1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁI THỊ CẨM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA CÂY HỒNG QUÂN (FLACOURTIA RUKAM ZO[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO 1TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - THÁI THỊ CẨM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG CHỐNG OXY HĨA VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA CÂY HỒNG QUÂN (FLACOURTIA RUKAM ZOLL ET MOR.) Ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 62.72.04.06 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2022 tại: Cơng trình hồn thành Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: - PGS TS Huỳnh Ngọc Thụy PGS TS Đỗ Thị Hồng Tươi Phản biện 1: ………………………………………… Phản biện ………………………………………… Phản biện 3: ………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP HCM GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Lý tính cấp thiết nghiên cứu Xã hội ngày phát triển, người có xu hướng quay sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên thay cho thuốc có nguồn gốc tổng hợp Điều dẫn đến tình trạng ngày có nhiều thuốc không rõ nguồn gốc, chưa chứng minh hiệu lan truyền nhanh cộng đồng khiến người dân đổ xơ tìm kiếm sử dụng bừa bãi, đẩy giá thành dược liệu lên cao, tạo sự khan nguồn nguyên liệu Cây Hồng quân – loài ăn quen thuộc vùng đồng Sông Cửu Long Nam Trung Bộ, thuộc chi Flacourtia họ Liễu (Salicaceae), thân gỗ, mọc hoang chủ yếu vùng nhiệt đới Tại Việt nam, Hồng quân loài F.rukam dân gian dùng chữa viêm mi mắt, viêm khớp dạng thấp, gút, rễ chữa tiểu buốt, tiểu dắt, đặc biệt việc sử dụng rễ Hồng quân điều trị phì đại tiền liệt tuyến hiệu quả, dẫn đến tình trạng lồi bị khai thác triệt phá ạt dân gian Trên giới, Hồng quân nghiên cứu khả chống oxy hóa, tác dụng bảo vệ gan, hạ đường huyết, chống sốt rét kháng khuẩn, chủ yếu nghiên cứu tập trung loài: Flacourtia indica, Flacourtia montana, Flacourtia sepiaria, Flacourtia jangomas Đặc biệt có lồi khảo sát tác dụng độc tính tế bào Flacourtia indica tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh gút ức chế xanthin oxidase Flacourtia sepiaria cho kết IC50 ấn tượng Gút bệnh phổ biến giới, nguyên nhân bệnh gút tăng acid uric máu, xảy rối lọan chuyển hóa acid uric Xanthin oxidase (XO) enzyme đóng vai trị quan trọng gút chuyển hóa tạo acid uric Trong giai đoạn cuối trình trao đổi chất purin, enzymenày xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthin xanthin để tạo thành acid uric Do việc tìm kiếm thuốc hay hợp chất từ thuốc có tác dụng ức chế enzyme XO có tiềm lớn góp phần hỗ trợ điều trị bệnh gút Các nghiên cứu in vitro tiến hành cho kết tốt thường xác nhận kết thử nghiệm in vivo nghiên cứu Một vấn đề cộm Việt nam tỷ lệ bệnh ung thư người dân tăng nhanh Theo số liệu đưa Hội nghị khoa học phòng chống ung thư thường niên lần thứ – Huế năm 2021, tỷ lệ mắc ung thư Việt Nam tăng lên bậc, xếp thứ 90/185 quốc gia Các loại ung thư thường gặp ung thư gan, đại trực tràng, ung thư vú, dày, phổi Với lý nhà khoa học cũng hướng đến nghiên cứu tác dụng độc tính dòng tế bào ung thư thuốc dân gian nhằm mục đích tìm kiếm tác dụng chúng, việc cấp bách khả thi Nhận thấy Hồng quân