NGHIÊN CỨU SỰ TÁI SINH IN VITRO MỘT SỐ GIỐNG KHOAI LANG VIỆT NAM ppt

Nghiên cứu sự tái sinh in vitro một số giống khoai lang Việt nam Study on in vitro regeneration of some Vietnam sweetpotato varieties Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Quang Thạch Summary A in vitro regeneration of sweetpotato for gene transfering was studed. The experiments were carried out on some sweet potato varieties: Chiem dau (CD), Nong nghiep 31 (NN31) and Lim. Research results show that: + The stem internodes were effective explants for shoot formation + Culture mediums for shoot induction from stem internodes were: MS+1,2ppmkietin+0,5ppmIAA ( for CD variety), MS+2,0ppmkietin+0,1ppmIAA ( for NN31 variety) and MS+1,0ppmkietin+0,5ppmIAA ( for Lim variety) + There is no morphologically variation between the regenerated plants and the normal plants. Key words: sweet potato, in vitro regeneration, stem internode, explant. 1. Đặt vấn đề Khoai lang (Ipomoea batatas L.) là một trong những cây lơng thực quan trọng và đợc trồng tại hơn 100 nớc trên thế giới (Faostat- FAO, 1999). ở nớc ta, khoai lang đợc trồng phổ biến ở khắp các vùng vì không đòi hỏi thâm canh cao mà vẫn có thể cung cấp lợng lớn sinh khối làm lơng thực, thực phẩm cho con ngời và thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, các giống đang trồng chủ yếu là giống địa phơng năng suất và phẩm chất không cao, năng suất trung bình của cả nớc chỉ đạt 6,5-7,0 tấn/ha (Niên giám thống kê, 2003). Do đó, việc nghiên cứu cải tiến hay bổ sung thêm một số đặc tính nông sinh học cần thiết cho các giống khoai lang Việt Nam là yêu cầu của thực tiễn sản xuất. Tuy nhiên, để có đợc những giống khoai lang mới với các tính trạng mong muốn thì phơng pháp tạo giống truyền thống phải mất nhiều thời gian, công sức. Trong khi đó, kỹ thuật chuyển gen có thể khắc phục những hạn chế này. Đặc biệt, việc chuyển gen cho phép bổ sung những tính trạng cần thiết mà vẫn giữ đợc đặc tính của giống (C. James, 2003). Nhng để tạo đợc cây chuyển gen thì quy trình tái sinh in vitro là yêu cầu đầu tiên và có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của phơng pháp vì thờng chỉ có thể chuyển gen vào các tế bào, mô (lá, thân, callus), phôi sau đó nuôi cấy chúng để tái sinh thành cây hoàn chỉnh có mang các đặc tính đã đợc chuyển nạp. ở nớc ta, sự tái sinh in vitro của một số giống khoai lang đã đợc công bố (Phạm Bích Ngọc và CS, 2002), nhng cũng còn những hạn chế nh: hệ thống tái sinh phức tạp, thời gian nuôi cấy dài nên các vấn đề này rất cần đợc tiếp tục nghiên cứu cải tiến. 2. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu dùng trong các thí nghiệm là cây in vitro sạch virus của các giống khoai lang Chiêm dâu (CD), Nông nghiệp 31 (NN31) và Lim đã đợc tạo ra trong các nghiên cứu trớc đây (Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, 2003). 