucleotide Đột biến liên quan đến thay nucleotide loại phổ biến đột biến gây bệnh hemophilia B, chiếm 64%, bao gồm đột biến sai nghĩa, đột biến vơ nghĩa đột biến vị trí tái xếp exon tạo ARN thông tin 1.3.2.2 Đột biến theo hiệu ứng sáng lập (founder effect) Hiện tượng số đột biến xảy với tần suất cao quần thể định, mang tính đặc trưng quần thể Nguyên nhân hiệu ứng đảo CpG kết hôn cận huyết 1.3.2.3 Đột biến dẫn tới thể bệnh hemophilia B Leyden Đột biến xảy vùng điều hòa hoạt động gen Trước tuổi dậy bệnh nhân có tình trạng giảm nồng độ FIX Từ tuổi dậy thì, nồng độ yếu tố IX tăng dần đến mức gần bình thường 1.3.2.4 Các đoạn, chèn đoạn nhỏ Lỗi enzym ADN polymerase tạo đột biến điểm, đột biến thêm vài nucleotide Các đột biến thường xảy trình tự lặp nucleotide, đặc biệt nhũng vị trí có trình tự lặp liền kề 1.3.2.5 Các bất thường di truyền lớn Chiếm từ 3-5% số đột biến bệnh hemophilia B Đó xếp lại gen, đoạn gen lớn (mất exon nhiều exon, chí tồn gen F9 1.3.3 Đặc điểm đa hình nucleotide liên kết với gen F9 1.3.3.1 Khái quát đa hình nucleotide Là biến đổi nucleotide (SNP VNTR) làm thay đổi không làm thay đổi ba mã hóa khơng làm thay đổi cấu trúc, chức gen đột biến có giá trị chẩn đốn bệnh Đa hình có thơng tin đa hình khơng có thơng tin Đa hình có thơng tin đa hình có alen khác (dị hợp tử) locus đa hình Đa hình có alen giống hệt (đồng hợp tử) locus đa hình đa hình khơng có thơng tin, khơng có giá trị phân tích liên kết Chỉ thị nội gen ngoại gen Đa hình liên kết NST X nằm gen F9 gọi thị nội gen Đa hình nằm ngồi gen F9 gọi thị ngoại gen Các thị đa hình nội gen khuyến cáo sử dụng chẩn đoán người mang gen phương phân tích liên kết Đa hình cân liên kết (linkage equilibrium) đa hình cân liên kết (linkage disequilibrium) Hai đa hình ln di truyền gọi cân liên kết hoàn tồn Hai đa hình di truyền độc lập gọi cân liên kết Sử dụng đa hình cân liên kết tăng hiệu chẩn đốn 1.3.3.2 Đặc điểm đa hình gen F9 Gen F9 chứa chủ yếu đa hình đơn nucleotide, có hai đa hình lặp lại (RY)n intron exon phát Tần suất alen đa hình khác biệt theo quần thể người, khác biệt cần nghiên cứu chi tiết để áp dụng phân tích liên kết cách hiệu 1.3.3.3 Tần suất tỷ lệ dị hợp tử đa hình Tần suất xuất alen đa hình có cân mà thường có alen chiếm ưu alen lại Các liệu tần suất alen cho phép tính tốn số đa hình di truyền tỷ lệ dị hợp tử theo lý thuyết 1.4 Các kỹ thuật phân tích di truyền bệnh hemophilia B 1.4.1 Kỹ thuật phân tích đột biến 1.4.1.1 Kỹ thuật lai Southern blot Là kỹ thuật sử dụng phân tích đột biến gây bệnh hemophilia B Tuy nhiên, thao tác phức tạp, tốn nhiều thời gian, sử dụng hóa chất độc hại nên kỹ thuật không sử dụng nhiều 1.4.1.2 Kỹ thuật phân tích dị sợi kép (heteroduplex) Sàng lọc đột biến dựa phân tích dị sợi kép thực để khu trú vùng gen nghi ngờ xảy đột biến Sau vùng gen giải trình tự để xác định biến đổi di truyền 1.4.1.3 Kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger Tập trung giải trình tự exon, vùng nối intron-exon, vùng 5’UTR vùng 3’UTR gen F9 Quy trình chuẩn hóa áp dụng thường quy nhiều phòng xét nghiệm giới 1.4.1.4 Kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) Là chiến lược phân tích đột biến gen hemophilia B Kỹ thuật NGS giải trình tự toàn gen F9 bao gồm exon intron, vơ hữu ích cho mục tiêu phân tích đột biến gen tìm kiếm đa hình có