Luận án nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây hồng quân (flacourtia rukam zoll et mor )

i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Chữ nguyên ADN ALT AST BHA CCl4 COSY d d DEPT DMEM DMF DMSO dNTP DPPH EAC ESI-MS Acid desoxynucleic Alanine Aminotransferase Aspartate aminotransferase Butylated hydroxylanisol Carbon tetraclorid Correlation Spectroscopy Doublet Chemical shift Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Dulbecco’s Modified Eagle Medium Dimethyl formamid Dimethyl sulfoxyd Deoxynucleotid triphosphat 2,2-Diphenyl Picryl Hydrazyl Ehrilch Ascites Carcinoma Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy HDL HMBC HR-MS HSQC IC J High Density Lipoprotein Heteronuclear Multiple Bond Correlation High Resolution mass Heteronuclear Single Quantum Correlation Inhibitory Concentration LDL LOD Low-density lipoproteins Limit of Detection LOQ m Limit of Quantification Multiplet MIC MS NCBI Minimal inhibitory concentration Mass Spectrometry National Center for Biotechnology Information NMR Nuclear Magnetic Resonance Ý nghĩa Đỉnh đôi Độ dời hóa học Lipoprotein tỷ trọng cao Nồng độ ức chế Hằng số ghép Lipoprotein tỷ trọng thấp Giới hạn phát Giới hạn định lượng Đỉnh đa Nồng độ ức chế tối thiểu Khối phổ Cộng hưởng từ hạt nhân ii PBS PCR PDA Phosphate Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Photodiode Array PIC ppm q s SDS Polymorphism Information Content Parts per million Quartet Singlet Sodium dodecyl sulfat SKLM t TLTK TT Triplet UPLC UV Ultra-Performance Liquid Chromatography Ultraviolet VLDL Very-low-density lipoprotein VS Vanilin sulfuric Dãy diode quang Chỉ số đa hình di truyền Phần triệu Đỉnh bốn Đỉnh đơn Sắc ký lớp mỏng Đỉnh ba Tài liệu tham khảo Thuốc thử Sắc ký lỏng siêu hiệu Tử ngoại Lipoprotein tỷ trọng thấp iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .x MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Flacourtia 1.2 Tổng quan Flacourtia rukam 26 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Đối tượng nghiên cứu .32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .57 3.1 Kết khảo sát dược liệu Flacourtia rukam 57 3.2 Kết định tính nguyên liệu 70 3.3 Kết sàng lọc tác dụng sinh học 72 3.4 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất 76 3.5 Xây dựng quy trình định lượng poliothrysosid thân Flacourtia rukam UPLC-PDA 112 CHƯƠNG BÀN LUẬN 127 4.1 Về mặt thực vật học 127 iv 4.2 Về định tính nguyên liệu 130 4.3 Sàng lọc tác dụng sinh học 131 4.4 Chiết xuất phân lập hợp chất F rukam 137 4.5 Về định lượng poliothrysosid mẫu dược liệu Hồng quân 142 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 145 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN 149 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Điểm khác biệt loài mang tên Hồng quân Việt Nam Bảng 1.2 Flavon phân lập từ loài thuộc chi Flacourtia Bảng 1.3 Flavonol phân lập từ loài thuộc chi Flacourtia Bảng 1.4 Các hợp chất phenolic glycosid 12 Bảng 1.5 Các dẫn chất acid quinic 14 Bảng 1.6 IC50 dịch chiết F indica thử nghiệm DPPH NO 18 Bảng 1.7 IC50 chất phân lập từ dịch F inermis thử nghiệm DPPH 19 Bảng 1.8 Hoạt tính chống oxy hóa chi Flacourtia 19 Bảng 1.9 MIC dịch chiết từ F indica số loài vi khuẩn 20 Bảng 1.10 MIC dịch chiết từ F indica số loài nấm 21 Bảng 1.11 MIC dịch chiết MeOH từ rễ F indica số vi khuẩn 21 Bảng 1.12 % ức chế gốc tự IC50 dịch chiết F indica 23 Bảng 1.13 Các chế phẩm có Flacourtia 25 Bảng 1.14 Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết hợp chất từ vỏ thân F rukam 29 Bảng 1.15 Hoạt