Luận văn nghiên cứu mối liên quan giữa hình thái phôi nang và đột biến nhiễm sắc thể của phôi trong thụ tinh ống nghiệm

5 MỞ ĐẦU Hiện nay, tỷ lệ vô sinh ngày tăng lên, cặp vợ chồng độ tuổi sinh sản muộn ngày nhiều Theo Bộ y tế Việt Nam có khoảng 7,7% cặp vợ chồng vơ sinh muộn 50% số độ tuổi sinh sản [1] Cùng với phát triển khoa học, kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm (IVF - In vitro fertilization) đời ngày đƣợc ứng dụng rộng rãi điều trị vô sinh toàn giới Trong kỹ thuật này, tinh trùng trứng đƣợc lấy khỏi thể sau đƣợc kết hợp tạo phơi phịng thí nghiệm Phơi đƣợc ni từ đến ngày sau chuyển vào buồng tử cung ngƣời phụ nữ Hiện IVF phƣơng pháp điều trị hiệu cho cặp đôi muộn Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển phơi có thai trung bình chƣa cao từ 30% – 40% [2] Việc lựa chọn phôi thƣờng dựa tiêu chuẩn hình thái phôi nhƣ: mức độ giãn rộng khoang phôi, đặc điểm hình thái ni, đặc điểm hình thái nụ phơi… Chúng ta biết đánh giá hình thái không phản ánh đầy đủ chất lƣợng thực phôi, hạn chế đến kết điều trị thụ tinh ống nghiệm Nhiều phơi có số hình thái cao lại không làm tổ đƣợc không tạo trẻ khoẻ mạnh, ngƣợc lại, số phơi có số hình thái thấp lại tạo em bé bình thƣờng Chuyển phơi có chất lƣợng tốt để nâng cao tỷ lệ có thai thụ tinh ống nghiệm vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu Đột biến nhiễm sắc thể (NST) nguyên nhân ảnh hƣởng tới tỷ lệ thành công thụ tinh ống nghiệm dẫn tới sảy thai, thai lƣu dị tật thai nhi Vì vậy, nên có phƣơng pháp tìm phơi bình thƣờng loại phôi đột biến trƣớc cấy chuyển phôi Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đƣợc kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử xét nghiệm di truyền tiền làm tổ giúp sàng lọc phôi, đánh giá đột biến cấu trúc số lƣợng NST phôi trƣớc chuyển phôi Phƣơng pháp đƣợc ứng dụng lâm sàng để cải thiện tỷ lệ thành công điều trị vô sinh áp dụng bệnh nhân có nguy cao đột biến NST, đặc biệt với cặp vợ chồng có tiên lƣợng xấu nhƣ tuổi mẹ cao, chuyển phôi thất bại nhiều lần sảy thai liên tiếp Để cải thiện tỷ lệ thành công kỹ thuật IVF, giảm tỷ lệ sảy thai, yêu cầu phải sàng lọc đột biến NST toàn bộ NST Kỹ thuật khơng xâm lấn ngƣời mẹ, nhanh chóng, giảm chi phí nhƣ tránh đƣợc gánh nặng tinh thần, áp dụng cho tất bệnh nhân Gần đây, tổng hợp kết nghiên cứu xét nghiệm di truyền lệch bội tiền làm tổ ( PGT-A) cho thấy tỷ lệ chuyển phôi, có thai tăng lên đáng kể [3] Trên giới có nhiều nghiên cứu liên quan đến đột biến NST phơi nang Đồng thời có nhiều hƣớng nghiên cứu nhằm kết hợp sử dụng đặc điểm hình thái phôi nang xét nghiệm sàng lọc di truyền phơi với mục đích lựa chọn phơi tiềm sử dụng để chuyển phôi nhằm tăng hiệu chu kỳ IVF [4] Tuy nhiên chƣa có nhiều nghiên cứu mối liên quan hình thái phơi đến đột biến NST phơi nang, tiếp tục nghiên cứu tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan hình thái phơi nang đột biến nhiễm sắc thể phôi thụ tinh ống nghiệm” với mục tiêu: Đánh giá hình thái phơi ngày thụ tinh ống nghiệm Bƣớc đầu xác định mối liên quan hình thái phôi với nhiễm sắc thể phôi CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐỊNH NGHĨA, TÌNH HÌNH VƠ SINH THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1 Định nghĩa vô sinh Theo định nghĩa Tổ chức y tế giới năm 2000, vô sinh đƣợc hiểu tình trạng cặp vợ chồng khơng có thai sau năm chung sống, giao hợp bình thƣờng, khơng sử dụng biện pháp tránh thai Trong trƣờng hợp tuổi ngƣời vợ 35 khoảng thời gian tháng đƣợc đánh giá vơ sinh [5] Vơ sinh ngun phát, cịn đƣợc gọi vơ sinh loại I: tình trạng vơ sinh cặp vợ chồng mà ngƣời vợ chƣa có thai lần Vơ sinh thứ phát, cịn đƣợc gọi vơ sinh loại II: tình trạng vơ sinh cặp vợ chồng mà ngƣời vợ có thai trƣớc (ít lần) Vơ sinh nữ trƣờng hợp vô sinh nguyên nhân ngƣời vợ Vô sinh nam trƣờng hợp vô sinh nguyên nhân ngƣời chồng Những trƣờng hợp vô sinh khơng r ngun khơng tìm thấy nguyên nhân gây vô sinh vợ chồng Ngồi cịn có ngun nhân vơ sinh vợ chồng 1.1.2 Tình hình vơ sinh giới Theo số liệu công bố năm 2012, đánh giá khảo sát 277 nghiên cứu đƣợc thực quy mơ để điều tra tình hình vô sinh vùng quốc gia lãnh thổ giới, cho thấy kết chung tỉ lệ vô sinh dao động phạm