giá trị thơng tin quần thể 1.4.1.5 Kỹ thuật phát đoạn lớn Kỹ thuật MLPA sử dụng để phát đột biến đoạn gen lớn, phần exon, vài exon toàn gen F9 1.4.2 Kỹ thuật phân tích liên kết Dựa vào đa hình nucleotide nằm gen F9 để lần theo dấu vết alen đột biến gia đình người bệnh Phương pháp không xác định cụ thể đột biến gây bệnh gián tiếp chẩn đốn tình trạng mang gen bệnh 1.5 Tình hình nghiên cứu biến đổi di truyền gen F9 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới Hai cách tiếp cận chủ yếu để phân tích di truyền bệnh hemopilia B phân tích trực tiếp đột biến gen phân tích gián tiếp thơng qua đa hình liên kết với gen F9 Các nghiên cứu đột biến gây bệnh hemophilia B đặc điểm đa hình liên kết với gen F9 triển khai mạnh mẽ Nhiều quốc gia công bố đặc điểm đột biến đa hình nucleotide quần thể nước 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước Thống kê Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW cho thấy năm có hàng trăm ca bệnh mới, số lượng người mang gen chưa thể kiểm sốt Cơng tác chẩn đốn, quản lý điều trị cho bệnh nhân gặp nhiều khó khăn, thiếu thốn chế phẩm điều trị, chất lượng sống bệnh nhân giảm, tỷ lệ tàn tật cao cơng tác phịng bệnh trở nên vô quan trọng Tuy nhiên, nước ta chưa có nghiên cứu đa hình nucleotide gen F9, phân tích đột biến gen thực vài nghiên cứu nhỏ, chưa có đầy đủ sở liệu biến đổi di truyền người bệnh để phục vụ cho công tác tư vấn, chẩn đốn trước sinh, chẩn đốn trước chuyển phơi cho thành viên gia đình để thực mục tiêu phòng bệnh CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Mẫu bệnh nhân: 100 bệnh nhân hemophilia B chẩn đoán điều trị Viện Huyết học –Truyền máu TW (ký hiệu mẫu: HB01-HB100) (phục vụ mục tiêu 1: Lập đồ đột biến gen F9) 2.1.2 Mẫu người khỏe mạnh: 100 phụ nữ khỏe mạnh tham gia hiến máu Viện Huyết học - Truyền máu TW (ký hiệu mẫu: NK01-NK100) (phục vụ mục tiêu 2: Khảo sát đa hình nucleotide F9) 2.1.3 Mẫu người mang gen bệnh: 23 phụ nữ mang gen bệnh (MG1-MG23) (phục vụ đánh giá hiệu đa hình - kết thu từ mục tiêu 2) - Mỗi đối tượng nghiên cứu lấy ml máu ngoại vi (chống đông EDTA) 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1.Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mơ tả cắt ngang có phân tích 2.2.2 Cơng thức tính cỡ mẫu nghiên cứu đa hình nucleotide Được tính tốn theo cơng thức Leslie Kish: n = (Z1-α)2 [p (1-p)/D2]) 2.2.3 Sơ đồ nghiên cứu 2.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 2.4 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 2.4.1 Thu thập mẫu nghiên cứu Mỗi mẫu nghiên cứu lấy 2ml máu cho vào ống chống đơng EDTA Quy trình lấy máu đảm bảo vô trùng tuyệt đối 2.4.2 Tách chiết ADN mẫu nghiên cứu Sử dụng kit tách ADN hãng Qiagen 2.4.3 Thiết kế trình tự mồi để khuếch đại gen F9 Sử dụng phần mềm Primer3 thiết kế cặp mồi Kiểm tra độ bao phủ gen F9 trình tự mồi phần mềm CLC Genomic Workbench 2.4.4 Khuếch đại gen F9 kỹ thuật Longrange PCR (LR-PCR) Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại vùng gen F9 sử dụng sinh phẩm Q5 High-Fidelity 2x Mastermix 2.4.5 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 2.4.6 Tinh sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen F9 Sử dụng kit Agencourt Ampure XP 2.4.7 Giải trình tự gen F9 kỹ thuật NGS 2.4.7.1 Chuẩn bị thư viện ADN: Sử dụng kit Nextera XT Library Prep 