tính hạ cholesterol cao chiết từ vỏ thân F rukam 30 Bảng 2.1 Ký hiệu mã hóa mẫu dùng nghiên cứu 32 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng thử nghiệm độc tính tế bào XO 36 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi RbcL sử dụng phản ứng PCR 38 Bảng 2.4 Thành phần thử tác dụng ức chế XO giếng đĩa 96 46 Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái F rukam F indica 59 Bảng 3.2 So sánh khác biệt trình tự gen mẫu HQ275 HQ2941 69 Bảng 3.3 Mức độ tương đồng 12 mẫu Hồng quân BLAST NCBI 69 Bảng 3.4 Xác định độ ẩm, độ tro hàm lượng chất chiết cao toàn phần 70 Bảng 3.5 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật F rukam 70 Bảng 3.6 Kết định lượng cao toàn phần thân cành F rukam 72 Bảng 3.7 Hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn thử nghiệm DPPH 73 Bảng 3.8 Hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn lực khử sắt 74 Bảng 3.9 % ức chế dòng tế bào MDA-MB-231 74 Bảng 3.10 % ức chế dòng tế bào HepG2 75 vi Bảng 3.11 % ức chế dòng tế bào RD 75 Bảng 3.12 Hoạt tính độc tế bào mẫu thử dòng tế bào ung thư 75 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ 1H -NMR 13C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) hợp chất (1) 83 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ 1H -NMR 13C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) hợp chất (2) với acid chaumoogric (CDCl3 399,65 MHz; CDCl3 100,4 MHz) 86 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ 1H -NMR 13C -NMR hợp chất (3) poliothrysosid (CDCl3 500 MHz,  CDCl3 125 MHz) 88 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ 1H -NMR 13C -NMR ( DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) hợp chất (4) với Koabursid ( DMSO-d6: 400 MHz, DMSO-d6: 100 MHz) 90 Bảng 3.17 Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C -NMR hợp chất (5) với daucosterol ( DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) 92 Bảng 3.18 Dữ liệu phổ 1H -NMR 13C -NMR hợp chất (6) (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) 95 Bảng 3.19 Dữ liệu phổ 1H- NMR 13C -NMR (DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) hợp chất (7) 98 Bảng 3.20 Dữ liệu phổ 1H- NMR 13C -NMR (DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) hợp chất (8) acid vanilic 100 Bảng 3.21 Dữ liệu phổ 1H- NMR 13C -NMR (DMSO-d6 500 MHz, DMSO-d6 125MHz) hợp chất (9) với stigmasterol (CDCl3 100 MHz) 102 Bảng 3.22 Dữ liệu phổ 1H- NMR 13C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) hợp chất (10) β-sitosterol (CDCl3 với giọt MeOH-d4 100,06 MHz) 104 Bảng 3.23 Dữ liệu phổ NMR hợp chất (11) 105 Bảng 3.24 Hoạt tính chống oxy hóa hợp chất thử nghiệm DPPH 106 Bảng 3.25 Năng lực khử sắt hoạt tính chống oxy hóa hợp chất 107 Bảng 3.26 Giá trị IC50 mẫu thử 108 Bảng 3.27 Kết tác dụng in vivo hạ acid uric máu mẫu thử 109 Bảng 3.28 % ức chế hoạt tính độc tế bào MDA-MB-231 cao phân đoạn 109 Bảng 3.29 Hoạt tính độc tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 chất phân lập 110 Bảng 3.30 % ức chế hoạt tính độc tế bào HepG2 110 Bảng 3.31 Hoạt tính độc tế bào ung thư gan người HepG2 mẫu thử 110 Bảng 3.32 % ức chế hoạt tính độc tế bào RD 111 Bảng 3.33 Hoạt tính độc tế bào ung thư vân người RD mẫu thử 111 Bảng 3.34 Kết đánh giá độ tinh khiết poliothrysosid UPLC 113 vii Bảng 3.35 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống 119 Bảng 3.36 Mối tương quan nồng độ diện tích pic poliothrysosid 120 Bảng 3.37 Kết khảo sát độ lăp lại poliothrysosid 122 Bảng 3.38 Kết khảo sát độ poliothrysosid 122 Bảng 3.39 Hàm lượng poliothrysosid theo địa