vi từ 9,1% đến 13,1% [6] Năm 2010, tỉ lệ vô sinh nguyên phát nữ giới độ tuổi từ 20 đến 44 khoảng 1,9% Tỉ lệ dao động phạm vi từ 1,7% đến 2,2% tùy thuộc quốc gia lãnh thổ Tỉ lệ 10,5% tỉ lệ vô sinh trung bình nhóm vơ sinh thứ phát độ tuổi Trong phạm vi dao động tỉ lệ vô sinh thứ phát từ 9,5% đến 11,7% Đặc biệt, không nhận thấy khác biệt tỉ lệ vơ sinh trung bình vơ sinh nguyên phát vô sinh thứ phát so sánh số liệu kết tổng hợp điều tra năm 2010 năm 1990 Nhƣ nói kết phản ánh trung thực thực trạng tình hình vơ sinh giới Khi so sánh tỉ lệ vơ sinh theo nhóm tuổi cho thấy, tỉ lệ vơ sinh ngun phát nhóm dƣới 25 tuổi, nhóm từ 25 đến 29 tuổi, nhóm từ 30 đến 44 tuổi lần lƣợt là: 2,7%; 2,0% 1,6% Và tỉ lệ vô sinh thứ phát 2,6% nhóm từ 20 - 24 tuổi 27,1% nhóm từ 40 - 44 tuổi [6] 1.1.3 Tình hình vơ sinh Việt Nam Mặc dù ngành hỗ trợ sinh sản Việt Nam đời sau so với giới, nhƣng tính đến nƣớc có 35 sở hỗ trợ sinh sản thực thụ tinh ống nghiệm Theo số liệu khảo sát tác giả Nguyễn Viết Tiến công bố năm 2011, tỷ lệ vô sinh trung bình tồn quốc khoảng 7,7% [1] Trong tỷ lệ vô sinh nguyên phát 3,9% vô sinh thứ phát 3,8% Nhƣ vậy, tỉ lệ vô sinh Việt Nam theo nhƣ nghiên cứu dịch tễ thấp so với tỉ lệ vô sinh chung giới Tuy nhiên tỉ lệ vô sinh nguyên phát Việt Nam lại cao hơn, điều giải thích xu tỉ lệ phụ nữ Việt Nam mong muốn có sớm so với mặt chung giới, đặc biệt nƣớc phát triển Xét đặc điểm phân bố nguyên nhân dẫn đến vô sinh có nhiều nghiên cứu đƣợc tác giả đƣa kết khác Theo nghiên cứu Trần Thị Trung Chiến cộng sự, nguyên nhân gây vô sinh nam chiếm khoảng 40,8% số trƣờng hợp vô sinh Trong nghiên cứu đƣợc thực Bệnh viện Phụ sản Trung ƣơng tiến hành 1000 trƣờng hợp vơ sinh có đầy đủ xét nghiệm thăm dị chẩn đốn cho kết tỷ lệ vô sinh nữ chiếm khoảng 54%, vô sinh nam chiếm 36%, vô sinh nam nữ chiếm 10%, cịn lại 10% vơ sinh khơng rõ ngun nhân [7] 1.2 QUÁ TRÌNH THỤ TINH VÀ LÀM TỔ CỦA PHƠI NGƢỜI 1.2.1 Sự thụ tinh - giai đoạn hình thành hợp tử Khái niệm: Sự thụ tinh kết hợp tinh trùng với noãn tạo thành hợp tử có NST lƣỡng bội đặc trƣng lồi Kết trình thụ tinh làm phục hồi lại NST đặc trƣng loài, trì ổn định NST quần thể lồi, định giới tính cho cá thể phơi khởi động q trình phân cắt, phát triển phơi Ở ngƣời q trình diễn vị trí 1/3 ngồi vịi trứng [8], [9] Xét khía cạnh sinh học, thụ tinh liên quan đến bƣớc tuần tự: - Sự lựa chọn tinh trùng tham gia trình thụ tinh - Sự xâm nhập tế bào tinh trùng qua lớp vỏ noãn - Sự gắn kết tế bào tinh trùng màng bào tƣơng nỗn, q trình hịa hợp bào tƣơng xảy giao tử - Sự hịa hợp nhân dẫn đến việc hình thành gen phôi 1.2.2 Sự phân cắt làm tổ phôi Ở ngƣời, vào khoảng thứ 30 sau hình thành hợp tử, phơi bƣớc vào phân cắt lần đầu để sinh phôi bào, phơi bào, hình thành phơi dâu Phơi lúc cịn đƣợc màng suốt bao bọc, phôi bào nhỏ dần sau lần phân cắt Giữa phôi bào phôi dâu bắt đầu xảy trình tiết dịch hấp thụ dịch vào Khi phôi dâu xuất khoang chứa dịch phơi dâu biến thành phơi nang Q trình phân cắt phơi để hình thành phơi dâu, phơi nang xảy vịi trứng tử cung vòng từ - ngày sau thụ tinh Khi phôi nang đƣợc tạo thành, khối tế bào bên gọi nụ phôi, phát triển thành thai sau Khối tế bào bên đƣợc gọi nuôi, phát triển thành phần phụ thai Cực có mầm phơi đƣợc gọi cực phôi, cực gọi cực đối phôi Lá ni hợp bào phía cực phơi bám vào niêm mạc tử cung ngƣời mẹ, từ l m sâu vào bên tự vùi vào lớp niêm mạc tử cung ngƣời mẹ [8], [9], [10] 1.2.3 Q trình phát triển đánh giá phơi tới giai đoạn ngày thụ tinh ống nghiệm Khoảng 16 sau thụ tinh, phơi bình thƣờng có tiền nhân Ở số bệnh nhân, tiền nhân xuất sớm 12 - 14 sau thụ tinh 10 xuất muộn sau 20 - 22 Sự phân chia xảy khoảng 20 - 24 sau thụ tinh Bình thƣờng 24 giờ, phơi có số lƣợng tế bào phát triển tăng gấp đôi Vào ngày thứ 2, phơi phát triển bình thƣờng có đến tế bào có khoảng tế bào vào ngày thứ Trong q trình phát triển phơi trải qua chu kì phân chia Thời điểm chu kì phân chia lần lƣợt 35,6 giờ; 45,7 54,3 sau thụ tinh Số lƣợng tế bào phơi khơng chẵn gặp phơi phát triển bình thƣờng tế bào phơi giai đoạn phân bào phân chia tế bào phôi không đồng Cuối ngày thứ sau phát triển thành tế bào (rất trƣờng hợp phát triển đến 16 - 32 tế bào) phơi kết dính bắt đầu