2.4.7.2 Tinh thư viện sản phẩm PCR: Sử dụng kit Agencourt Ampure XP, thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.4.7.3 Chuẩn hóa mẫu: Đo nồng độ thư viện sử dụng sinh phẩm QuBit dsDNA HS Assay, quy đổi nồng độ mẫu từ đơn vị ng/µl sang đơn vị nM 2.4.7.4 Thực giải trình tự gen F9: Sử dụng sinh phẩm Miseq Reagent 2.4.8 Khẳng định kết giải trình tự gen F9 NGS phương pháp giải trình tự gen Sanger 2.4.8.1 Thực phản ứng PCR-Bigdye: Sử dụng sinh phẩm BigDye™ Terminator v3.1, theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.4.8.2 Tinh sản phẩm PCR-Bigdye: Sử dụng sinh phẩm Bigdye Xterminator thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.4.8.3 Thực phản ứng giải trình tự máy AB 3500 2.4.9 Khẳng định đoạn/lặp đoạn gen F9 Sử dụng kỹ thuật MLPA để khẳng định trường hợp nghi ngờ có đoạn lớn, sử dụng kit SALSA MLPA P207 F9, MRC Holland Quy trình thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.4.10 Phân tích đột biến gen từ liệu giải trình tự Sử dụng phần mềm Miseq Reporter CLC Genomics Workbench 9.5.2; gen tham chiếu NG_007994.1 NM_000133.3; sở liệu tham chiếu EAHAD (http://www.factorix.org), CDC (https://www.cdc.gov/ncbddd) sở liệu SNP quốc tế (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) - Sử dụng phần mềm PolyPhen-2 SIFT để dự đoán ảnh hưởng biến đổi tới cấu trúc chức gen F9 2.4.11 Phân tích đa hình nucleotide gen F9 Sử dụng phần mềm CLC Genomic Workbench; gen tham chiếu F9_NC000023.11; tham chiếu với sở liệu SNP quốc tế (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) Tính tốn số đa hình: Gồm tần số alen đa hình, tỷ lệ dị hợp tử đa hình, mối liên kết SNP (trên phàn mềm Haploview 4.2) Khẳng định hiệu đa hình: cách áp dụng phân tích 23 phụ nữ mang gen sau tính số trường hợp mẫu dị hợp tử phối hợp đa hình CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 3.1.1 Thu thập mẫu nghiên cứu Thu thập mẫu từ 100 người khỏe mạnh, có độ tuổi trung bình 24 ± 14, khơng có quan hệ huyết thống, khơng có tiền sử chảy máu lâu cầm; 100 mẫu bệnh nhân hemopphilia B với đặc điểm Bảng 3.1 Bảng 3.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu Bệnh nhân hemophilia B (n=100) Đặc điểm N Nam 99 Giới tính Nữ Nặng 79 Mức độ bệnh Trung bình 17 Nhẹ Có Tình trạng xuất ức chế Khơng 100 Độ tuổi trung bình (x ± SD) 22 ±16 Tỷ lệ (%) 99 79 17 100 Bệnh nhân nghiên cứu chủ yếu nam giới (99%) Có 79% bệnh nhân mức độ nặng (nồng độ FIX 100 ng/µl), băng ADN ngun vẹn (Hình 3.1 Bảng 3.2) Hình 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số HB1-HB6: mẫu bệnh nhân (từ đến 6) NK1-NK6:6 phụ nữ khỏe mạnh (từ đến 6)M: thang ADN 1kb (Thermo Fisher) Bảng 3.2 Kết nồng độ độ tinh số mẫu ADN STT Tên mẫu Nồng độ (ng/µl) A260 /A280 STT Tên mẫu Nồng độ (ng/µl) A260 /A280 HB1 108.8 1.9 NK1 90 1.95 HB2 94 1.91 NK2 93.6 1.94 HB3 150.1 1.91 NK3 111.7 1.9 HB4 108.1 1.9 10 NK4 119 1.88 HB5 93 1.91 11 NK5 207.5 1.9 HB6 225.6 1.88 12 NK6 207.5 1.91 11 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng LR-PCR Thành phần Q5 High-Fidelity 2x Primer F Primer R ADN khn H20 Tổng thể tích Nồng độ 1X 10 pM 10 pM 100 ng Thể tích (µl) 12,5 1 9,5 25 Bảng 3.6 Chu trình nhiệt đoạn a3 a4 Nhiệt độ 970C 97 C Thời gian p hút 30 45 giây 720C p hút 720C 10 p hút 15 C ∞ Nhiệt độ Thời gian 97 C phút 97 C 30 giây 66 C 45 giây 720C phút 720C 