điểm thu hái 124 Bảng 3.40 Kết định lượng poliothrysosid theo phận dùng 125 Bảng 3.41 Hàm lượng poliothrysosid theo thời điểm thu hái 126 Bảng 4.1 So sánh điểm khác biệt trình tự gen F rukam F indica 129 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Thân, lá, hoa, Flacourtia indica Hình 1.2 Lá, hoa, Flacourtia jangomas Hình 1.3 Thân, lá, hoa, Flacourtia rukam Hình 1.4 Thân, lá, hoa, Flacourtia montana Hình 1.5 Chế phẩm từ Hồng quân 26 Hình 1.6 Flacourtia rukam 27 Hình 2.1 Bố trí thí nghiệm thử tác dụng ức chế XO đĩa 96 giếng 46 Hình 3.1 Hình thái Flacourtia rukam 58 Hình 3.2 Hoa cắt dọc bầu noãn cắt ngang Flacourtia rukam 59 Hình 3.3 Vi phẫu rễ Flacourtia rukam 61 Hình 3.4 Vi phẫu thân Flacourtia rukam 62 Hình 3.5 Vi phẫu cuống F rukam 63 Hình 3.6 Vi phẫu phiến F rukam 63 Hình 3.7 Vi phẫu gân Flacourtia rukam 64 Hình 3.8 Các cấu tử bột rễ Flacourtia rukam 65 Hình 3.9 Các cấu tử bột thân Flacourtia rukam 66 Hình 3.10 Các cấu tử bột F rukam 67 Hình 3.11 Phổ điện di ADN 15 mẫu Hồng quân gel agarose 1% 67 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 15 mẫu Hồng quân với cặp mồi RbcL gel agarose 1% 67 Hình 3.13 Vị trí đột biến điểm mẫu HQ2941 so với mẫu HQ2975 69 Hình 3.14 Sắc ký đồ phân tích phận dùng F rukam 71 Hình 3.15 Cấu trúc hợp chất (1) 82 Hình 3.16 Cấu trúc hợp chất (1) - Rukamtenol 84 Hình 3.17 Cơng thức hợp chất (2) - Acid chaulmoogric 86 Hình 3.18 Cấu trúc hợp chất (3) – Poliothrysosid 89 Hình 3.19 Cấu trúc hợp chất (4) - Koabursid 91 Hình 3.20 Cơng thức hợp chất (5) - Daucosterol 93 Hình 3.21 Tương quan HMBC FRHC12 94 Hình 3.22 Tương quan NOESY hợp chất (6) 95 ix Hình 3.23 Cơng thức hợp chất (6) 96 Hình 3.24 Tương quan HMBC FRE11 98 Hình 3.25 Cấu trúc hợp chất (7) 99 Hình 3.26 Cấu trúc hợp chất (8) – Acid vanilic 101 Hình 3.27 Cấu trúc hợp chất (9) - Stigmasterol 103 Hình 3.28 Cơng thức hợp chất (10) - -sitosterol 105 Hình 3.29 Cấu trúc hợp chất Acid stearic 106 Hình 3.30 Năng lực khử sắt hợp chất tinh khiết 107 Hình 3.31 Phổ UV poliothrysosid 112 Hình 3.32 Sắc ký đồ chất đối chiếu poliothrysosid 113 Hình 3.33 Phổ 3D poliothrysosid độ tinh khiết poliothrysosid 113 Hình 3.34 Sắc ký đồ hợp chất (3) - poliothrysosid 114 Hình 3.35 Chương trình pha động sắc ký đồ khảo sát 114 Hình 3.36 Chương trình pha động sắc ký đồ khảo sát 114 Hình 3.37 Chương trình pha động sắc ký đồ khảo sát 115 Hình 3.38 Chương trình pha động sắc ký đồ khảo sát 115 Hình 3.39 Chương trình pha động sắc ký đồ khảo sát 116 Hình 3.40 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 116 Hình 3.41 Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ cột 116 Hình 3.42 Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết 117 Hình 3.43 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống 119 Hình 3.44 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu 120 Hình 3.45 Đường tuyến tính chuẩn poliothrysosid 121 Hình 3.46 Sắc ký đồ khảo sát tính tuyến tính 121 Hình 3.47 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại 122 Hình 3.48 Sắc ký đồ khảo sát LOD LOQ poliothrysosid 123 Hình 3.49 So sánh hàm lượng poliothrysosid thân rễ F rukam, F indica 125 Hình 4.1 Phân biệt khơ lồi F rukam F indica 128 Hình 4.2 So sánh trình tự gen mẫu hồng quân với mẫu đối chứng Flacourtia rukam (Mã KP094960.1) 129 x DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu tác dụng sinh học 42 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết phân bố lỏng – lỏng 76 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao cloroform (1-11) 77 Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất (3, 7) 80 45 Allopurinol Nonlinear RegressionSunday, March 21, 2021, 5:20:41 PM Data Source: Data in Notebook1 Equation: Sigmoidal; Sigmoid, Parameter f = a/(1+exp(-(x-x0)/b)) R Rsqr Adj Rsqr Standard Error of Estimate 0.99550.99090.98494.3412 Coefficient Std Error a b x0 92.4100 1.6262 3.2450 t 3.3587 0.2317 0.2763 27.5139 7.0171 11.7446 SS 23445.4995 56.5391 23502.0386 MS 7815.1665 18.8464 3917.0064 P 0.0001 0.0059 0.0013 Analysis of Variance: DF Regression Residual Total Corrected for the mean of the observations: DF SS MS Regression 6176.2599 3088.1300 Residual 56.5391 18.8464 Total 6232.7990 1246.5598 Statistical Tests: Normality Test (Shapiro-Wilk)Passed(P = 0.3297) W Statistic= 0.8922Significance Level = 0.0500 Constant Variance Test (Spearman Rank Correlation)Passed(P = 0.0600) Fit Equation Description: [Variables] x = col(1) y = col(2) reciprocal_y = 1/abs(y) reciprocal_ysquare = 1/y^2 reciprocal_x = 1/abs(x) reciprocal_xsquare = 1/x^2 reciprocal_pred = 1/abs(f) reciprocal_predsqr = 1/f^2 weight_Cauchy = 1/(1+4*(y-f)^2) 'Automatic Initial Parameter Estimate Functions sup(q) = if(mean(q)>=0; max(q); min(q)) b1(q;r) = if(sup(r)>0; xwtr(q;r;.5)/4; -xwtr(q;r;.5)/4) [Parameters] a = 104.102 ' {{previous: 92.41}} b = 16.0316 ' {{previous: 1.62616}} x0 = 10.9121 ' {{previous: 3.245}} 46 2D Graph f = a/(1+exp(-(x-x0)/b)) 120 100 80 Y Data [Equation] f = a/(1+exp(-(x-x0)/b)) fit f to y ''fit f to y with weight reciprocal_y ''fit f to y with weight reciprocal_ysquare ''fit f to y with weight reciprocal_x ''fit f to y with weight reciprocal_xsquare ''fit f to y with weight reciprocal_pred ''fit f to y with weight reciprocal_predsqr ''fit f to y with weight weight_Cauchy [Constraints] [Options] tolerance=1e-10 stepsize=1 iterations=200 60 40 20 0 Number of Iterations Performed = 13 IC50 = 3.51 µg/ml X Data Col vs Col x column vs y column 10 12 14 47 Phụ lục 70 Kết thử độc tính tế bào Bảng kết độc tính tế bào MDA-MB-231 MDA-MB-231 MT DMSO Cao TP Cao CHCl3 100 50 25 12.5 100 50 25 12.5 0.705 0.697 0.433 0.425 0.418 0.487 0.234 0.396 0.422 0.448 0.722 0.655 0.384 0.427 0.444 0.518 0.189 0.334 0.395 0.42 0.751 0.778 0.368 0.419 0.435 0.502 0.177 0.332 0.389 0.402 MEAN 0.726 0.71 0.395 0.423667 0.432333 0.502333 0.2 0.354 0.402 0.423333 SEM 0.023259 0.062522 0.033867 0.004163 0.013204 0.015503 0.03005 0.036387 0.017578 0.02318 %DMSO 55.6338 59.67136 60.89202 70.75117 28.16901 49.85915 56.61972 59.62441 % ỨC CHẾ 44.3662 40.32864 39.10798 29.24883 71.83099 50.14085 43.38028 40.37559 KQ TD yếu, IC50 > 100 ug/ml IC50 = 48.90 ug/ml Cao EtOAc Cao n-BuOH Cao nước 100 50 25 12.5 100 50 25 12.5 100 50 25 12.5 0.132 0.603 0.58 0.731 0.642 0.613 0.586 0.614 0.627 0.64 0.622 0.652 0.14 0.618 0.535 0.707 0.647 0.68 0.614 0.652 0.638 0.59 0.627 0.648 0.124 0.683 0.584 0.694 0.66 0.647 0.598 0.627 0.605 0.628 0.696 0.649 0.132 0.634667 0.566333 0.710667 0.649667 0.646667 0.599333 0.631 0.623333 0.619333 0.648333 0.649667 0.008 0.042525 0.027209 0.018771 0.009292 0.033501 0.014048 0.019313 0.016803 0.026102 0.041356 0.002082 18.59155 89.38967 79.76526 100.0939 91.50235 91.07981 84.41315 88.87324 87.79343 87.23005 91.31455 91.50235 81.40845 10.61033 20.23474 -0.0939 8.497653 8.920188 15.58685 11.12676 12.20657 12.76995 8.685446 8.497653 IC50 = 41.40 ug/ml TD yếu, IC50 > 100 ug/ml TD yếu, IC50 > 100 ug/ml MDA-MB-231 MT DMSO FRC11 FRE11 100 50 25 12.5 100 50 25 12.5 0.441798 0.447228 0.37063 0.405342 0.367505 0.404224 0.378997 0.398806 0.423138 0.429156 0.445948 0.437737 0.376233 0.366525 