xuất khoang nhỏ phôi vào cuối ngày thứ tƣ Khoảng 120 (ngày thứ 5) sau thụ tinh, phôi tiếp tục phân chia, số lƣợng phôi bào tăng dần phát triển thành phôi nang Phôi nang phát triển hoàn toàn vào ngày thứ Số lƣợng tế bào thời điểm vào khoảng 50 đến 150 tế bào bao gồm loại: - Loại tế bào thứ hình thành đám tế bào nụ phơi (Inner Cell Mass/ ICM) sau phát triển thành thai, chiếm khoảng từ 20 - 30% tổng số tế bào - Loại tế bào thứ hai tế bào nuôi (Trophectoderm Epithelium/ TE) phát triển thành phần phụ thai Tế bào nuôi tạo thành lớp bao quanh đám tế bào nụ phôi (phôi thai sau này) khoang phôi chứa đầy dịch hai loại tế bào tiết để bảo vệ nuôi dƣỡng thai Vào giai đoạn này, màng suốt (zona pellucida/ ZP) bị dàn mỏng bao quanh nhƣ màng mỏng, sau màng suốt vỡ để phơi bào ngồi màng gọi tƣợng phơi màng chuẩn bị cho làm tổ phôi tử cung Hiện tƣợng phơi màng xuất vào cuối ngày hoàn chỉnh vào ngày thứ thứ Hình thái phơi đƣợc đánh giá nỗn đƣợc thụ tinh giai đoạn cuối phơi nang trƣớc khỏi màng suốt Cụ thể phôi ngày giai đoạn xuất hai tiền nhân, phôi phân cắt vào 11 ngày 3, ngoại trừ phôi ngày giai đoạn phơi dâu đƣợc xem xét lúc phơi thƣờng kết dính, khó xác định ranh giới phôi bào tỷ lệ mảnh vỡ bào tƣơng Phôi nang thƣờng xuất khoang nên bắt đầu quan sát thấy phôi bào bên Trong nghiên cứu chọn đánh giá vào thời điểm ngày sau thụ tinh Mặc dù phôi chuyển đƣợc theo d i đánh giá vào dựa hình thái phơi nhƣng chƣa thể xác, phơi chuyển bất thƣờng dừng phát triển giai đoạn sau Do vậy, bệnh nhân có lợi phơi ni cấy kéo dài đến ngày Phôi trƣớc ngày có tỷ lệ phơi ngừng phát triển (Embryo block), giai đoạn phôi phát triển chủ yếu dựa vào hoạt động di truyền noãn, sau giai đoạn gen phôi bắt đầu hoạt động Gardner D K cộng (1999) xác định đƣợc phôi nang có chất lƣợng tốt vào hình dạng tế bào nuôi nụ phôi Tác giả đánh giá nụ phôi thành loại: loại A tế bào nụ phôi nhiều, gắn kết chặt chẽ Loại B có vài tế bào, gắn kết lỏng lẻo Loại C có tế bào Cùng với tế bào ni tạo thành lớp biểu mô gắn kết chặt chẽ Phôi nang đƣợc đánh giá dựa vào tiêu chuẩn Gardner D K theo thang điểm từ đến phụ thuộc vào độ phát triển rộng khoang phôi chứa dịch tƣợng màng [11] 1.3 HÌNH THÁI PHƠI NANG 1.3.1 Những nghiên cứu phôi nuôi cấy ngày Mặc dù trƣờng hợp thụ tinh ống nghiệm thành công giới từ kết chuyển phôi giai đoạn phôi nang (phôi nuôi cấy ngày 5), nhƣng phần lớn việc chuyển phôi hầu hết trung tâm thụ tinh ống nghiệm giới phổ biến áp dụng chuyển phôi giai đoạn phôi phân cắt Dễ hiểu việc nuôi cấy phôi kéo dài đến giai đoạn phơi nang cịn nhiều yếu điểm nhƣ: kéo dài thời gian phơi nhiễm phôi, thao tác phức tạp, tốn đặc biệt hiệu không cao so với chuyển phôi nuôi cấy 12 Năm 2010, Kallen B cộng so sánh số trẻ sơ sinh nhóm chuyển phơi nang chuyển phơi giai đoạn phân cắt, cho thấy có tăng nhẹ yếu tố nguy chuyển phôi giai đoạn phôi nang Từ đƣa khuyến cáo không nên áp dụng chuyển phôi nang cho tất trƣờng hợp thụ tinh ống nghiệm [12] Tuy nhiên, vài năm gần đây, với phát triển hệ thống nuôi cấy phôi đại dựa hiểu biết đầy đủ phát triển phôi giai đoạn sau nén cho phép kéo dài thời gian nuôi cấy phôi ống nghiệm đến giai đoạn phơi nang Bên cạnh đó, lý mà đa số nghiên cứu ủng hộ cho việc nuôi cấy phôi kéo dài chuyển phôi giai đoạn phôi nang lựa chọn đƣợc phơi có sức sống tốt nhất, tiềm làm tổ cao khả đồng với niêm mạc tử cung mẹ để tăng kết chu kỳ thụ tinh ống nghiệm đồng thời giảm số lƣợng phôi chuyển, giảm nguy đa thai Năm 2011, Maheshwari A cộng nghiên cứu tổng hợp kết chuyển phôi quốc gia thuộc châu Âu châu Mỹ, nhận thấy có gia tăng tỷ lệ chuyển phôi giai đoạn phôi nang đặc biệt chuyển phôi đơn [13] Sundhararaj cộng (2017) chuyển phôi nang đơn phƣơng pháp hiệu để giảm nguy đa thai mà không ảnh hƣởng đến kết mang thai với tỷ lệ có thai lâm sàng chiếm 35,6% 44,6%; tỷ lệ thai sinh sống chiếm 30,2% 34,1% nhóm chuyển phơi phơi Với tiềm đầy hứa hẹn phƣơng pháp đông phôi thủy tinh hóa, phơi nang cịn lại đƣợc bảo quản lạnh [2] Hiện nay, giới có hƣớng nghiên cứu kết hợp sử dụng đặc điểm hình thái phơi nang xét nghiệm sàng lọc di truyền phơi với mục đích lựa chọn phơi tiềm sử dụng chuyển phôi nhằm tăng hiệu chu kỳ IVF Hệ thống đánh giá hình thái phôi