10 phút 35 1 Bảng 3.7 Chu trình nhiệt độ cho đoạn a8 Nhiệt độ 97 C phút 30 giây 69 C 45 giây 72 C phút 720C 10 phút 97 C 35 S ố chu kỳ ∞ 150C S ố chu kỳ giây 68 C Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho đoạn a1, a2, a5, a6, a7 15 C Thời gian S ố chu kỳ ∞ 35 1 Thành phần phản ứng chu trình nhiệt tối ưu khẳng định độ ổn định lặp lại phản ứng 10 bệnh nhân Như vậy, phản ứng LR-PCR chu trình nhiệt trên, chúng tơi khuếch đại toàn gen F9 dài 35kb (Hình 3.9) Hình 3.9 Hình ảnh khuếch đại phân đoạn a1-a8 điều kiện Tm tối ưu M: Thang ADN chuẩn kb (Thermo Fisher) a1- a8: phân đoạn a1 -a8 gen F9 Quy trình LR-PCR với thành phần điều kiện tối ưu sử dụng để khuếch đại đoạn a1-a8 cho tất mẫu nghiên cứu đề tài Sản phẩm phản ứng LR-PCR sau tinh chuẩn bị thư viện ADN phục vụ bước giải trình tự gen F9 kỹ thuật NGS 3.2.3 Kết chuẩn bị thư viện ADN Sử dụng kit Nextera XT DNA Library preparation, thu thư viện gồm đoạn ADN có kích thước chủ yếu khoảng 462 bp, nằm vùng tiêu chuẩn cho thư viện ADN từ 300 bp đến 500 bp (Hình 3.10) Hình 3.10 Kết kiểm tra thư viện ADN hệ thống điện di mao quản BiOptic 12 3.2.4 Kết giải trình tự với quy trình NGS tối ưu Thư viện ADN tinh Agencourt Ampure XP, sau thực giải trình tự sử dụng kit Miseq Reagent Kết cho thấy số chất lượng mẻ chạy đáp ứng tiêu chí kỹ thuật với Q30 = 90,5%; density = 1153 K/mm2; Cluster passing filter = 88,2% (Hình 3.11a) Dữ liệu giải trình tự thu bao phủ hồn tồn gen F9 (35kb) (Hình 3.11 b) Coverage tối thiểu cho base 100X Hình 3.11a: Chất lượng giải trình tự NGS Q30 = 93,8%; density = 896 K/mm2; Cluster passing filter = 91,7% Hình 3.11b: Một số hình ảnh kết giải trình tự NGS Hình 3.11b: Một số hình ảnh kết giải trình tự NGS 3.2.5 Khẳng định kết giải trình tự NGS Độ tin cậy quy trình giải trình tự gen NGS khẳng định kết giải trình tự song song 10 mẫu bệnh nhân với quy trình NGS quy trình Sanger cho kết phân tích đột biến tương đồng 100% (Hình 3.12) Kết giải trình tự NGS Kết giải trình tự Sanger (1) Mẫu HB04 Bất thường c.128G>A Bất thường c.128G>A (2) Mẫu HB05 Bất thường c.382T>C Bất thường c.382T>C 13 (3) Mẫu HB06 Bất thường c.676C>T Bất thường c.676C>T (4) Mẫu HB08 Bất thường c.689G>T Bất thường c.689G>T (5) Mẫu HB12 Bất thường c.127C>T Bất thường c.127C>T (6) Mẫu HB15 Bất thường c.677G>A Bất thường c.677G>A (7) Mẫu HB18 Bất thường c.470G>T Bất thường c.470G>T (8) Mẫu HB19 Bất thường c.1135C>T Bất thường c.1135C>T (9) Mẫu HB22 14 Bất thường c.874C>T c.933G>C Bất thường c.874C>T c.933G>C (10) Mẫu HB25 Đột biến c.956T>C Đột biến c.956T>C Hình 3.12 Kết phân tích đột biến với quy trình NGS Sanger 3.3 Kết giải trình tự gen F9 mẫu nghiên cứu Áp dụng quy trình giải trình tự NGS xây dựng trên, chúng tơi giải trình gen F9 thành công cho 200 mẫu nghiên cứu (100 bệnh nhân 100 phụ nữ khỏe mạnh) Ngoại trừ liệu bệnh nhân có mã số H14, H94, H97 liệu giải trình tự thu 197 mẫu lại (97 bệnh nhân 100 người khỏe mạnh) bao phủ hoàn toàn gen F9 (35 kb), đạt yêu cầu để phân tích biến đổi di truyền (bao gồm đột biến đa hình nucleotide) gen F9 Mẫu H14, H94, H97 mẫu bị khuyết sản phẩm Longrange PCR phân đoạn a5 (H14), a2-a8 (H94), a4-a6 (H97) có đoạn gen (Hình 3.13), nên thu liệu giải trình tự vùng gen cịn lại (Hình 3.14) Cả mẫu khẳng định có đoạn gen kỹ thuật MLPA (Hình.3.15) Mẫu H14: khơng khuếch đại