0.383784 0.367487 0.334076 0.409197 0.409388 0.481132 0.46686 0.455052 0.390958 0.357353 0.404129 0.372168 0.346309 0.414754 0.402859 0.424051 MEAN 0.451535 0.446672 0.379274 0.376407 0.385139 0.381293 0.353128 0.407586 0.411795 0.44478 SEM 0.013433 0.008671 0.0105 0.025475 0.018349 0.019996 0.023224 0.008095 0.010352 0.031586 %DMSO 84.91092 84.26915 86.22414 85.36297 79.05739 91.2494 92.19171 99.5763 % ỨC CHẾ 15.08908 15.73085 13.77586 14.63703 20.94261 8.750597 7.808289 0.423701 KQ TD yếu TD yếu MDA-MB-231 MT MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ 0.441798 0.445948 0.46686 0.451535 0.013433 DMSO 0.447228 0.437737 0.455052 0.446672 0.008671 100 0.379006 0.399268 0.404506 0.39426 0.013467 88.26601 11.73399 FRE12 50 25 0.389533 0.393669 0.399705 0.416605 0.409047 0.430448 0.399428 0.413574 0.00976 0.018576 89.42309 92.59002 10.57691 7.409982 TD yếu OD570 MDA-MB-231 MT DMSO 1% 100 µM 80 µM 60 µM 40 µM 20 µM 10 µM 0.461 0.469 0.370 0.422 0.435 0.422 0.504 0.488 FRE13 0.456 0.463 0.363 0.422 0.438 0.429 0.490 0.490 0.463 0.471 0.372 0.420 0.441 0.425 0.496 0.499 KQ 12.5 0.452233 0.455482 0.422243 0.443319 0.018325 99.24931 0.750692 % ức chế µM 2.5 µM 100 µM 80 µM 60 µM 40 µM 20 µM 10 µM 0.495 0.518 21.23 10.01 7.25 10.18 -7.46 -3.98 0.483 0.513 21.65 8.96 5.51 7.34 -5.71 -5.71 0.482 0.525 21.04 10.85 6.29 9.68 -5.38 -5.91 µM 2.5 µM IC50 -5.51 -10.32 -4.37 -10.70 -2.42 -11.45 TB > 100 µM 48 MDA-MB-231 MT DMSO 1% 100 µM 80 µM 0.432 0.446 0.379 0.447 0.437 0.451 0.388 0.441 0.436 0.452 0.407 0.452 FRHC12 KQ MDA-MB-231 MT 60 µM 0.494 0.509 0.501 DMSO 20 0.463 0.453 0.097 0.506 0.438 0.062 0.495 0.461 0.078 0.488 0.451 0.079 0.022 0.011 0.017 17.54 82.46 MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ OD570 40 µM 20 µM 0.483 0.487 0.479 0.489 0.501 0.474 10 µM 0.509 0.537 0.520 µM 2.5 µM 100 µM 80 µM 0.490 0.528 15.18 -0.17 0.517 0.515 13.86 2.10 0.508 0.525 10.02 0.03 PACLITAXEL 10 0.201 0.304 0.201 0.256 0.256 0.308 0.219 0.289 0.032 0.029 48.65 64.14 51.35 35.86 IC50 = 11.06 uM 60 µM -10.82 -12.95 -10.85 % ức chế 40 µM 20 µM -8.26 -9.10 -6.20 -8.58 -10.71 -4.72 10 µM -14.09 -19.04 -14.95 µM 2.5 µM IC50 -9.83 -18.32 -14.74 -14.17 -12.38 -16.18 TB > 100 µM 2.5 0.216 0.219 0.276 0.237 0.034 52.57 47.43 Bảng kết độc tính tế bào HepG2 HEPG2 MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ HEPG2 MT DMSO 0.623993 0.533073 0.560012 0.572359 0.046701 0.388473 0.350087 0.287828 0.342129 0.050792 MT 0.623993 0.533073 0.560012 0.572359 0.046701 MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ HEPG2 MT MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ FRC11 KQ 0.623993 0.533073 0.560012 0.572359 0.046701 100 0.138635 0.132144 0.155201 0.141993 0.01189 41.50282 58.49718 Cao TP 50 25 0.182433 0.239019 0.180528 0.215045 0.192102 0.181293 0.185021 0.211786 0.006206 0.029001 54.07927 61.90225 45.92073 38.09775 IC50 = 58.42 ug/ml DMSO 0.388473 0.350087 0.287828 0.342129 0.050792 100 0.131702 0.085247 0.09187 0.10294 0.025128 30.08794 69.91206 DMSO 0.388473 0.350087 0.287828 0.342129 0.050792 MT DMSO 1% 0.741 0.751 0.768 0.732 0.749 0.748 100 0.317742 0.323243 0.345653 0.328879 0.014784 96.12719 3.872805 12.5 0.256143 0.244253 0.24157 0.247322 0.007756 72.28899 27.71101 100 0.083654 0.09125 0.097352 0.090752 0.006863 26.52572 73.47428 Cao CHCl3 50 25 0.15646 0.168149 0.163527 0.209995 0.187818 0.209385 0.169269 0.195843 0.016449 0.023986 49.47502 57.24242 50.52498 42.75758 IC50 = 47.55 ug/ml Cao EtOAc 50 25 0.388185 0.376411 0.36885 0.336999 0.348605 