2.2. Phơng pháp nghiên cứu Tiêu chuẩn cây khoai lang để tách mẫu cấy: cây nuôi cấy mô có 8 lá, cao 7cm. Mẫu cấy là đoạn thân không có chồi nách dài 0,5 - 0,7cm và mô lá kích thớc 0,5 x 1cm. Các mẫu cấy này đợc nuôi cấy trên môi trờng MS (Murashige - Skoog, 1962) có bổ sung các chất điều tiết sinh trởng thực vật tuỳ thuộc từng thí nghiệm. Các thí nghiệm in vitro đợc tiến hành trong điều kiện: nhiệt độ: 272 o C, cờng độ chiếu sáng: 3000 lux, quang chu kỳ: 16 giờ chiếu sáng/ 8 giờ tối. 1 Tiêu chuẩn cây khoai lang cấy mô khi đa ra vờn ơm: cây có 5 lá, cao 4cm, có 3-4 rễ. Cây con đợc trồng trong điều kiện tự nhiên ở nhà lới cách ly, tới ẩm thờng xuyên, cung cấp dinh dỡng Growmore (20:20:20) 1 lần/ tuần. Thí nghiệm đợc bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức đợc bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại có 50 mẫu. Các chỉ tiêu thí nghiệm đợc quan sát và đo đếm định kỳ, 5 15 ngày 1 lần (tuỳ theo yêu cầu của thí nghiệm). 3. Kết quả nghiên cứu 3.1. Khả năng tái sinh của mô thân cây khoai lang ảnh hởng của Benzyladenin (BA) và các hợp chất auxin đến sự tái sinh của mô thân Trong thí nghiệm này, mô thân khoai lang chỉ tái sinh (tạo rễ, tạo callus và tạo chồi) khi đợc nuôi cấy trên môi trờng có bổ sung chất điều khiển sinh trởng (bảng 1). Hình thức tái sinh callus là phổ biến nhất và đều cho tỷ lệ tái sinh đạt 100% trên tất cả các công thức, tiếp đến là hình thức tái sinh rễ (công thức tốt nhất đạt 100%) và thấp nhất là tái sinh chồi (công thức tốt nhất đạt 43,3%). Trong các công thức thí nghiệm trên, môi trờng cho tỉ lệ tái sinh chồi đạt cao nhất ở giống Chiêm dâu là môi trờng MS có bổ sung 1ppmBA + 0,5ppmIAA/lít (đạt 43,3%) và giống NN31 là môi trờng MS có bổ sung 1ppmBA + 0,1ppm IAA/lít (đạt 16,6%). Chồi đợc hình thành là chồi đơn và tái sinh từ mô sẹo. Đờng hớng tái sinh này không thông qua quá trình tạo phôi soma nh một số công bố trớc đây (Liu Q. C., et al., 1998, Lucckmini K. W. et al., 1994). Bảng 1. ảnh hởng của BA và các hợp chất auxin đến sự tái sinh mô thân cây khoai lang giống CD và NN31 (sau 8 tuần) Các đờng hớng tái sinh Công thức thí nghiệm(ppm) Tỉ lệ tạo cal (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) Tỉ lệ tạo chồi (%) Sốchồi/mẫu cấy Giống Chiêm dâu MS (ĐC) 0 0 0 0 MS+1ppmBA+0,1ppmIAA 100 23,3 11,1 1 MS+1ppmBA + 0,5ppmIAA 100 46,6 43,3 1 MS+1ppmBA+0,1ppm NAA 100 0 3,3 1 MS+1ppmBA+0,5ppm NAA 100 100 16,6 1 MS+1ppmBA+0,1ppm 2,4D 100 0 0 0 MS+1ppmBA+0,5ppm 2,4D 100 0 0 0 Giống NN31 MS (ĐC) 0 0 0 0 MS+1ppmBA+0,1ppmIAA 100 50 16,6 1 MS+1ppmBA + 0,5ppmIAA 100 50 3,3 1 MS+1ppmBA+0,1ppm NAA 100 43,3 3,3 1 MS+1ppmBA+0,5ppm NAA 100 100 0 0 MS+1ppmBA+0,1ppm 2,4D 100 0 0 0 MS+1ppmBA+0,5ppm 2,4D 100 0 0 0 ảnh hởng của kinetin và các hợp chất thuộc nhóm auxin đến sự tái sinh của mô thân Kết quả nghiên cứu đợc trình bày ở bảng 2 chứng tỏ tác động của tổ hợp kinetin và các hợp chất auxin đến khả năng tái sinh của mô thân cũng theo quy luật tơng tự nh tác động của tổ hợp BA và các auxin. Nhng trong thí nghiệm này tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đã đợc cải thiện hơn. Môi trờng MS + 1ppm kinetin + 0,5 ppm IAA là môi