đoạn a5 Mẫu H94: không khuếch đại đoạn a2-a8 Mẫu H97: không khuếch đại đoạn a4-a6 Hình 3.13 Kết Longrange PCR mẫu H14, H94, H97 Mẫu H14: Thiếu exon Mẫu H94:Thiếu exon - Mẫu H97: Thiếu exon -6 Hình 3.14 Kết giải trình tự gen NGS mẫu H14, H94, H97 Mẫu H14: Đột biến exon Mẫu H94: Đột biến exon - Mẫu H97: Đột biến exon -6 Hình 3.15 Kết phân tích MLPA mẫu H14, H94, H97 15 3.4 Kết phân tích đột biến gen 100 bệnh nhân nghiên cứu Kết phân tích liệu NGS, cho thấy 100 % bệnh nhân mang đột biến gây bệnh (Phụ lục 01) Nghiên cứu phát 58 đột biến gen khác nhau, có 16 đột biến (Bảng 3.8) Tỷ lệ đột biến 27,59% Danh sách 58 đột biến trình bày Bảng 3.9 Bảng 3.8 Danh sách 16 đột biến phát nghiên cứu 3.5 Đặc điểm đột biến gen gặp nghiên cứu 3.5.1 Kiểu đột biến gen Nghiên cứu gặp kiểu đột biến gen (đột biến điểm, đột biến chèn đoạn đột biến đoạn nhỏ, đoạn lớn) Nhiều đột biến điểm (91,38%) Bảng 3.10 Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp nghiên cứu Kiểu đột biến Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Đột biến điểm 53 91,38 Chèn đoạn 1,72 Mất đoạn nhỏ (50 bp) 5,17 Tổng số 58 100 16 Bảng 3.9 Danh sách 58 đột biến phát nghiên cứu *: đột biến khẳng định kỹ thuật MLPA 17 3.5.2 Tác động đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen Đột biến gặp nghiên cứu đa dạng, tác động đến từ 01 đến nhiều nucleotide, có đột biến dẫn tới exon, exon, chí toàn exon gen F9 Đột biến điểm dẫn tới tạo axit amin chiếm tỷ lệ cao với tỷ lệ 75,47% Một số đột biến dẫn đến dịch khung đọc, tạo mã ba vô nghĩa hay làm vị trí cắt nối (Bảng 3.11) Bảng 3.11 Tác động đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen Kiểu đột biến Đột biến điểm (n = 53) Chèn đoạn (n = 1) Mất đoạn lớn (n=3) Mất đoạn nhỏ (n = 1) Tác động Sai nghĩa Số lượng (n) 40 Tỷ lệ (%) 75,47 Vơ nghĩa 9,43 Vị trí cắt nối 9,43 Dịch khung đọc 3,77 Vùng promoter Dịch khung đọc 1,89 - Mất exon - Mất exon - Mất exon Mất codon - - 3.5.3 Đánh giá mức độ lặp lại đột biến ở bệnh nhân nghiên cứu Nghiên cứu phát 16/58 đột biến lặp lại từ bệnh nhân trở lên Nhiều đột biến c.881G>A, lặp lại 12 lần (Bảng 3.12) Bảng 3.12 Mức độ lặp lại đột biến bệnh nhân nghiên cứu STT Biến đổi nucleotide (HGVS cDNA) Biến đổi axit amin (HGVS protein) Loại đột biến Vị trí Exon intron Domain 10 11 12 13 14 15 16 c.881G>A c.1213G>A c.1135C>T c.127C>T c.128G>A c.1369A>T c.206G>A c.149G>A c.676C>T c.470G>T c.1243C>A c.956T>C c.952delC c.223C>T c.278-3A>G c.349T>A p.Arg294Gln p.Asp405Asn p.Arg379* p.Arg43Trp p.Arg43Gln p.Lys457* p.Cys69Tyr p.Gly50Asp p.Arg226Trp p.Cys157Phe p.His415Asn p.Leu319Pro p.Leu318Phefs*8 p.Arg75* Splice site p.Cys117Ser missense missense nonsense missense missense nonsense missense missense missense missense missense missense frameshift nonsense Splice site missense CpG CpG CpG CpG CpG CpG - exon exon exon exon exon exon exon exon exon exon exon exon exon exon intron exon protease protease protease PRO PRO protease GLA GLA Activation EGF2 Protease protease protease GLA EGF1 Số trường hợp 12 5 3 3 2 2 2 2 3.6 Đánh giá mối tương quan kiểu đột biến gen mức độ bệnh Trong nghiên cứu này, tổn thương di truyền lớn đoạn gen, đột biến vô nghĩa, đột biến dịch khung đọc gặp nhóm bệnh nhân mức độ nặng Đột biến sai nghĩa gặp nhóm mức độ bệnh bảng 3.13 18 Bảng 3.13 Tương quan kiểu đột biến gen