giai đoạn phôi nang đƣợc tác giả Gardner D K Schoolcraft W B đề cập lần vào năm 1999 nhanh chóng đƣợc áp dụng hầu hết trung tâm thụ tinh ống nghiệm giới [11] 13 Mặc dù cách đánh giá hình thái Gardner D K chƣa bao hàm trọn vẹn đặc điểm hình thái phôi nang, đặc biệt trƣờng hợp có yếu tố khơng theo quy luật, nhƣng ƣu điểm cách đánh giá dễ áp dụng đánh giá đƣợc phôi nang dựa tiêu chí quan trọng Đây thành phần cấu tạo phơi nang, là: - Sự phát triển khoang phôi nang - Đặc điểm tế bào nuôi (TE - Trophectoderm Epithelium) - Đặc điểm nụ phôi (ICM - Inner Cell Mass) Trong đó, mức độ phát triển khoang phơi nang đƣợc chia thành điểm Khi khoang phôi nang phát triển từ độ trở lên, có thêm mô tả chi tiết loại tế bào xuất tế bào nuôi (TE) nụ phôi (ICM) Theo hệ thống đánh giá ni nụ phôi đƣợc chia thành loại dựa số lƣợng gắn kết tế bào [11] 1.3.2 Những nghiên cứu mức độ phát triển khoang phôi nang Sự phát triển phôi nang đƣợc xác định bắt đầu xuất khoang chứa dịch thân khối phôi Lƣợng dịch tiết ngày nhiều tích tụ lại để hình thành khoang, sau phát triển thành khoang phôi nang Cùng thời điểm này, khối tế bào phôi có thay đổi quan trọng, biệt hóa để hình thành loại tế bào, ni nụ phôi Đồng thời số lƣợng tế bào tăng lên nhanh chóng Việc nghiên cứu thời điểm mức độ phát triển khoang phơi nang có vai trị quan trọng, định thành cơng chuyển phôi nang Năm 2013, Van den Abbeel E cộng sự, nghiên cứu ảnh hƣởng tiêu chuẩn hình thái phơi nang đến khả tiên lƣợng thành công kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, nhận thấy có mối tƣơng quan độ giãn rộng khoang phơi nang với tỷ lệ có thai sinh sống [14] Cùng năm 2013, Thompson S M cộng nghiên cứu đánh giá độ giãn rộng khoang phơi nang có liên quan đến việc tiên lƣợng tỉ lệ thai 14 lâm sàng thai sinh sống chu kỳ thụ tinh ống nghiệm Nhƣ vậy, nói có nhiều nghiên cứu đánh giá kết luận vai trò tốc độ phát triển khoang phôi nang đến kết trình tiên lƣợng nhƣ dự kiến kết thành công chu kỳ chuyển phôi nang [15] Tuy nhiên kết nghiên cứu năm 2018 Zhao cộng cho thấy giãn rộng khoang phôi nang khơng dự đốn kết IVF Mức độ giãn rộng khoang phôi nang đạt đƣợc phụ thuộc vào chức TE, bao gồm thành cơng q trình nén phơi, hình thành liên kết chặt, chế bơm nƣớc ion khác ra, vào tế bào Có thể mức độ giãn rộng khoang phôi nang không dự đốn kết mang thai giai đoạn phơi đƣợc phân tích, độ giãn rộng khoang phơi chƣa ảnh hƣởng đến phát triển phơi, phôi chuẩn bội với ICM TE chất lƣợng cao tiếp tục mở rộng sau sinh thiết TE [16] 1.3.3 Những nghiên cứu hình thái nụ phôi Ngay phôi nang phát triển đầy đủ, thể tích khoang chiếm tồn thể tích khối phơi, cần có thêm tiêu chí để đánh giá chất lƣợng phơi nang r ràng Vì lúc phơi nang hình thành loại tế bào với đặc trƣng hình thái khác Các tế bào lớp phía ngồi phơi nang có đặc điểm giống nhƣ lớp tế bào biểu mô dạng dẹt Chúng có xu dẹt lại để hình thành lớp "biểu mô" làm ranh giới phôi nang với môi trƣờng xung quanh Lớp tế bào gọi ni Những tế bào nằm lịng khoang phơi nang thƣờng có kích thƣớc lớn hơn, tập trung thành cụm nằm lệch cực phôi nang, đƣợc gọi nụ phôi Về sau khối tế bào nụ phơi biệt hóa để hình thành thai, cịn lớp tế bào ni biệt hóa thành phần phụ thai nhƣ bánh rau, dây rốn Trong nghiên cứu Van den Abbeel E cộng (2013) mối liên hệ đặc điểm hình thái phơi nang kết chu kỳ chuyển phơi đơn, nhận thấy vai trị việc phân loại nụ phôi khả tiên lƣợng sảy thai sớm Trong đó, tỉ lệ có thai diễn tiến nhóm chuyển HÌNH ẢNH MỘT SỐ EM BÉ ĐƢỢC SINH RA KHỎE MẠNH NHỜ PHƢƠNG PHÁP PGT-A SỬ DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM TẠI TRUNG TÂM HỖ TRỢ SINH SẢN BỆNH VIỆN ĐA KHOA 16A HÀ ĐÔNG DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Hồng Minh Ngân, Nguyễn Đình Tảo, Nguyễn Trung Nam, Triệu Tiến Sang, 2020, Nghiên cứu mối liên quan hình thái phơi nang với bất thường nhiễm sắc thể, Tạp chí Y – Dược học Quân sự, (3), tr.74-81 Hoang Minh Ngan, Nguyen Dinh Tao, Nguyen Trung Nam, Trieu Tien Sang, 2020, Study on the relationship between blastocyst morphology and chromosome abnormality, Journal of Military Pharmaco – Medicine, pp.197204 Hoàng Minh Ngân, Nguyễn Đình Tảo, Nguyễn Trung Nam, Triệu Tiến Sang, 2020, Khảo sát mối