thuốc giàu tiềm năng, không dừng lại tác dụng mà cịn ẩn chứa nhiều hoạt tính tiềm số thuốc chi khác Đặc biệt Hồng quân loài Flacourtia rukam Việt Nam chưa thấy có nhiều báo cáo nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng dược lý loài qua tham khảo tài liệu tạp chí chun ngành có uy tín ngồi nước Nhằm chứng minh tác dụng dược lý theo y học cổ truyền Việt Nam tìm kiếm tác dụng Hồng quân, đặc biệt theo hướng chống oxy hóa dập tắt gốc tự (mơ hình DPPH) ức chế enzymexúc tác cho phản ứng oxy hóa (mơ hình ức chế enzymexanthin oxidase) tìm kiếm thuốc có tác dụng ức chế acid uric (phương pháp in vitro), làm hạ acid uric máu (phương pháp in vivo) phục vụ cho mục đích tìm kiếm thuốc hỗ trợ điều trị bệnh gút, với mục đích đánh giá tính độc tế bào Flacourtia rukam mọc Việt Nam, từ góp phần tạo sở cho việc bảo tồn, phát triển, nghiên cứu sản xuất sản phẩm từ thiên nhiên đạt chất lượng cao, có hiệu hỗ trợ điều trị làm tăng giá trị sử dụng thuốc dân gian, nhóm nghiên cứu đặt vấn đề: “Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa độc tính tế bào Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll Et Mor.)” Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tên khoa học nguyên liệu nghiên cứu qua khảo sát hình thái thực vật, vi phẫu - Khảo sát hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa độc tính tế bào Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Thân Hồng quân loài Flacourtia rukam Phương pháp nghiên cứu: - Khảo sát hình thái F.rukam, giải trình tự gen ADN - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro: phương pháp DPPH, đánh giá lực khử sắt, mơ hình ức chế XO - Tác dụng hạ acid uric máu in vivo - Khảo sát độc tính tế bào cao chiết chất phân lập dòng tế bào ung thư: MDA-MB-231, HepG2, RD - Xây dựng quy trình định lượng poliothrysosid Hồng quân UPLC-PDA Những đóng góp nghiên cứu mặt lý luận thực tiễn 4.1 Khảo sát hình thái Flacourtia rukam Phân tích hình thái có đặc điểm bật giúp nhận biết loài F rukam phân biệt với loài tương tự Nghiên cứu bổ sung đặc điểm phân biệt hai loài Flacourtica Bổ sung liệu gen rbcL loài Flacourtica rukam ngân hàng gen giới giúp cho việc định danh loài với mã nhận diện MK088161.1 4.2 Định lượng polyphenol toàn phần flavonoid toàn phần Hàm lượng polyphenol thân F rukam so với acid gallic 104,66 mg GAE/g cao hàm lượng flavonoid toàn phần 322,17 mg QE/g cao so với quercetin 4.3 Phân lập, sàng lọc hoạt tính sinh học cao chiết hợp chất Nghiên cứu phân lập 11 hợp chất chất rukamtenol chất 4-Formyl-2-hydroxyphenyl 6-O-benzoyl-βD-glucopyranosid hồn toàn tự nhiên Năm chất lần đầu phân lập từ lồi F rukam.Chúng thuộc nhóm phenolic glycoside, triterpenoid Kết đăng tạp chí quốc tế chuyên ngành hóa học, giúp cho nhà nghiên cứu có liệu phổ học cũng thành phần hóa học chi Flacourtia Luận án đánh giá hoạt tính chống oxy hóa mơ hình DPPH lực khử sắt, mơ hình ức chế xanthin oxidase in vitro, tác dụng hạ acid uric máu in vivo: hợp chất thể hoạt tính ức chế xanthin oxidase hạ acid uric huyết mạnh Hoạt tính độc tế bào ung thư dịng tế bào ung thư vú người (MDA-MB-231), tế bào ung thư gan người (HepG2) tế bào ung thư vân người (RD) cao cồn toàn