mức độ bệnh Đột biến Sai nghĩa Dịch khung đọc Vô nghĩa Mất đoạn nhỏ Mất đoạn lớn Vị trí cắt nối Vùng promoter Tổng số (n = 100) BN mức độ nặng (FIX 5 – 40%) N % 100 0 0 0 0 0 0 3.7 Lập đồ đột biến gen F9 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 3.7.1 Phân bố đột biến gen F9 Đột biến gen gặp nghiên cứu trải dài từ đầu đến cuối gen F9, nhiểu exon (46,55%), tiếp đến exon (12,07%); exon khơng có đột biến exon Có đột biến phát thấy vùng intron 2, 3,5,7 Tỷ lệ đột biến xảy exon 89,66% (52/58 đột biến); intron vùng 5’UTR 10,34% (6/58 đột biến) (Hình 3.16) Hình 3.16 Phân bố đột biến gen F9 Hình 3.17 Phân bố đột biến domain FIX 3.7.2 Phân bố đột biến domain FIX Đột biến phân bố chủ yếu domain SP (51,72%), tỷ lệ đột biến domain lại từ 3,45 % đến 8,62% Có trường hợp (1,72%) đột biến làm domain EGF1-EGF2-AP, trường hợp đột biến toàn domain phân tử FIX (Hình 3.17) 3.7.3 Bản đồ đột biến gen F9 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam Từ liệu đột biến gen thu được, lập đồ đột biến gen F9 bệnh nhân hemophilia B nghiên cứu (Hình 3.18) Bản đồ hiển thị tất 58 đột biến phát nghiên cứu Vị trí phát sinh đột biến, tần suất xảy đột biến exon, intron gen F9 hay vùng domain phân 19 tử FIX cách rõ ràng, khái quát đặc điểm tổn thương di truyền gen F9 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam Hình 3.18 Bản đồ đột biến gen F9 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 3.8 Phân tích đa hình nucleotide gen F9 3.8.1 Khảo sát đa hình nucleotide gen mã hố yếu tố IX Phân tích liệu giải trình tự gen NGS từ 100 phụ nữ khỏe mạnh, chúng tơi phát 12 đa hình SNP có tiềm với tỷ lệ dị hợp tử ≥ 29% (Bảng 3.14) Bảng 3.14 Danh sách 12 SNP phát từ liệu giải trình tự Tên SNP HGVS name (NM_000133) NC_000023.11:g.13952810A>C c.-822A>G c.-727T>C c.88+75A>G c.88+1660T>C c.88+251oC>T c.89-2527C>A c.89-2518T>C c.89-2368A>T c.89-1859C>G c.278-981T>C c.520+565G>A Vị trí gen tham chiếu NC_000023.11 GRCh38.p1 139528190 139529943 139530038 139530927 139532512 139533362 139534483 139534492 139534642 139535151 139540095 139549056 Vị trí gen F9 5’UTR 5’UTR 5’UTR intron intron intron intron intron intron intron intron intron allen tham chiếu allen biến đổi A A T A T C C T A C T G C G C G C T A C T G C A Mã SNP rs201679740 rs411017 rs378815 rs3817939 rs401597 rs371000 rs4149670 rs4149671 rs4149674 rs392959 rs374988 Tỷ lệ dị hợp tử (%) 41 41 41 43 41 29 29 29 29 48 47 30 Hàng màu xám: SNP phát Gen F9 nằm từ vị trí 139530720 đến139563459 nhiễm sắc thể X, NC_000023.11 Tất 12 đa hình là SNP; có SNP vùng intron, SNP vùng 5’UTR gen F9 Trong số 12 SNP phát hiện, có 11 SNP cơng bố, SNP tìm thấy nghiên cứu (c.89-1859C>G)- SNP có tỷ lệ dị hợp tử cao (48%) 20 3.8.2 Tần suất alen đa hình quần thể người bình thường Kết khảo sát cho thấy alen tham chiếu alen phổ biến tất 12 SNP Tần suất alen thứ yếu (minor alen) phân bố khoảng từ giá trị nhỏ 16 % (locus đa hình c.89-2527C>A, c.89-2518T>C, c.89-1859C>G) đến giá trị lớn 36% (locus đa hình c.278-981T>C, c.520+565G>A) (Bảng 3.15) Bảng 3.15 Tần suất alen đa hình gặp nghiên cứu STT Đa hình nucleotide NC_000023.11:g.139528190A>C c.-822A>G c.