0.335081 0.368546 0.349497 0.019792 0.023328 107.7214 102.1535 -7.72138 -2.15348 IC50 = 91.27 ug/ml Cao nước 50 25 0.369081 0.439707 0.429601 0.464241 0.449426 0.493631 0.416036 0.465859 0.041855 0.026998 121.6019 136.1647 -21.6019 -36.1647 TD yếu 12.5 0.200528 0.198392 0.244782 0.214567 0.026189 62.71526 37.28474 12.5 0.40631 0.366128 0.325413 0.365951 0.040449 106.9626 -6.96263 100 0.366117 0.331278 0.299835 0.33241 0.033156 97.15913 2.840866 12.5 0.341265 0.325506 0.376324 0.347698 0.026012 101.6277 -1.62773 50 0.056977 0.052288 0.056457 0.055241 0.00257 16.14623 83.85377 Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 0.563 0.619 0.636 0.660 0.566 0.625 0.647 0.647 0.572 0.616 0.643 0.644 Cao EtOAc 50 25 12.5 0.388185 0.376411 0.40631 0.36885 0.336999 0.366128 0.348605 0.335081 0.325413 0.368546 0.349497 0.365951 0.019792 0.023328 0.040449 107.7214 102.1535 106.9626 -7.72138 -2.15348 -6.96263 IC50 = 91.27 ug/ml Cao n-BuOH 50 25 12.5 0.481776 0.387649 0.369731 0.444003 0.395501 0.443568 0.456668 0.372746 0.41434 0.460816 0.385298 0.409213 0.019225 0.011558 0.037184 134.6905 112.6178 119.6077 -34.6905 -12.6178 -19.6077 TD yếu Paclitaxel 20 10 0.063957 0.207863 0.347491 0.062567 0.179021 0.353945 0.064865 0.14921 0.302519 0.063796 0.178698 0.334652 0.001157 0.029328 0.028014 18.64683 52.23114 97.81449 81.35317 47.76886 2.185511 IC50 = 11.96 uM 100 0.131702 0.085247 0.09187 0.10294 0.025128 30.08794 69.91206 Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 IC50 25.03 17.54 15.26 12.11 22.62 14.62 11.55 11.61 23.48 17.56 13.95 13.86 TB > 100 ug/ml 49 FRE11 MT DMSO 1% 0.565 0.559 0.570 0.554 0.559 0.543 OD570 Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 0.568 0.563 0.570 0.569 0.560 0.555 0.562 0.562 0.552 0.567 0.563 0.571 % ức chế Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 IC50 -1.63 -0.67 -2.03 -1.75 -1.19 -0.20 -1.45 -1.52 -1.59 -4.38 -3.56 -5.15 TB > 100 ug/ml KQ FRE12 KQ FRE13 OD570 % ức chế Nồng độ cao (µg/ml) Nồng độ cao (µg/ml) MT DMSO 1% 100 50 25 12.5 100 50 25 12.5 IC50 0.741 0.751 0.637 0.656 0.753 0.854 15.16 12.58 -0.32 -13.81 0.768 0.732 0.639 0.635 0.749 0.831 12.63 13.24 -2.38 -13.57 0.749 0.748 0.655 0.646 0.761 0.824 12.43 13.66 -1.80 -10.17 TB > 100 ug/ml MT DMSO 1% 0.585 0.548 0.572 0.563 0.563 0.542 OD570 Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 0.563 0.547 0.571 0.577 0.558 0.542 0.576 0.574 0.553 0.536 0.531 0.549 % ức chế Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 IC50 -2.67 0.17 -4.10 -5.27 0.90 3.65 -2.31 -2.03 -1.88 1.22 2.06 -1.22 TB > 100 ug/ml MT DMSO 1% 0.585 0.548 0.572 0.563 0.563 0.542 OD570 Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 0.454 0.483 0.509 0.511 0.475 0.469 0.513 0.504 0.452 0.481 0.498 0.509 % ức chế Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 IC50 17.10 11.82 7.15 6.84 15.66 16.67 8.90 10.49 16.75 11.34 8.22 6.23 TB > 100 ug/ml KQ FRHC12 KQ Bảng kết độc tính tế bào RD MT Nồng độ Lần Lần Lần MEAN SEM 1.039 1.069 1.027 1.045 0.021 %DMSO % ỨC CHẾ KQ MT Nồng độ Lần Lần Lần MEAN SEM 1.039 1.069 1.027 1.045 0.021 %DMSO % ỨC CHẾ KQ DMSO 0.631 0.676 0.693 0.667 0.032 DMSO 0.631 0.676 0.693 0.667 0.032 100 0.374 0.438 0.366 0.392 0.039 58.86 41.14 100 0.374 0.438 0.366 0.392 0.039 58.86 41.14 Cao TP 50 25 0.476 0.561 0.550 0.579 0.554 0.560 0.527 0.567 0.044 0.011 79.00 85.01 21.00 14.99 TD yếu 12.5 0.537 0.478 0.475 0.497 0.035 74.51 25.49 Cao TP (TTC1) 50 25 0.476 0.561 0.550 0.579 0.554 0.560 0.527 0.567 0.044 0.011 79.00 85.01 21.00 14.99 TD yếu 12.5 0.537 