phần, cao phân đoạn EtOAc, cao CHCl3, cao n-BuOH hoạt chất phân lập F rukam Trong đó, cao EtOAc, cao CHCl3 thể độc tính dịng tế bào ung thư thử nghiệm, hợp chất phân lập khơng thể độc tính dịng tế bào MDA-MB231, HepG2 RD, có chất 4-Formyl-2-hydroxyphenyl 6-Obenzoyl-β-D-glucopyranosid thể độc tính dịng tế bào RD 4.4 Xây dựng quy trình định lượng poliothrysosid Hồng quân UPLC-PDA Lần đầu tiên phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC-PDA) xây dựng ứng dụng để định lượng polithrysosid mẫu dược liệu Hồng quân Bố cục luận án Luận án gồm 148 trang: Mở đầu trang, tổng quan tài liệu 28 trang, nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 24 trang, kết nghiên cứu 71 trang, bàn luận 17 trang, kết luận kiến nghị trang Luận án có 62 bảng, 56 hình, sơ đồ, 145 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng Việt, 132 tài liệu tiếng Anh, tài liệu trang web, 83 phụ lục thể kết thực nghiệm CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN LOÀI FLACOURTIA RUKAM Tên khoa học: Flacourtia rukam Zollinger et Moritzi Tên Việt Nam: Hồng quân, Muồng quân, Bồ quân to Cây nhỡ hay gỗ to cao - 15 m có 20 m, có gai khỏe đơn hay phân nhánh, gai dài 10 cm biến già hoặc trồng Vỏ thân màu xám nâu, gỗ màu cam nhạt, dễ bong tróc Lá thường bóng láng mặt trên, nhẵn hay có lơng gân Cụm hoa nách Hoa màu vàng xanh lục nhạt, khơng mùi, khơng có cánh hoa Quả mọng, hình cầu đến bầu dục, màu đỏ tối đến đen chin, cạnh khô Phân bố: F rukam tìm thấy Madagascar Malaysia, trồng hoang dã Ở Việt Nam, F rukam có nhiều tỉnh miền núi Bắc, Quảng Trị, Đăk Lăk, Khánh Hịa, vùng đồng sơng Cửu Long 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC Năm 2016, Ragasa cộng sự phân lập hợp chất từ cao diclorometan F rukam: monogalactosyl diacylglycerol, ββ-sitosterol, sitosteryl-3β-glucopyranosid-6β-O-ester, triacylglycerol từ thịt quả, β-sitosterol clorophyll A từ vỏ triacylglycerol từ hạt Năm 2016, từ chiết xuất methanol F rukam nhóm nghiên cứu phân lập hợp chất (7S.8S)-4-O-methylsyringyl-glycerol-8-O-β-glucopyranosid, rhamnopyranosyl-|3-Z)-glucopyranosid, 6-O-a-Lacid 3-O-(E)- caffeoylquinic, acid 4-O-(E)-caffeoylquinic, acid 5-O-(E)caffeoylquinic Muharni cộng sự (2019) phân lập từ cao ethyl acetat vỏ thân F rukam hợp chất: friedelin, poliothrysosid βsitosteryl-3β- glucopyranosid Năm 2021 Afifi cộng sự báo cáo phân lập bốn hợp chất từ F rukam: 2-[(benzoyloxy)methyl]-phenyl-O-βxylosyl-(1→2)-β-glucopyranoside; 2-[(benzoyloxy)methyl]-4- hydroxyphenyl-O-β-xylosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside; 2- hydroxy-5-(2-hydroxyphenoxy)phenoxy-β-glucopyranoside biphenyl-1,1′,2,2′-tetraol 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA FLACOURTIA RUKAM Hoạt tính chống oxy hóa: Cao ethanol aceton từ F rukam thể hoạt tính chống oxy hóa mạnh Hoạt tính kháng khuẩn: F rukam có khả kháng E coli tỷ lệ thuận với nồng độ, cụ thể nồng độ 4, 6, 8, 10% có đường kính vịng kháng khuẩn lần lượt 7,02, 7,92, 9,36 11,58 mm 1.4 CÔNG DỤNG CỦA F RUKAM TRONG Y HỌC CỔ TRUYỀN Quả non dùng chữa đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn Quả chín tính ấm, vị có tác dụng tiêu thực, giáng khí, lợi đờm Vỏ thân, hạt