-727T>C c.88+75A>G c.88+1660T>C c.88+2510C>T c.89-2527C>A c.89-2518T>C c.89-2368A>T 10 c.89-1859C>G 11 c.278-981T>C 12 c.520+565G>A Alen A C A G T C A G T C C T C A T C A T C G T C G A Tần suất alen (n = 300) Số lượng Tỷ lệ (%) 222 74 78 26 202 67 98 33 202 67 98 33 230 77 70 23 199 66 101 34 253 84 47 16 253 84 47 16 253 84 47 16 253 84 47 16 252 84 48 16 192 64 108 36 193 64 107 36 3.8.3 Phân tích liên kết đa hình nucleotide Nghiên cứu phát nhóm SNP rs201679740, rs411017, rs378815, rs401597 rs371000, rs4149670, rs4149671, rs4149674 gần xuất tất mẫu nghiên cứu; 27/30 (90%) đa hình s374988 ln kèm đa hình rs392959 (Bảng 3.16) Kết phân tích mối liên kết SNP phần mềm Haploview cho thấy đa hình rs371000, rs4149670, rs4149671, rs4149674 liên kết hoàn toàn với giá trị D’ Đa hình rs374988 rs392959 liên kết mạnh với với D’ = 0,79 Các đa hình rs3817939 c.89-1859C>G liên kết với SNP khác mức độ từ thấp đến trung bình (D’ = 0,14 -0,54) (Hình 3.19) 21 Giá trị D’ (%) Hình 3.19 Kết phân tích phần mềm Haploview 4.2 3.8.4 Lựa chọn đa hình có giá trị thơng tin cao Dựa vào kết phân tích liên kết SNP, chúng tơi chia 12 SNP thành nhóm theo mức độ liên kết chúng (Bảng 3.16) Bảng 3.17 Phân nhóm SNP theo mức độ liên kết Đặc điểm Nhóm Tên SNP HGVS name (NM_000133) Vị trí gen tham chiếu NC_000023.11 GRCh38.p1 NC_000023.11:g.1 Các SNP liên kết với 39528190A>C mức độ mạnh đến hoàn c.-822A>G toàn c.-727T>C (D' = 0,84 - 1) c.88+1660T>C Vị trí gen F9 allen allen tham biến chiếu đổi Mã SNP Tỷ lệ dị hợp tử quần thể người bình thường 139528190 Ngồi gen A C rs201679740 41 139529943 Ngoài gen A G rs411017 41 139530038 Ngoài gen T C rs378815 41 139532512 intron T C rs401597 41 c.88+2510C>T 139533362 intron C T rs371000 29 c.89-2527C>A 139534483 intron C A rs4149670 29 c.89-2518T>C 139534492 intron T C rs4149671 29 c.89-2368A>T 139534642 intron A T rs4149674 29 c.278-981T>C 139540095 intron T C rs392959 47 c.520+565G>A 139549056 intron G A rs374988 30 Hai SNP liên kết với c.88+75A>G SNP khác mức độ thấp c.89-1859C>G đến trung bình 139530927 intron A G rs3817939 43 139535151 intron C G Các SNP liên kết hoàn toàn với (D' = 1) Các SNP liên kết mạnh có SNP chứa hồn tồn thơng tin SNP cịn lại (D' = 1) 48 Từ đó, thiết lập đa hình gồm SNP, SNP đại diện cho nhóm SNP liên kết từ mạnh đến hồn tồn (nhóm 1, 2, 3) SNP nhóm (Bảng 3.18) Bảng 3.18 Bộ SNP có giá trị thơng tin STT Tên SNP HGVS name (NM_000133) Vị trí gen tham chiếu NC_000023.11 GRCh38.p1 Vị trí gen F9 allen allen tham biến chiếu đổi Mã SNP Tỷ lệ dị hợp tử quần thể người bình thường c.-727T>C 139530038 Ngoài gen T C rs378815 41 c.88+75A>G 139530927 intron A G rs3817939 43 c.89-2527C>A 139534483 intron C A rs4149670 29 c.89-1859C>G 139535151 intron C G c.278-981T>C 139540095 intron T C 48 rs392959 47 22 Bảng 3.16 : Thống kê đồng biểu đa hình nucleotide 23 3.8.5 Xác nhận hiệu đa hình gia đình người bệnh Hiệu SNP khẳng định phân tích 23 mẫu người mang gen bệnh cho thấy 23/23 (100%) có SNP dị hợp tử Tỷ lệ chẩn đoán phối hợp 100% Có mẫu dị hợp tử với SNP (17,39%), mẫu dị hợp tử với SNP SNP (26,09%), mẫu dị hợp tử với SNP (21,74%), mẫu dị hợp tử với SNP Hiệu chẩn đoán riêng biệt với SNP rs378815, rs3817939, rs4149670, c.89-1859 C>G,rs392959 60,87% (14/23); 56,52% (13/23); 39,13% (9/23), 69,57% (16/23) 30,43% (7/23) (Hình 3.20) Hình 3.20 Kết khảo sát hiệu đa hình nucleotide 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã lập đồ đột biến gen 100 