trờng cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất đối với cả giống CD (53,3%) và NN31 (20,0%). Nh vậy, so với BA, kinetin tỏ ra có hiệu quả hơn trong kích thích sự tái sinh chồi từ mô thân và trong sự tổ hợp với các auxin thì tổ hợp giữa kinetin và IAA cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất.Từ nhận định này, thí nghiệm đã đợc mở rộng với những tổ hợp có nồng độ cao của kinetin để nâng cao hơn nữa sự tái sinh chồi của mẫu cấy vì đây là đờng hớng tái sinh quan trọng nhất. 2 Bảng 2. ảnh hởng của kinetin và các hợp chất auxin đến sự tạo chồi của mô thân cây khoai lang giống CD và NN31 (sau 8 tuần) Đờng hớng tái sinh Công thức thí nghiệm Tỉ lệ tạo cal (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) Tỉ lệ tạo chồi (%) Sốchồi/ mẫu cấy Giống Chiêm dâu MS(ĐC) 0 0 0 0 MS+1ppmKi+0,1ppmIAA 100 100 36,6 1 MS+1ppmKi + 0,5ppmIAA 100 100 53,3 1 MS+1ppmKi+0,1ppm NAA 100 100 23,3 1 MS+1ppmKi+0,5ppm NAA 100 100 0 0 MS+1ppmKi+0,1ppm 2,4D 100 0 0 0 MS+1ppmKI+0,5ppm 2,4D 100 0 0 0 Giống NN31 MS(ĐC) 0 0 0 0 MS+1ppmKi+0,1ppmIAA 100 100 6,6 1 MS+1ppmKi + 0,5ppmIAA 100 100 20,0 1 MS+1ppmKi+0,1ppm NAA 100 100 13,3 1 MS+1ppmKi+0,5ppm NAA 100 100 6,6 1 MS+1ppmKi+0,1ppm 2,4D 100 0 0 0 MS+1ppmKI+0,5ppm 2,4D 100 0 0 0 Kết quả thực nghiệm ở bảng 3 chỉ rõ: mô thân cây khoai lang có khả năng tái sinh callus và rễ khi đợc nuôi cấy trên môi trờng có bổ sung kinetin (từ 1- 2 ppm) kết hợp với IAA (nồng độ 0,1ppm và 0,5 ppm) với tỷ lệ 100%. Nhng nồng độ cao của kinetin đã làm giảm tỷ lệ tái sinh chồi của mô thân giống CD. Công thức CT3 (1,2ppm kinetin phối hợp với 0,5 ppm IAA) cho tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất, đạt 73,3%. Đối với giống NN31 quy luật tái sinh chồi có sự khác biệt so với giống CD, công thức CT7 (có 2 ppm kinetin và 0,1IAA) là công thức cho tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất, đạt 33,3%. Đối với cả 2 giống, đã có một tỷ lệ nhỏ mẫu cấy tái sinh theo hớng hình thành cụm chồi. Tuy nhiên, số lợng chồi/cụm chồi còn ít (thông thờng là 2 chồi). Bảng 3. ảnh hởng của kinetin và IAA đến sự tái sinh của mô thân cây khoai lang giống CD và NN31 (sau 8 tuần) Công thức thí nghiệm Đờng hớng tái sinh Tỉ lệ tạo callus (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) Tỉ lệ tạo chồi (%) Sốchồi/ mẫu cấy Giống Chiêm dâu MS(ĐC) 0 0 0 0 MS+1ppmKi+0,1ppmIAA 100 100 36,6 1,0 MS+1ppmKi+0,5ppmIAA 100 100 53,3 1,2 MS+1,2ppmKi+0,1ppmIAA 100 100 36,6 1,4 MS+1,2ppmKi+0,5ppm IAA 100 100 73,3 1,3 MS+1,5ppmKi+0,1ppmIAA 100 100 40,0 1,4 MS+1,5ppmKi+0,5ppm IAA 100 100 33,3 1,0 MS+2,0ppmKi+0,1ppm IAA 100 100 26,6 1,0 MS+2,0ppmKi+0,5ppm IAA 100 100 36,6 1,00 Giống NN31 MS(ĐC) 0 0 0 0 MS+1ppmKi+0,1ppmIAA 100 100 6,6 1,0 MS+1ppmKi+0,5ppmIAA 100 100 26,6 1,1 MS+1,2ppmKi+0,1ppmIAA 100 100 0 0 MS+1,2ppmKi+0,5ppm IAA 100 100 13,3 1,3 MS+1,5ppmKi+0,1ppmIAA 100 100 13,3 1,0 MS+1,5ppmKi+0,5ppm IAA 100 100 16,6 1,2 MS+2,0ppmKi+0,1ppm IAA 100 100 33,3 1,0 MS+2,0ppmKi+0,5ppm IAA 100 100 23,3 1,0 3 Để xác định