có tác dụng trị phong thấp, gút Rễ dùng trị herpes, khan tiếng, nghiền đắp trị bỏng nhọt phát ban CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 12 CHƯƠNG 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ KHẢO SÁT DƯỢC LIỆU FLACOURTIA RUKAM 3.1.1 Đặc điểm hình thái sinh thái Cây gỗ nhỡ cao - 15 m, phân nhiều nhánh, gai đơn hoặc phân nhánh Thân non màu nâu nhạt, có lơng thưa Thân già màu trắng xám, có nhiều nốt sần, vỏ thân dễ bong tróc Lá đơn, mọc so le Phiến hình bầu dục, đầu có hẹp nhọn dài; mép có cưa cạn, lượn sóng; gân hình lơng chim Lá non màu nâu đỏ, mọc rũ xuống Hoa đơn tính gốc Hoa màu vàng lục, khơng mùi, đầu nhụy xòe, vòi nhụy xếp thành vòng đỉnh bầu Hoa khơng có cánh hoa Quả mọng, hình cầu, đỏ tới sẫm đen chín, vị chua chát, cịn sót vịi nhụy Mỗi có từ - 12 hạt dẹp nhỏ, hình thận, màu vàng, có vân mờ 4 10 11 12 13 14 15 Hình 3.1 Hình thái Flacourtia rukam 13 Hình 3.2 Hoa bầu noãn Flacourtia rukam Đặc điểm giải phẫu 3.1.2 3.1.2.1 Thân Mặt cắt ngang vi phẫu thân tròn Bần gồm 3-4 lớp tế bào đặn, hình chữ nhật, có lơng che chở đơn bào Mơ mềm vỏ mô mềm đạo, rải rác tinh thể calci oxalat hình khối hoặc hình cầu gai Trụ bì gồm cụm tế bào mơ cứng xếp thành vịng gần liên tục quanh vịng libe gỗ, 2-3 lớp tế bào Hình 3.3 Vi phẫu thân Flacourtia rukam 3.1.2.2 Bột thân Bột thân có màu vàng nhạt, tìm cấu tử sau: mảnh bần, mạch điểm, cụm mô cứng, mạch xoắn, mạch vịng tinh thể calci oxalat hình khối 14 Hạt tinh bột Khối nhựa màu vàng Mạch điểm Tinh thể calci oxalat hình khối Kết phân tích ADN F rukam phương pháp 3.1.3 điện di gel 3.1.3.1 Giải trình tự gen với cặp mồi Rbcl Trình tự gen Rbcl F rukam nhóm nghiên cứu đăng ký ngân hàng liệu gen giới (NCBI) cấp số nhận diện MK088161.1 3.2 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH NGUYÊN LIỆU 3.2.1 Độ tinh khiết Độ ẩm, độ tro, hàm lượng chất chiết dược liệu Hồng quân đạt theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam V Kết định lượng polyphenol tổng bằng phương pháp Folin-Ciocalteu: Hàm lượng polyphenol toàn phần cao xác định tương đương µg/ml acid gallic dựa theo phương trình đường chuẩn y = 0,0897x + 0,042 (R2 = 0,9993) với y giá trị OD x nồng độ acid gallic (µg/ml) Hàm lượng polyphenol tồn phần có 1g cao 104,66 mg GAE/g cao (Gallic acid equivalent/gam) 15 Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa 3.2.1.1 Thử nghiệm DPPH dựa lực khử sắt: Các cao thể hoạt tính chống oxy hóa theo thứ tự giảm dần: cao EtOAc > cao n-BuOH > cao TP > cao CHCl3 > cao nước Hoạt tính độc tế bào ung thư in vitro 3.2.1.2 Dòng tế bào MDA-MB-231: Kết cho thấy nồng độ thử nghiệm 12,5 – 100 µg/ml: Cao CHCl3 ức chế 71,83% cao EtOAc ức chế 81,41% tế bào thử nghiệm nồng độ 100 µg/ml Dòng tế bào HepG2: Kết thử nghiệm nồng độ 100 µg/ml cao TP, CHCl3, EtOAc ức chế từ 58,50% đến 73,47% tế bào thử nghiệm Dòng tế bào RD: Kết quả: nồng độ 50 µg/ml cao CHCl3 ức chế 57,159% nồng độ 100 µg/ml ức chế 70,70% Cao EtOAc nồng độ 100 µg/ml thể ức chế 89,95% tế bào ung thư vân Hoạt tính độc tế bào ung thư khảo sát dòng tế bào: ung thư vú người MDA-MB-231, ung thư gan HepG2 ung thư vân RD Kết cho thấy cao phân đoạn CHCl3 phân đoạn EtOAc thể hoạt tính