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam Bản đồ gồm 58 đột biến gen khác nhau, có 16 đột biến chưa công bố sở liệu quốc tế Bản đồ đột biến gen mô chi tiết tất đặc điểm vị trí xuất hiện, tỷ lệ đột biến xảy vùng exon, intron vùng chức gen F9 phân bố 58 đột biến domain phân tử FIX Đã khảo sát đa hình nucleotide gen toàn gen F9 200 mẫu nghiên cứu Thiết lập thị gồm đa hình c.89-1859 C>G, rs392959, rs3817939, rs378815, rs4149670 có tỷ lệ dị hợp tử cao, từ 29% đến 48% Khả ứng dụng chẩn đốn thị đa hình đạt 100% thực phân tích 23 người mang gen, tương ứng với 23 gia đình người bệnh hemophilia B KIẾN NGHỊ Sử dụng sở liệu đột biến gen thu nghiên cứu để chẩn đốn tình rạng mang gen bệnh phương pháp phân tích đột biến Ứng dụng đa hình c.89-1859C>G, rs392959, rs3817939, rs378815, rs4149670 số lượng người mang gen lớn để đưa khuyến cáo hợp lý thứ tự sử dụng SNP DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Khanh Q Bach, Chinh Q Duong, Huong B.T.Vu, Anh.T.Tran (2022) Mutation characteristics of hemophilia A and B patients in the National Institute of Hematology and Blood Transfusion, Ha Noi, Viet Nam World Federation of Hemophilia 2022 (WFH 2022, World Congress) Vũ Thị Bích Hường, Trần Tuấn Anh, Nguyễn Thanh Ngọc Bình, Nguyễn Thị Mai, Bạch Quốc Khánh, Dương Quốc Chính (2022) Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự NGS khảo sát đa hình nucleotide gen F9 Tạp chí Y học Việt Nam, tập 511, trang 242 – 247 Dương Quốc Chính, Vũ Thị Bích Hường, Trần Tuấn Anh, Nguyễn Lê Anh, Ngô Thu Hằng, Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Hà Thanh, Bạch Quốc Khánh (2020) Xây dựng quy trình kỹ thuật để hồn thiện phác đồ chẩn đốn phân tử bệnh Hemophilia Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương Tạp chí Y học Việt Nam, tập 496, trang 802-815 Vũ Thị Bích Hường, Nguyễn Lê Anh, Trần Tuấn Anh, Bùi Thúy Hường, Ninh Thị Thanh Thảo, Vũ Quang Lâm, Nguyễn Thị Mai, Bạch Quốc Khánh, Đồng Văn Quyền, Dương Quốc Chính (2018) Bước đầu nghiên cứu đặc điểm đa hình MseI, HhaI, Taq, XmnI, DdeI phục vụ chẩn đốn người mang gen hemophilia B Tạp chí Y học Việt Nam, tập 466, trang 591-600 Vũ Thị Bích Hường, Nguyễn Lê Anh, Trần Tuấn Anh, Bùi Thúy Hường, Ninh Thị Thanh Thảo, Vũ Quang Lâm, Nguyễn Thị Mai, Bạch Quốc Khánh, Đồng Văn Quyền, Dương Quốc Chính (2018) Phối hợp phân tích trực tiếp phân tích gián tiếp chẩn đoán người mang gen hemophilia Viện Huyết học – Truyền máu TW Tạp chí Y học Việt Nam, tập 466, trang 1085-1091 Dương Quốc Chính, Vũ Thị Bích Hường, Nguyễn Lê Anh, Trần Tuấn Anh & cs (2018) Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) phân tích đột biến gen F9 gây bệnh hemophilia B Tạp chí Y học Việt Nam, tập 466, trang 581-590 ... nguồn gen b? ??nh Với lý đó, nghiên cứu sinh thực đề tài ? ?Nghiên cứu đột biến đa hình di truyền gen mã hóa yếu tố IX ở b? ??nh nhân hemophilia B? ?? Mục tiêu nghiên cứu luận án: (1) Lập đồ đột biến gen mã. .. 3.8 Danh sách 16 đột biến phát nghiên cứu 3.5 Đặc điểm đột biến gen gặp nghiên cứu 3.5.1 Kiểu đột biến gen Nghiên cứu gặp kiểu đột biến gen (đột biến điểm, đột biến chèn đoạn đột biến đoạn nhỏ,... đột biến toàn domain phân tử FIX (Hình 3.17) 3.7.3 B? ??n đồ đột biến gen F9 b? ??nh nhân hemophilia B Việt Nam Từ liệu đột biến gen thu được, lập đồ đột biến gen F9 b? ??nh nhân hemophilia B nghiên cứu