liên quan tuổi mẹ với hình thái đột biến nhiễm sắc thể phôi ngày 5, Tạp chí y học Việt Nam, 490(2) Hồng Minh Ngân, Nguyễn Đình Tảo, Nguyễn Trung Nam, Triệu Tiến Sang, 2020, Đánh giá mối liên quan hình thái phơi nang với bất thường nhiễm sắc thể, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 62(7) T¹p chí y - dợc học quân số 3-2020 NGHIấN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHƠI NANG VỚI BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Hồng Minh Ngân1, Nguyễn Đình Tảo2 Nguyễn Trung Nam3, Triệu Tiến Sang3 TÓM TẮT Mục tiêu: Đánh giá mối liên quan hình thái phơi nang với bất thường nhiễm sắc thể (NST) Đối tượng phương pháp: Nghiên cứu hồi cứu, mô tả cắt ngang 953 phôi ngày thứ lâm sàng lọc NST Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản, Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông từ 2/2018 - 5/2019 Kết quả: Tỷ lệ bất thường NST phôi nang lớn, bất thường khảm 56,68%, bất thường số lượng nhiễm sắc thể 36,6%, bất thường cấu trúc 6,68% Số phơi bình thường chiếm đa số nhóm phơi phân loại hình thái tốt (69,1%) Tỷ lệ mang 1, 2, bất thường tăng dần nhóm phơi trung bình xấu Nguy bất thường NST tăng lên độ giãn rộng khoang phơi thấp hình thái ni, hình thái nụ phơi xấu Với hình thái phôi ngày thứ xếp loại tốt, nguy bất thường nhiễm sắc thể giảm (OR = 0,22; 95%CI = 0,16 - 0,29; p < 0,001) Kết luận: Có mối liên quan chặt chẽ hình thái phơi nang với bất thường NST Độ giãn rộng (ĐGR) phôi thấp, hình thái ni, nụ phơi hình thái phơi nang xấu tỷ lệ bất thường NST tăng lên * Từ khóa: Bất thường nhiễm sắc thể; Phơi nang; Thụ tinh ống nghiệm; Sàng lọc di truyền ĐẶT VẤN ĐỀ Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi bệnh nhân (BN) có nguy cao bất thường NST Chẩn đốn rối loạn NST trước chuyển phôi giúp sàng lọc, đánh giá bất thường NST phôi trước chuyển vào buồng tử cung người mẹ Phương pháp ứng dụng lâm sàng cho kết cải thiện tỷ lệ thành công điều trị vô sinh áp dụng BN có nguy cao bất thường NST Đặc biệt, cặp vợ chồng có yếu tố nguy tuổi mẹ cao, chuyển phôi thất bại nhiều lần sảy thai liên tiếp Để cải thiện tỷ lệ thành công kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF) giảm tỷ lệ sảy thai, số trường hợp nên cân nhắc sàng lọc rối loạn NST tiền làm tổ (preimplantation genetic screening - PGS) Ưu điểm kỹ thuật khơng xâm lấn người mẹ, nhanh chóng, giảm chi phí tránh gánh nặng tinh thần áp dụng cho tất BN Gần đây, kết nghiên cứu cho thấy, cặp vợ chồng có phơi làm PGS tỷ lệ chuyển phơi, có thai tăng lên đáng kể Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông Học viện Quân y Học viện Khoa học Công nghệ Người phản hồi: Hoàng Minh Ngân (hmngan3509@gmail.com) Ngày nhận bài: 03/4/2020 Ngày báo đăng: 15/4/2020 74 T¹p chÝ y - dợc học quân số 3-2020 Trờn th gii, ó có nghiên cứu sử dụng đặc điểm hình thái phôi nang kết hợp với xét nghiệm sàng lọc di truyền phôi nhằm lựa chọn phôi tiềm để chuyển vào buồng tử cung người mẹ, tăng hiệu chu kỳ IVF Tuy nhiên, nghiên cứu mối liên quan hình thái đến rối loạn NST phơi nang cịn Do vậy, tiến hành đề tài nhằm: Nghiên cứu mối liên quan hình thái phơi nang với bất thường NST Phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu hồi cứu, mô tả cắt ngang - Các phôi đánh giá chất lượng hình thái phơi theo tiêu chuẩn tác giả Gardner D.K (1999) Hình thái ni nụ phôi chia thành loại A, B, C dựa số lượng tế bào cách xếp tế bào Bảng 1: Hình thái phơi nang theo tiêu chuẩn Gardner Majumda Xếp loại ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tốt Phơi có mức ĐGR ≥ Phân loại ICM TE là: AA; AB; BA Trung bình Phơi có mức ĐGR ≥ Phân loại ICM TE là: BB; CA Đối tượng nghiên cứu 953 phôi ngày thứ tạo phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn có kết hợp đánh giá hình thái phơi tiến hành sinh thiết sàng lọc NST Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản, Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông từ 2/2018 5/2019 * Tiêu chuẩn lựa chọn: - Các phơi có mức độ phát triển giãn rộng xoang phôi ≥ độ Các phôi sinh thiết tiến hành sàng lọc phương pháp giải trình tự gen hệ (NGS) * Tiêu chuẩn loại trừ: - Các phôi không đủ điều kiện sinh thiết, phát triển giai đoạn sớm có dấu