độc tế bào 03 dịng tế bào thử nghiệm IC50 < 100 µg/ml Bảng 3.1 Hoạt tính độc tế bào mẫu thử dòng tế bào ung thư STT Mẫu thử IC50 IC50 IC50 16 MDA-MB-231 HepG2 RD Cao TP nd 58,42 nd Cao CHCl3 48,90 µg/ml 47,55 µg/ml 38,35 µg/ml Cao EtOAc Cao n-BuOH Cao nước Paclitaxel 41,40 µg/ml nd nd 9,44 µg/ml 91,27 µg/ml nd nd 9,44 µg/ml 65,89 µg/ml nd nd 6,48 µg/ml nd: khơng xác định được hoạt tính độc tế bào 3.3 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT 3.3.1 Chiết xuất 20,6 kg thân F rukam khô, độ ẩm dược liệu 10,48%, chiết ngấm kiệt với cồn 96% (tỉ lệ 1:20), cô thu hồi dung môi áp suất giảm thu 700 g cao cồn 96% 700 g cao tiến hành chiết phân bố với dung mơi có độ phân cự tang dần Các cao chiết thu được, tiến hành phân lập sắc ký cột cổ điển thu 11 hợp chất xác định phổ MS, NMR: rukamtenol 21 mg (1); chaulmoogric acid 251 mg (2); poliothrysosid 1782 mg (3); 3,4,5-trimethoxyphenyl β-D-Glucopyranosid 65 mg (4); daucosterol 120 mg (5); 3α-Acetoxy-D:A-friedo-oleanan27,16α-lacton 286 mg (6); 4-Formyl-2-hydroxyphenyl 6-Obenzoyl-β-D-glucopyranosid 134 mg (7); vanilic acid 14 mg (8); stigmasterol 34,3 mg (9); β-sitosterol 1399,1 mg (10); acid stearic 9,8 mg (11) 17 HC (1): rukamtenol HC (4): 3,4,5trimethoxyphenyl βD-glucopyranosid HC (7): 4-Formyl-2hydroxyphenyl 6-Obenzoyl-β-Dglucopyranosid HC (2): acid chaulmoogric HC (5): Daucosterol HC (3): Poliothrysosid HC (6): 3α-AcetoxyD:A-friedo-oleanan27,16α-lacton HC (8): Acid vanillic HC (9): Stigmasterol HC (11): Acid stearic HC (10): β-sitostetrol 18 Đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn hợp 3.3.2 chất tinh khiết 3.3.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH Kết quả: Các hợp chất hợp chất (3), (6) cho tác dụng yếu, hợp chất (1) (7) khơng thể hoạt tính chống oxy hóa thử nghiệm DPPH, IC50 > 100 µg/ml 3.3.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa dựa lực khử sắt Các hợp chất (3) IC50 18,61 µg/ml hợp chất (7) IC50 19,26 µg/ml thể hoạt tính chống oxy hóa mạnh 3.3.2.3 Hoạt tính chống oxy hóa mơ hình ức chế enzymexanthin oxidase (XO) in vitro Các hợp chất thể hoạt tính ức chế XO in vitro, mạnh hợp chất (3) poliothrysosid với IC50 = 5,6 μM so với IC50 = 25,8 μM allopurinol Bảng 3.2 Giá trị IC50 mẫu thử Tên mẫu IC50 (μg/ml) IC50 (μM) R2 Hợp chất (3) 2,26 ± 0,17 5,6 ± 0,4 0,9981 Hợp chất (6) 92,95 ± 2,77 191,3 ± 5,7 0,9675 Hợp chất (7) 8,4 ± 0,27 20,8 ± 0,6 0,9949 Allopurinol 3,51 ± 0,26 25,8 ± 1,9 0,9909 3.3.2.4 Tác động hạ acid uric máu in vivo ... nhóm nghiên cứu đặt vấn đề: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa độc tính tế bào Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll Et Mor. )? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tên khoa học. .. biphenyl-1,1′,2,2′-tetraol 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA FLACOURTIA RUKAM Hoạt tính chống oxy hóa: Cao ethanol aceton từ F rukam thể hoạt tính chống oxy hóa mạnh Hoạt tính kháng khuẩn: F rukam có khả kháng E... liệu nghiên cứu qua khảo sát hình thái thực vật, vi phẫu - Khảo sát hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa độc tính tế bào Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Thân Hồng quân