0.478 0.475 0.497 0.035 74.51 25.49 Cao EtOAc 100 50 25 12.5 0.070 0.376 0.539 0.593 0.065 0.455 0.610 0.555 0.066 0.394 0.586 0.507 0.067 0.408 0.578 0.552 0.002 0.042 0.036 0.043 10.05 61.22 86.75 82.74 89.95 38.78 13.25 17.26 IC50 = 65.89 ug/ml 50 MT DMSO% Nồng độ cao (µg/ml) 1.010 0.812 0.996 0.805 1.001 0.820 MEAN 1.002 0.812 SEM 0.0069 0.0079 %DMSO % ỨC CHẾ KQ MT DMSO 1.171 0.767 1.058 0.644 1.154 0.702 MEAN 1.128 0.704 SEM 0.061 0.061 %DMSO % ỨC CHẾ KQ RD4 MT DMSO Nồng độ Lần 0.937818 0.664169 Lần 1.04016 0.740623 Lần 1.047865 0.72857 MEAN 1.008614 0.71112 SEM 0.061432 0.041106 %DMSO % ỨC CHẾ KQ 100 0.23 0.246 0.237 0.238 0.0075 29.298 70.702 Cao CHCl3 50 25 0.361 0.475 0.362 0.462 0.351 0.475 0.358 0.471 0.0059 0.0078 42.841 57.946 57.159 42.054 IC50 = 38.35 ug/ml 100 0.432 0.563 0.528 0.508 0.067 72.08 27.92 Cao n-BuOH 50 25 0.553 0.530 0.602 0.629 0.642 0.577 0.599 0.579 0.044 0.049 85.01 82.18 14.99 17.82 TD yếu 100 0.497625 0.557431 0.557819 0.537625 0.034641 75.60253 24.39747 FRC11 50 25 0.453498 0.320784 0.48621 0.332579 0.528642 0.383864 0.48945 0.345742 0.037676 0.033537 68.82798 48.61938 31.17202 51.38062 TD yếu 12.5 0.598 0.617 0.641 0.619 0.022 87.82 12.18 12.5 0.288076 0.32661 0.393591 0.336092 0.053393 47.26235 52.73765 12.5 0.541 0.514 0.544 0.533 0.0165 65.591 34.409 100 0.457 0.513 0.549 0.507 0.046 71.93 28.07 Cao nước 50 25 0.757 0.675 0.774 0.796 0.752 0.765 0.761 0.745 0.012 0.063 108.05 105.82 -8.05 -5.82 TD yếu 100 0.264508 0.267826 0.277113 0.269816 0.006534 37.94231 62.05769 FRE11 50 25 0.421128 0.471111 0.441203 0.499779 0.50706 0.476036 0.456464 0.482308 0.044953 0.015329 64.18938 67.82374 35.81062 32.17626 IC50 = 77.80 uM 12.5 0.630 0.611 0.621 0.621 0.010 88.13 11.87 12.5 0.513543 0.65497 0.474942 0.547818 0.094782 77.03591 22.96409 20 0.132 0.085 0.113 0.110 0.024 15.59 84.41 PACLITAXEL 10 0.336 0.379 0.310 0.310 0.349 0.370 0.332 0.353 0.020 0.038 47.12 50.09 52.88 49.91 IC50 = 7.59 uM 2.5 0.500 0.415 0.415 0.444 0.049 62.99 37.01 100 0.571384 0.56029 0.565504 0.565726 0.00555 79.55415 20.44585 FRE12 50 25 0.585758 0.590046 0.627174 0.57642 0.628355 0.514144 0.613762 0.560203 0.02426 0.040466 86.30919 78.77755 13.69081 21.22245 TD yếu 12.5 0.537618 0.612859 0.591416 0.580631 0.038763 81.65016 18.34984 OD570 RD MT DMSO 1% 100 µM 80 µM 60 µM 40 µM 20 µM 10 µM 0.841 0.639 0.433 0.445 0.553 0.594 0.596 0.629 FRE13 0.846 0.654 0.430 0.446 0.540 0.578 0.591 0.637 0.859 0.641 0.418 0.451 0.538 0.581 0.586 0.617 KQ % ức chế µM 2.5 µM 100 µM 80 µM 60 µM 40 µM 20 µM 10 µM 0.666 0.660 32.16 30.29 13.39 7.08 6.64 1.58 0.660 0.653 34.22 31.76 17.49 11.71 9.67 2.65 0.654 0.673 34.72 29.63 15.99 9.35 8.58 3.61 OD570 RD MT DMSO 1% 100 µM 80 µM 60 µM 40 µM 20 µM 10 µM 0.841 0.639 0.600 0.624 0.633 0.673 0.679 0.610 FRHC12 0.846 0.654 0.594 0.620 0.659 0.674 0.686 0.603 0.859 0.641 0.592 0.617 0.628 0.683 0.691 0.630 KQ % ức chế µM 2.5 µM 100 µM 80 µM 60 µM 40 µM 20 µM 10 µM 0.618 0.612 6.03 2.28 0.96 -5.36 -6.32 4.47 0.648 0.621 9.13 5.15 -0.78 -3.06 -4.83 7.84 0.633 0.603 7.64 3.69 2.00 -6.62 -7.84 1.71 µM 2.5 µM IC50 -4.34 -3.30 -0.92 0.18 -2.07 -5.07 TB > 100 µM µM 2.5 µM IC50 3.32 4.18 0.92 5.05 1.20 5.91 TB > 100 µM 51 Phụ lục 71 Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết xuất Diện tích pic Dung môi MeOH (100%) MeOH (70%) MeOH (50%) 275106 231815 382923 Nước 100% 203955 Phụ lục 72 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp thời gian chiết xuất Thời gian (phút ) Diện tích pic Đun hồi Siêu âm lưu 95 50 oC o C 15 52099 318412 30 146412 383106 45 272130 330365 60 204593 306183 Siêu âm (50 oC) Đun hồi lưu (95 oC) Phụ lục 73 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống 52 Phụ lục 74 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu Phụ lục 75 Sắc ký đồ độ lặp lại 53 Phụ lục 76 Sắc ký đồ tính tuyến tính Poliothrysosid C (µg/ml) S (µV*S) 100 2298506 50 1159026 25 585238 10 264778 125266 25199 0.5 9834 Mối tương quan nồng độ diện tích pic poliothrysosid Đường tuyến tính chuẩn poliothrysosid 54 Phụ lục 77 Sắc ký đồ độ 80 Phụ lục 78 Sắc ký đồ độ 100 55 Phụ lục 79 Sắc ký đồ độ 120 56 Phụ lục 80 Sắc ký đồ mẫu theo dõi theo thời điểm - Mẫu Bến Tre Phụ lục 81 Sắc ký đồ mẫu thu hái theo phận dùng - Lá 57 Phụ lục 82 Sắc ký đồ mẫu thu hái theo phận dùng - Quả non Phụ lục 83 Sắc ký đồ mẫu thu hái theo phận dùng - Rễ 58 Phụ lục 84 Thông tin cấp số nhận diện ngân hàng gen (GenBank: MK088161.1) Flacourtia rukam ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast GenBank: MK088161.1 FASTA Graphics Go to: LOCUS MK088161 416 bp DNA linear PLN 03- JUN-2019 DEFINITION Flacourtia rukam ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast ACCESSION MK088161 VERSION MK088161.1 KEYWORDS SOURCE chloroplast Flacourtia rukam ORGANISM Flacourtia rukam Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; rosids; fabids; Malpighiales; Salicaceae; Flacourtieae; Flacourtia REFERENCE (bases to 416) AUTHORS Thai,C.T TITLE Identification of Flacourtia rukam in Ben Tre, Viet Nam using rbcL gene JOURNAL REFERENCE Unpublished (bases to 416) AUTHORS Thai,C.T TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (22-OCT-2018) Department of Genetics and Plant Breeding, Cantho University, 3/2, Can Tho, Cantho 084710, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES source Location/Qualifiers 416 /organism="Flacourtia rukam" 59 /organelle="plastid:chloroplast" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:1085434" gene 416 /gene="rbcL" CDS 416 /gene="rbcL" /codon_start=3 /transl_table=11 /product="ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit" /protein_id="QCV37245.1" /translation="AGVKDYKLTYYTPDYETKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVA AESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYDIEPVAGEENQFIAYVAYPLDLFEEGSVTNM FTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPPAYSKTFQGPP" ORIGIN aggctggtgt taaagattat aaattgactt attatactcc tgactatgaa accaaagata 61 ctgatatctt ggcagcattc cgagtaactc ctcaacctgg agttccgccc gaggaagcag 121 gggccgcggt agctgctgaa tcttctactg gtacatggac aactgtgtgg accgatgggc 181 ttaccagtct tgatcgttat aaaggacgat gctacgacat cgagcccgtt gctggagaag 241 aaaatcaatt tattgcttat gtagcttacc ccttagacct ttttgaagaa ggttctgtta 301 ctaacatgtt tacttccatt gtgggtaatg tatttgggtt caaagcctta cgcgctctac 361 gtctggagga tttgcgaatc ccccctgctt attctaaaac ttttcaaggc ccacct LInk: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MK088161 ... nhóm nghiên cứu đặt vấn đề ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa độc tính tế bào Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll Et Mor.)” với mục tiêu cụ thể sau: Xác định tên khoa học. .. nguyên liệu nghiên cứu qua khảo sát hình thái thực vật, vi phẫu định danh mẫu giải trình tự ADN Khảo sát hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa độc tính tế bào thân Hồng quân 4 CHƯƠNG... vanillin 1%/ EtOH 96% 34 dung dịch acid sulfuric 5% EtOH 96%, pha trước dùng [2] 2.1.2.3 Hóa chất, vật liệu, dung mơi dùng thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa độc tế bào Dịng tế bào: Dịng tế bào ung