hiệu ngừng phát triển - Phơi cặp bố mẹ người gia đình bố mẹ mắc bệnh di truyền; Phôi cặp bố mẹ mắc bệnh nội khoa cấp tính hay mạn tính Mơ tả Phơi có mức ĐGR < Xấu Hoặc ĐGR ≥ 3, phân loại ICM TE là: AC; BC; CB; CC Các phôi sinh thiết, rửa tế bào mang mẫu sàng lọc: Lấy cụm tế bào nuôi từ phôi nuôi cấy ngày thứ kim sinh thiết, rửa cụm tế bào thật dung dịch PBS (Phosphate Buffered Saline) cho mẫu vào ống PCR cất vào bullet Phân tích mẫu phương pháp NGS sử dụng kít VERIEQ máy MiseQ Thu thập số liệu cách chụp ảnh qua kính hiển vi đảo ngược vi thao tác Carl zeiss (Đức) Xử lý liệu phần mềm SPSS 20.0 75 T¹p chÝ y - dợc học quân số 3-2020 KT QU NGHIấN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tỷ lệ loại bất thường NST phôi nang Bất thường số lượng (36,6%) Bất thường cấu trúc (6,68%) Bất thường khảm (56,68%) Biểu đồ 1: Tỷ lệ loại bất thường NST phơi nang Trong 953 phơi sàng lọc, có 614 phơi đột biến (64,53%) Điều cho thấy, tỷ lệ đột biến NST cao Trong phôi bất thường NST, tỷ lệ bất thường khảm cao 56,68%, bất thường số lượng NST (36,6%) Trong đó, tỷ lệ bất thường nhóm NST thừa NST 18,73% 17,92% Điều tương tự nghiên cứu Franasiak CS (2014) nghiên cứu 15.169 phơi, nhóm tác giả tỷ lệ trisomy/monosomy xấp xỉ Tỷ lệ bất thường thừa NST NST phổ biến gần tương đương [3] Nhóm bất thường cấu trúc NST nghiên cứu chiếm tỷ lệ thấp (6,68%) Mối liên quan hình thái phơi nang với bất thường NST Bảng 2: Mối liên quan hình thái phơi nang với bất thường NST Bình thường n (%) Bất thường NST n (%) OR (95%CI) Độ 364 (68,70) 166 (31,30) 0,32 (0,25 - 0,42) Độ 153 (44,60) 190 (55,40) 2,14 (1,64 - 2,80) Độ 22 (27,50) 58 (72,50) 3,83 (2,30 - 6,37) A 303 (72,30) 116 (27,70) 0,30 (0,23 - 0,40) B 214 (49,90) 215 (50,10) 1,64 (1,27 - 2,13) C 22 (21,00) 83 (79,00) 5,89 (3,61 - 9,62) p Độ giãn rộng < 0,001 Hình thái ni 76 < 0,001 T¹p chí y - dợc học quân số 3-2020 Hỡnh thái nụ phôi A 415 (68,7) 189 (31,3) 0,25 (0,19 - 0,33) B 104 (39,1) 162 (60,9) 2,69 (2,01 - 3,60) C 20 (24,1) 63 (75,9) 4,66 (2,77- 7,84) Mức ĐGR xoang phôi thể tốc độ phát triển phôi đồng nghĩa với việc phôi phát triển nhanh khả có bất thường NST thấp, điều thể rõ kết chúng tơi Những phơi có ĐGR loại (phân loại thấp ghi nhận nghiên cứu) làm tăng nguy bất thường NST (OR = 3,83; 95%CI = 2,3 - 6,37; p < 0,001) so với nhóm cịn lại Trong đó, phơi có ĐGR xoang phơi loại 5, nguy bất thường NST giảm đáng kể (OR = 0,32; 95%CI = 0,25 - 0,42; p < 0,001) so với nhóm cịn lại Điều đề cập tới nghiên cứu Wang (2018) 1.559 phôi, ĐGR xoang phôi liên quan đáng kể với bất thường NST: ĐGR xoang phôi độ cho kết chuẩn bội 31,2%; độ cho kết chuẩn bội 32,2%; độ cho kết chuẩn bội 48,8% [4] Lá nuôi tế bào (TE) yếu tố để đánh giá hình thái phơi nang Nghiên cứu chúng tơi rằng, phơi với TE bình thường (TE loại A) làm giảm nguy bất thường NST (OR = 0,30; 95%CI = 0,23 - 0,40; p < 0,001) Những phôi có chứa TE loại C có nguy bất thường NST lên đến 5,89 lần (95%CI = 3,61 - 9,62; p < 0,001) Năm 2017, G Majumdar CS xác định tỷ lệ lệch bội tăng chất lượng TE giảm dần Phôi với TE loại A, tỷ lệ lệch bội 26,4%; tỷ lệ TE loại B loại C 49% 56,7% [2] Kết tương tự nghiên cứu < 0,001 Tuy nhiên, với chất lượng nuôi loại C tỷ lệ bất thường chúng tơi cao 79%, khác biệt có ý nghĩa thống kê Sự chênh lệch tỷ lệ xét loại bất thường số lượng cấu trúc G Majumdar xét yếu tố bất thường số lượng Điều tương tự với kết nghiên cứu Zhao CS (2018) đánh giá vai trò độc lập yếu tố ảnh hưởng đến tiên lượng tỷ lệ có thai cho thấy vai trị quan trọng hình thái nuôi Các phôi nang biểu TE loại A, tỷ lệ mang thai sinh sống lâm sàng cao đáng kể so với phơi có TE loại C (62,4% so với 35,7% 49,7% so với 27,4%) [5] Nụ phơi (ICM) phơi có mối liên quan tới bất thường NST Phơi có ICM xếp loại xấu (ICM C) làm tăng rõ rệt nguy bất thường NST (OR = 4,66; 95%CI = 2,77 - 7,84; p < 0,001) Ngược lại, phơi có ICM tốt (ICM A) làm giảm đáng kể nguy bất thường NST (OR = 0,25; 95%CI = 0,19 - 0,33; p < 0,001) Kết tương tự với nghiên cứu Khánh Vy (2016) chứng minh tỷ lệ lệch bội NST tăng chất lượng nụ phôi giảm (p < 0,05) [1] nghiên cứu G Majumdar CS ( 2017), khảo sát 151 phôi nang xác định: tỷ lệ lệch bội tăng chất lượng nụ phôi giảm từ loại A xuống loại C (p < 0,001) [2] 77 T¹p chí y - dợc học quân số 3-2020 Hin nay, nhiều tranh cãi vai trò quan trọng nuôi hay nụ phôi việc xem xét đánh giá lựa chọn phôi để chuyển Năm 2013, De Paepe C CS, nghiên cứu công bố tạp chí Human Reproduction, phần giải thích vai trị quan trọng ni giai đoạn phát triển sớm phôi nang De Paepe C nhận thấy ni cấy độc lập phơi nang có nuôi (đã tách bỏ tế bào nụ phôi), tế bào tiếp tục biệt hóa để hình thành khối tế bào nụ phơi [6] Vai trò TE khẳng định nghiên cứu Honnma H CS (2012) 1.087 chu kỳ chuyển phơi đơng lạnh Honnma H khẳng định lại vai trị quan trọng nuôi nụ phôi xem xét đánh giá lựa chọn phôi để chuyển [7] Nghiên cứu tỷ lệ phơi bình thường nhóm phơi TE tốt tương tự với nhóm phơi ICM tốt (p > 0,05) Mối liên quan hình thái phơi nang với bất thường NST nói chung loại bất thường số lượng, cấu trúc bất thường khảm Bảng 3: Mối liên quan hình thái phơi nang với loại bất thường NST Loại bất thường Bất thường NST chung Số phơi Hình thái (%) Tốt 193 (625 phơi) (30,9%) Trung bình 114 (188 phơi) (60,6%) Xấu 107 (140 phôi) (76,4%) OR Số lượng Số phôi (95%CI) 0,22 c 78 (0,16 0,29) 2,39 (12,5%) c 49 (1,72 3,31) 5,34 (%) (26,1%) c (3,53 8,10) 56 (40,0%) Cấu trúc Khảm OR Số phôi OR Số phôi OR (95%CI) (%) (95%CI) (%) (95%CI) 0,30 c 14 (0,22 0,42) 1,66 (2,2%) a 10 (1,14 2,42) 3,60 (5,3%) c (2,44 5,31) 12 (8,6%) 0,32 b 116 (0,16 0,63) 1,60 b 64 (0,76 3,37) 3,08 (18,6%) (34,0%) b (0,50 6,32) 48 (34,3%) 0,44 c (0,32 0,60) 1,89 c (1,34 2,68) 1,84 c (1,25 2,70) (a: > 0,05; b: = 0,001; c: < 0,001) Theo nghiên cứu chúng tơi, phơi có phân loại hình thái xấu có nguy bất thường NST cao gấp 5,34 lần (95%CI = 3,53 - 8,10), phôi tốt, số 0,22 lần (95%CI = 0,16 - 0,29) Kết cho thấy, việc lựa chọn phôi phân loại tốt ưu tiên cao việc giảm tỷ lệ bất thường NST khơng sàng lọc Trong trường hợp có sàng lọc giảm số lượng phôi cần sàng lọc Khi sâu vào loại bất thường, hình thái phơi xấu làm tăng nguy tất loại bất thường 78 Tạp chí y - dợc học quân số 3-2020 Xét bất thường số lượng NST, tỷ lệ khảm ≤ 50%) có 33 phơi mang kiểu nhân bất thường nhóm phơi tốt (12,5%), tăng bình thường tạo thành em bé khỏe lên nhóm phơi trung bình (26,1%) mạnh [8] Do đó, phơi khảm khơng cao nhóm phơi xấu (40%) Xét bất thiết phải loại trừ, nhiên thường cấu trúc NST, nhìn chung tỷ lệ phơi hồn tồn chuẩn bội loại bất thường cấu trúc NST thấp so ưu tiên chuyển so với phôi với loại lại Cụ thể, tỷ lệ bất khảm Những phụ nữ mang thai sau thường nhóm phơi tốt (2,2%), tăng dần chuyển phơi khảm phải xét nghiệm nhóm phơi trung bình (5,3%) cao trước sinh với tư vấn thích hợp nhóm phơi xấu (8,6%) Tỷ lệ bất thường bác sỹ Khi xem xét đến hình thái khảm nhóm hình thái phơi tốt (18,6%), phơi nang với yếu tố bất thường NST, tăng dần nhóm phơi trung bình (34%) chúng tơi thấy tỷ lệ bất thường NST cao nhóm phơi xấu (34,3%) tăng phơi nang có chất lượng hình Nghiên cứu thái xấu Cụ thể, tỷ lệ bất thường NST rằng, hình thái phơi xấu làm gia tăng nguy thấp (30,9%) phơi có chất lượng tốt so bất thường số lượng, bất thường cấu với 60,6% phơi có chất lượng trung trúc bất thường khảm là: OR = bình 76,4% phơi có chất lượng 3,6 (95%CI = 2,44 - 5,31); OR = 3,08 Điều tương tự nghiên (95%CI = 0,50 - 6,32) OR = 1,84 cứu G Majumdar CS (2017) nhóm (95%CI = 1,25 - 2,70) tác giả xác định tỷ lệ bất thường Trong đó, với hình thái phơi tốt, nguy bất thường NST giảm tất dạng bất thường Phơi có hình thái tốt giảm nguy bất thường số lượng, bất thường cấu trúc bất thường khảm tăng dần từ 40,5 đến 50% 73,2% nhóm phân loại phơi mang hình thái từ tốt tới xấu [2] Mối liên quan hình thái phơi nang với số lượng bất thường NST giảm so với nhóm phơi khơng tốt, Trong phơi có bất thường NST có OR = 0,30 (95%CI = 0,22 - 0,42); OR = thể tồn nhiều dạng bất thường, chúng 0,32 (95%CI = 0,16 - 0,63) OR = 0,44 phân loại 953 phôi nghiên cứu (95%CI = 0,32 - 0,60) làm loại dựa số lượng bất thường P Rubino CS (2018), sử dụng tính phơi Sau tiếp tục xét mối phương pháp NGS nghiên cứu tỷ lệ liên quan hình thái phơi số lượng chuyển phơi 55 phơi khảm (tỷ lệ bất thường NST tính phụi 79 Tạp chí y - dợc học quân sè 3-2020 Bảng 4: Mối liên quan hình