khả năng tái sinh của giống khoai lang Lim, mô thân của giống này đã đợc nuôi cấy trên một số môi trờng tái sinh chồi có hiệu quả của giống CD và NN31. Kết quả nghiên cứu đợc thể hiện trên bảng 4. Bảng 4. ảnh hởng của kinetin và IAA đến sự tái sinh của mô thân cây khoai lang Lim (sau 8 tuần) Công thức thí nghiệm Tỉ lệ tạo cal (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) Tỉ lệ tạo chồi (%) Số chồi/ mẫu cấy ĐC: MS 0 0 0 0 CT1:1,0ppm Ki + 0,5ppm IAA 100 100 40,0 1 CT2:1,2ppm Ki + 0,5 ppm IAA 100 100 56,6 1 Tơng tự nh giống CD và NN31, mô thân của giống khoai lang Lim chỉ tái sinh (tạo callus, tạo rễ, tạo chồi) trên môi trờng có bổ sung chất điều tiết sinh trởng (kinetin và IAA). ở cả công thức CT1 và CT2 mẫu cấy có khả năng tái sinh cao, tỉ lệ tạo chồi là 40% và 56,6%. Phơng thức hình thành chồi của giống Lim cũng là chồi tái sinh từ callus và ở dạng chồi đơn. 3.2. Khả năng tái sinh của mô lá cây khoai lang Bảng 5. ảnh hởng của kinetin và IAA đến sự tái sinh chồi của mô lá cây khoai lang (sau 8 tuần) Giống NN31 Giống Chiêm dâu Giống Lim Công thức thí nghiệm Tỉ lệ tạo cal (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) Tỉ lệ tạo chồi (%) Tỉ lệ tạo cal (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) Tỉ lệ tạo chồi (%) Tỉ lệ tạo cal (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) Tỉ lệ tạo chồi (%) ĐC: MS 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MS+1,0ppmKi+0,5ppmIAA 100 3,3 0 100 6,6 0 100 10 3,3 MS+1,2ppmKi+0,5ppmIAA 100 3,3 3,3 100 6,6 0 100 10 3,3 Mô lá của các giống khoai lang nghiên cứu đã đợc nuôi cấy trên một số công thức thí nghiệm đã cho tỷ lệ tái sinh chồi cao khi nuôi cấy mô thân. Kết qjuả nghiên cứu (bảng 5) cho thấy mô lá của các giống khoai lang có khả năng tái sinh callus rất mạnh (100% trên hai công thức CT1 và CT2). Nhng khác với mô thân, tỷ lệ mô lá tạo rễ chỉ đạt 3,3 - 10,0 %. Đặc biệt, khả năng tái sinh chồi từ mô lá ở các giống rất thấp: giống CD không có cảm ứng tạo chồi ở cả hai công thức CT1 và CT2, giống NN31 có sự hình thành chồi ở công thức CT2, riêng giống Lim có sự tạo chồi ở cả hai công thức CT1 và CT2 nhng tỷ lệ hình thành chồi ở tất cả các công thức đều chỉ đạt là 3,3%. Do đó, rất cần phải tiếp tục nghiên cứu để nâng cao đợc tỷ lệ tái sinh chồi của mô lá. 3.3. Đánh giá sự sai khác về sinh trởng giữa cây tái sinh và cây nhân giống vô tính in vitro trong giai đoạn vờn ơm Các cây tái sinh từ mô thân của giống Chiêm dâu đợc trồng trong điều kiện tự nhiên của vờn ơm. So với các cây nhân nhanh in vitro (nuôi cấy các đoạn thân mang 1 nách lá) của giống này, các cây tái sinh không có sự sai khác về tỷ lệ sống và hình thái. Nhng sự sinh trởng của các cây nhân in vitro tỏ ra u thế hơn đôi chút. Bảng 6. Khả năng sống và sinh trởng của cây tái sinh và cây nhân giống vô tính in vitro tại vờn ơm (sau 4 tuần) Loại cây Tỉ lệ cây sống (%) Chiều cao TB (cm) Số lá TB (lá) Đặc điểm hình thái Cây tái sinh 100 22,74 2,1 6,63 0,7 Cây mập, khoẻ, lá xanh Cây nhân in vitro 100 