thái phôi nang với số lượng bất thường NST Số lượng bất thường phơi Hình thái Tốt Trung bình Xấu Tổng 432 121 58 12 (69,1%) (19,4%) (9,3%) (1,9%) (0,32%) 74 67 40 (39,4%) (35,6%) (21,3%) (3,7%) (0,0%) 33 55 46 (23,6%) (39,3%) (32,9%) (4,3%) (0,0%) 539 243 144 25 (56,6%) (25,5%) (15,1%) (2,6%) (0,2%) Trong nhóm phơi hình thái tốt, số phơi bình thường chiếm đa số với 432 phơi (69,1%); tỷ lệ phơi tốt có bất thường NST 19,4% tỷ lệ phôi bất thường ≥ NST chiếm 11,52% Trong nhóm phơi hình thái trung bình xấu, tỷ lệ phơi bình thường chiếm 39,4% 23,6%, thấp đáng kể so với nhóm phơi hình thái tốt Đồng thời, tỷ lệ bất thường NST nhóm phơi hình thái trung bình xấu cao nhóm phơi hình thái tốt, 35,6% 39,3% Tỷ lệ bất thường ≥ NST nhóm phơi trung bình xấu cao gấp 2,17 3,23 lần so với nhóm phơi tốt Xét tổng số 414 phơi đột biến tỷ lệ mang đột biến NST 58,6%, lại đột biến phức tạp Kết tương tự nghiên cứu Franasiak CS (2014) nghiên cứu 15.169 phôi nang sinh thiết, ghi nhận 6.168 phơi lệch bội, 64% đột biến liên quan đến NST [3] 80 Tổng p 625 188 < 0,001 140 953 KẾT LUẬN Tỷ lệ bất thường NST lớn phôi nang, bất thường khảm (56,68%), bất thường số lượng NST 36,6%, bất thường cấu trúc 6,68% Số phơi bình thường chiếm đa số nhóm phơi phân loại hình thái tốt (69,1%) Tỷ lệ mang 1, 2, bất thường tăng dần nhóm phơi trung bình xấu - Nguy bất thường NST giảm ĐGR khoang phôi lớn (độ 5) (OR = 0,32; 95%CI = 0,25 - 0,42; p < 0,001) tăng lên ĐGR thấp (độ 3) (OR = 3,83; 95%CI = 2,30 - 6,37; p < 0,001) - Nguy bất thường NST tăng lên hình thái ni xấu (OR = 5,89; 95%CI = 3,61 - 9,62; p < 0,001) - Nguy bất thường NST tăng hình thái nụ phơi có chiều hướng xấu (OR = 4,66 lần; 95%CI = 2,77 - 7,84; p < 0,001) - Với hình thái phơi ngày thứ xếp loại tốt, nguy bất thường NST giảm (OR = 0,22; 95%CI = 0,16 - 0,29; p < 0,001) T¹p chÝ y - dợc học quân số 3-2020 TI LIU THAM KHẢO Phan Thị Khánh Vy Nghiên cứu số yếu tố liên quan tới lệch bội NST phôi người trước làm tổ Luận văn Tiến sỹ Y học Đại học Y Hà Nội Hà Nội 2015, tr.121-122 Majumdar G., Majumdar A., Verma I C., Upadhyaya K C Relationship between morphology, euploidy and implantation potential of cleavage and blastocyst stage embryos Journal of Human Reproductive Sciences 2017, 10(1), p.49 Franasiak J M., Forman E J., Hong K H et al The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: A review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening Fertility and Sterility 2014, 101(3), pp.656-663 Wang A., Kort J., Behr B., Westphal L.M Euploidy in relation to blastocyst sex and morphology Journal of Assisted Reproduction and Genetics 2018, 35(9), pp.1565-1572 Zhao Y.Y., Yu Y., Zhang X W Overall blastocyst quality, trophectoderm grade, and inner cell mass grade predict pregnancy outcome in euploid blastocyst transfer cycles Chinese Medical Journal 2018, 131(11), p.1261 De Paepe C., Cauffman G., Verloes A et al Human trophectoderm cells are not yet committed Hum Reprod 2013 28(3), pp.740-749 Honnma H., Baba T., Sasaki M et al Trophectoderm morphology significantly affects the rates of ongoing pregnancy and miscarriage in frozen-thawed single-blastocyst transfer cycle in vitro fertilization Fertil Steril 2012, 98(2), pp.361- 367 Rubino P., Li X., Alonso R.R.D.A., Mazmanian K et al Embryos classified as low-grade mosaic (< 50%) after preimplantation genetic screening (PGS) by means of high resolution next-generation screening (hr-NGS), can have the same competence of producing healthy newborns as euploid embryos Fertility and Sterility 2018, 109(3), e46-e47 81 ... cứu mối liên quan hình thái phơi nang đột biến nhiễm sắc thể phôi thụ tinh ống nghiệm” với mục tiêu: Đánh giá hình thái phơi ngày thụ tinh ống nghiệm Bƣớc đầu xác định mối liên quan hình thái phơi... nhiễm sắc thể - Độ giãn rộng khoang - Đột biến cấu trúc - Lá nuôi - Đột biến khảm - Nụ phôi - Số lƣợng đột biến phơi - Hình thái - Tuổi mẹ với đột biến NST - Đột biến số lƣợng - Tuổi mẹ với hình. .. quan chất lƣợng phôi nuôi cấy ngày đột biến NST 21 1.4 ĐỘT BIẾN NHIỄM SẮC THỂ VÀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ Ở PHƠI 1.4.1 Đột biến NST phôi 1.4.1.1 Đột biến NST Ở ngƣời có 23 cặp NST (22