24,70 2,5 7,48 0,8 Cây mập, khoẻ, lá xanh Nh vậy có thể kết luận rằng cây tái sinh từ mô thân cây khoai lang có thể sinh trởng bình thờng ở điều kiện ngoài vờn ơm giống nh cây nhân giống vô tính in vitro. Tuy nhiên cần phải tiếp tục đánh giá sự phát triển và hình thành sản phẩm kinh tế (củ) của cây tái sinh trong thời gian tiếp theo. 4 4. Kết luận Đã xây dựng đợc quy trình tái sinh in vitro của các giống khoai lang Chiêm dâu, Nông nghiệp 31 và Lim làm cơ sở cho kỹ thuật chuyển gen qua việc xác định đợc: 4.1. Loại mô thích hợp dùng để tái sinh cây khoai lang qua mô sẹo là mô thân. 4.2. Phơng thức hình thành chồi chủ yếu là chồi đơn tái sinh từ mô sẹo. 4.3. Môi trờng tái sinh chồi tốt nhất đối với mô thân các giống khoai lang khác nhau là khác nhau: Đối với giống Chiêm Dâu và giống Lim: MS + 1,2 ppmkinetin và 0,5 ppm IAA/lít. Trên môi trờng này tỷ lệ tái sinh chồi của giống Chiêm dâu đạt 73,3% và giống Lim đạt 56,6%. Đối với giống NN31: MS + 2,0 ppm kinetin và 0,1 IAA/lít. Trên môi trờng này tỷ lệ tái sinh chồi đạt 33,3% 4.4. Cây tái sinh có khả năng sống và sinh trởng bình thờng giống nh cây nhân giống vô tính in vitro ở ngoài điều kiện môi trờng tự nhiên. Tài liệu tham khảo Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, 2003. Nghiên cứu làm sạch virus bằng nuôi cấy meristem trên một số giống khoai lang ở Bắc Việt nam. Báo cáo khoa học hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003. Nxb Khoa học kỹ thuật, trang: 735-739. Phạm Bích Ngọc, Đinh thị Phòng, Egnin M., Prakash C. S., Lê Trần Bình, 2002. Hoàn thiện phơng pháp chuyển gen vào một số giống khoai lang Việt Nam thông qua Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí khoa học và công nghệ. Tập 40-số ĐB/2002, trang:142-149. Niên giám thống kê, 2003. Nxb Thống kê, Hà nội-2003. Trang: 45 Clive James, 2003. Global Status of Commercialized Transgenc Crops: 2003. ISAAA Briefts. p: 1-25. Liu Q. C., et al., 1998. An efficient system of embryogenic suspension culture and plant regeneration in sweetpotato, Impact on a changing world". International potato center program report, 1997-1998, p. 265 267 Lucckmini K. W. et al., 1994. Plant regeneration of sweetpotato(Ipomoea batatas Poir.). Plant Cell Reports 3, p: 112-115 Murashige T., Skoog F. A., 1962. A revised medium for rapid growth and biossays with tobaco tissue culture. Physiol. plant. 15, p: 473-479 Faostat - FAO Statistics Database (Online). Accessed June 1999. http://apps.fao.org 5 . Nghiên cứu sự tái sinh in vitro một số giống khoai lang Việt nam Study on in vitro regeneration of some Vietnam sweetpotato varieties Nguyễn Thị Lý. nghiên cứu để nâng cao đợc tỷ lệ tái sinh chồi của mô lá. 3.3. Đánh giá sự sai khác về sinh trởng giữa cây tái sinh và cây nhân giống vô tính in vitro trong giai đoạn vờn ơm Các cây tái sinh. nghiên cứu 3.1. Khả năng tái sinh của mô thân cây khoai lang ảnh hởng của Benzyladenin (BA) và các hợp chất auxin đến sự tái sinh của mô thân Trong thí nghiệm này, mô thân khoai lang chỉ tái